一種溪黃草及纖花線紋香茶菜的dna鑑別方法

2023-05-26 00:33:16 1

一種溪黃草及纖花線紋香茶菜的dna鑑別方法【專利摘要】本發明提供一種包括唇形科植物溪黃草和線紋香茶菜的rbcL基因序列片段的基因庫。本發明還提供一種鑑別唇形科植物溪黃草和線紋香茶菜植物物種的方法，所述方法包括將待鑑別植物物種的植物樣品的rbcL基因或其序列片段與本發明的基因庫進行比較的步驟。本發明還提供rbcL基因或其序列片段在鑑別唇形科植物線紋香茶菜和唇形科植物溪黃草中的用途。本發明證明了rbcL序列具有通用、易擴增、易比對的特點，並且在唇形科植物線紋香茶菜與唇形科植物溪黃草中，具有良好的擴增性和鑑別效果。【專利說明】一種溪黃草及纖花線紋香茶菜的DNA鑑別方法【
技術領域：
】[0001]本發明屬於植物物種鑑定領域，具體而言，本發明涉及溪黃草、線紋香茶菜的物種鑑別方法。【
背景技術：
】[0002]中藥溪黃草是廣東福建一帶居民傳統用藥，其利溼退黃，用於肝炎、急慢性膽囊炎、痢疾等疾病的治療，並作為涼茶日常保健食用。[0003]在中藥界，部分中藥材的名字與其基原，即植物分類學名字不一致。中藥溪黃草就存在著這種狀況，民間傳統使用的中藥溪黃草是唇形科植物線紋香茶菜[拉丁名為Rabdosialophanthoides(Buch.-Ham.exD.Don)H.Hara或Isodonstriatus(Benth.)Kudo]及其變種纖花香茶菜[拉丁名為Rabdosialophanthoides(Buch.-Ham.exD.Don)H.Haravar.gracilifIora(Benth.)Η.Hara或lsodonlophanthoides(Buch.-Ham.exD.Don)H.Haravar.graciliflora(Benth.)H.Hara];同時，由於沒有相關標準規範，在藥材市場上有唇形科植物溪黃草[拉丁名為lsodonserra(Maxim.)Kudo或Rabdosiaserra(Maxim.)H.Hara]混同使用；另外，相關學術專著及地方標準專著中收錄的溪黃草的基原不一致，關於基原的確定及品種的鑑別都有矛盾之處：《常用中草藥手冊》、《廣東中獸醫常用草藥》、《全國中草藥彙編》（上冊）、《中藥大辭典》及廣東、廣西、湖南等地方的中藥材標準，均記載為溪黃草的基原是線紋香茶菜lsodonlophanthoides(Buch.-Ham.exD.Don)Hara)，其中《廣東省中藥材標準》第二冊同時將植物溪黃草Rabdosiaserra(Maxim.)H.Hara作為基原之一收錄進去，但是在植物鑑別中，溪黃草Rabdosiaserra(Maxim.)H.Hara的一些生藥特徵不符合標準（本專利申請下文中所述"溪黃草"均指的是唇形科植物溪黃草[拉丁名為lsodonserra(Maxim.)Kudo或Rabdosiaserra(Maxim.)H.Hara]，而不是中藥溪黃草）。[0004]植物溪黃草與線紋香茶菜為雙子葉植物唇形科下的兩個種，新鮮的植株上兩者的莖、葉等形態外觀上差異大，但經乾燥或切段後兩者不易分辨。在市場流通的中藥材通常為幹品。有效的鑑別方法既能區別植物溪黃草與線紋香茶菜，又能在基原的確立研究中提供部分技術手段。[0005]目前針對這兩種植物及飲片的鑑別方法有性狀鑑定、顯微鑑定和理化鑑定等方法。這些現有技術對操作人員的經驗依賴度高，而傳統鑑定方法的理論基礎建立於分類群的性狀特徵分析，這些性狀特徵是與環境緊密相關的表現型，在鑑別時易受環境因素影響及樣品形態和材料部位的限制，出現誤差。[0006]中藥的品種真偽鑑別直接關係到用藥安全及臨床療效。因此，目前迫切需要提供能夠準確鑑定溪黃草植物物種、從而能夠幫助準確用藥的新方法。[0007]分子生物學鑑定是目前應用DNA分子標記技術來鑑定中藥原植物及其藥材和飲片的新方法。簡而言之，從分子遺傳角度來看，物種的表現型歸根結底應追溯到基因型的差異，即在DNA序列上的差異。因此，對基因組序列差異的比較研究為植物分類和鑑定提供了最本質的依據。[0008]近年來，隨著分子生物學技術的發展，DNA分子標記技術已廣泛用於藥用植物遺傳多樣性、系統學、分類學研究，並逐漸滲透到中草藥的鑑定領域，推動了中草藥鑑定研究的發展。DNA分子作為遺傳信息的載體，信息含量大，在同種內具有高度的遺傳穩定性，且不受外界環境因素和生物發育階段及器官組織差異的影響，因此用DNA分子特徵作為遺傳標記進行中草藥鑑別具有更為準確可靠，非常適用於近緣種、易混淆品種、珍稀品種等的植物鑑定。[0009]目前，用於中草藥鑑定的分子標記技術主要有"限制性片段長度多態性"(RFLP)技術、"隨機擴增多態DNA"（RAPD)技術、"微衛星"（SSR)技術、ISSR標記技術、"擴增片段長度多態性"（AFLP)技術等等，及DNA條形碼技術（DNAbarcoding)。其中，DNA條形碼鑑定是分子鑑定的最新進展，其定義為利用基因組中一段公認標準的、相對較短的DNA片段來對物種進行快速、準確地識別和鑑定分子診斷新技術。其優勢在於，只需一個或少數幾個合適的基因片段即可對整個屬、科的絕大部分物種進行準確的鑑別；鑑別速度更快；重複性和穩定性高；實驗過程簡單化、標準化，更易實現物種鑑別的自動化。DNA條形碼鑑定技術是傳統鑑別方法的有效補充，能夠實現中藥基原鑑定的標準化，有助於緩解傳統鑑定人才缺乏的現狀。[0010]在利用DNA條形碼技術鑑定植物時，DNA條形碼的篩選及確定是重要一環。通常，DNA條形碼篩選有以下標準：（1)標準的短片段；（2)要有足夠的變異可將物種分開來，種間差異比較大，便於進行種與種的區分，種內序列變異儘量小，從而使種間和種內變異有一個明晰的界定；（3)序列兩段相對保守，以方便引物的設計。[0011]因為缺乏通用引物使其成功擴增，植物核基因組的大多數單拷貝基因和它們的內含子首先被排除作為條形碼的候選者。另有研究者提出，核DNA的內部轉錄空間ITS和ITS2則可能成為潛在的DNA條形碼序列。並且，葉綠體基因組的基因及其內含子的研究發現，psbA-trnH的非編碼區和ITS可能作為潛在的DNA條形碼序列用於鑑定多樣性的被子植物物種。還有人提出，matK基因可以作為通用條形碼鑑定有花植物，而matK和psbA-trnH兩者都適用於肉豆蘧科植物。因此，迄今為止，對於適用於植物鑑定的DNA條形碼，目前已先後提出了matK、psbA-trnH、rbcL、rpoCl、rpoB、matK、ITS2等序列，但是沒有一個條形碼能在所有植物科屬種內適用。[0012]已有一些研究者嘗試將DNA分子生物學鑑定方法用於鑑定溪黃草，如利用RAro技術來進行鑑定。RAro技術是第二代分子標記技術，沒有DNA條形碼技術穩定。並且，雖然研究者不斷地完善DNA條形碼技術在植物物種鑑定中的應用，但是由於目前還有報導任何一條DNA條形碼可以適用所有植物的鑑別，因此對具體的植物物種，仍需要進行實驗來尋找到合適的基因序列作為DNA條形碼使用。[0013]基於上述情況，目前如要利用DNA條形碼技術來對唇形科植物線紋香茶菜與唇形科植物溪黃草進行準確鑑定，需要對可能使用的DNA條形碼進行篩選，找到最適合的基因序列作為DNA條形碼。【
發明內容】[0014]本發明的一個目的是提供最適合鑑別溪黃草和線紋香茶菜的DNA條形碼，即特定的DNA序列。[0015]本發明的另一個目的是，通過採集已確定物種的溪黃草、線紋香茶菜（包括變種纖花香茶菜）原產地的多份樣品，建立溪黃草、線紋香茶菜的DNA條形碼基因庫。[0016]本發明的又一個目的是，通過將新的待檢樣品與該DNA條形碼基因庫的基因片段進行比對，建立該未知樣品的鑑別方法。[0017]本發明的再一個目的是，提供該DNA條形碼或基因庫在溪黃草和線紋香茶菜中的用途。[0018]本發明的具體技術方案如下：[0019]一方面,本發明人經過大量實驗,就溪黃草、線紋香茶菜（包括變種纖花香茶菜）的DNA條形碼基因的篩選，從ITS2、matK、psbA_trnH、rbcL4個序列中篩選出最適合溪黃草和線紋香茶菜的鑑別的DNA條形碼，即rbcL基因或rbcL基因的序列片段。[0020]rbcL基因編碼1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶大亞基，位於cpDNA(植物葉綠體基因組）的大單拷貝區，總長約1400bp，是植物分子系統學研究中應用最普遍的基因之一。雖然rbcL基因在不同植物類群中的進化速率有著較大的差異，但總的來說相對保守，為植物較高分類階元的系統發育研究提供了重要的性狀來源。本發明人經過篩選研究發現，相比於其它基因諸如ITS2、matK、psbA-trnH、rbcL序列具有通用、易擴增、易比對的特點。並且，儘管現有文獻顯示rbcL的變異主要存在於種以上水平，物種水平上通常變異不夠大，但本發明人發現，在唇形科植物線紋香茶菜和唇形科植物溪黃草中，rbcL基因有良好的擴增性和鑑別效果，可以作為DNA條形碼而用於鑑別上述植物物種。[0021]因此，本發明在此方面提供rbcL基因或其序列片段在鑑別唇形科植物線紋香茶菜和唇形科植物溪黃草中的用途。其中，所述rbcL基因序列片段優選通過採用下述序列作為引物從待鑑別植物樣品的基因組DNA中擴增得到：SEQIDNO.42和SEQIDNO.43。[0022]另一方面，本發明提供了包括溪黃草和線紋香茶菜的rbcL基因序列片段的基因庫。具體而言，首先採集溪黃草和線紋香茶菜原產地的多份樣品，以植物傳統分類學方法鑑別各自的物種，然後分別提取其基因組DNA，以其基因組DNA為模板，採用特定引物序列、優選SEQIDNO.42和SEQIDNO.43擴增樣品的rbcL基因序列片段，由此建立包括溪黃草和線紋香茶菜的rbcL基因序列片段的基因庫。所述基因庫包括下述序列編號所示的rbcL基因序列片段：SEQIDNO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41。其中，SEQIDNO.1-8為以植物傳統分類學方法鑑定為溪黃草樣品各自的rbcL基因序列片段；SEQIDNO.9-15為以植物傳統分類學方法鑑定為線紋香茶菜樣品各自的rbcL基因序列片段；SEQIDNO.16-41為以植物傳統分類學方法鑑定為線紋香茶菜（變種纖花香茶菜）樣品各自的rbcL基因序列片段。[0023]又一方面，本發明提供了溪黃草和線紋香茶菜植物物種的鑑別方法，所述方法包括將待鑑別植物的rbcL基因或其序列片段與上文所述的基因庫進行比較的步驟。具體而言，所述方法包括下述步驟：[0024]1)提取待鑑別植物的基因組DNA;[0025]2)以步驟1)得到的基因組DNA為模板，擴增rbcL基因或其序列片段；[0026]3)將步驟2)得到的rbcL基因或其序列片段與本發明提供的基因庫進行比較，從而鑑別所述待鑑別植物的物種。[0027]在本發明提供的鑑別方法中，步驟1)中可以採用任何植物基因組DNA提取方法或商業提取試劑盒進行。根據本發明的【具體實施方式】，取待鑑別植物的樣品例如葉片，使用75%乙醇水溶液擦洗表面後晾乾，稱取5mg-2g，經液氮研磨後，用植物基因組DNA提取試劑盒進行提取。[0028]步驟2)中可以採用任何可擴增rbcL基因或其序列片段的條件進行。根據本發明的【具體實施方式】，在擴增待鑑別植物樣品的rbcL基因序列片段時，其引物及擴增條件如下所示：[0029]引物--[0030]SEQIDNO.42(正向）：ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC[0031]SEQIDNO.43(反向）：GTAAAATCAAGTCCACCRCG[0032]反應體系-[0033]ExTaqMix25y1，上、下遊引物各L0μ1，DNA模版3·0μ1，加滅菌蒸餾水至50μ1[0034]反應程序-[0035]95°C，4min;94°C-30s，55°C-lmin，72°C-lmin，35次循環；72°C-IOmin[0036]檢測、測序和結果處理--[0037]採取瓊脂糖凝膠電泳方法檢測PCR產物。電泳後，PCR產物應在相應的DNA條形碼序列長度位置出現一條目的條帶，陰性對照應無條帶。將有PCR擴增條帶的樣品送測序公司進行DNA序列測定，使用DNA測序儀對目的條帶進行雙向測序，PCR擴增引物作為測序引物。測序結果採用序列拼接軟體CodonCodeAlignerV2.06(CodonCodeCo,USA)校對拼接，去除低質量序列及引物區，序列方向應與PCR擴增正向引物方向一致。[0038]在步驟3)中，在將步驟2)得到的rbcL基因或其序列片段與本發明提供的基因庫進行比較時，相似度最高或匹配度最高或遺傳距離最小的對應物種即為待鑑別植物的物種。可以通過將待鑑別植物的序列與基因庫內已有的序列之間進行比對，獲得多個序列間的相似性，得出其物種類別。BLAST分析、距離法、建樹法都是基於序列比對鑑別物種的方法。[0039]根據本發明的【具體實施方式】，將待鑑別樣品的rbcL基因序列片段與此基因庫的基因片段進行兩兩比對，獲得待鑑別植物的序列與基因庫內已有的多個序列之間的多個最小變異值，再跟已計算出的溪黃草和線紋香茶菜的種內最大變異值比較，進行結果判定。如：根據實施例1所述，溪黃草rbcL基因和線紋香茶菜rbcL基因的種內最大變異值分別為"0·2"和"0"，採用序列比對的計算機軟體，如MatGat2.01、MEGA5、VectorNTISuite組件AlignX等，對待鑑別植物的序列與基因庫內的線紋香茶菜的多個序列之間逐個兩兩比對，得到多個序列間最小變異值，這些值等於〇,則對應物種為線紋香茶菜；同樣採用計算機軟體對待鑑別植物的序列與基因庫內的溪黃草的多個序列之間逐個兩兩比對，得到多個序列間最小變異值，這些值等於或低於〇.2,則對應物種為溪黃草。[0040]具體而言，首先，將從待鑑別樣品獲得的rbcL基因序列片段峰圖文件導入CodonCodeAlignerV3.7進行拼接，然後人工檢查拼接效果，包括（1)調整序列正反向(edit一reversecomplement)，（2)去除引物或其他邊界序列（sample-trimvector…），(3)查看剩餘鹼基質量值（qual需要大於等於20)，最後導出一致序列為標準條形碼數據。然後，將此標準條形碼數據與rbcL基因序列片段的基因庫的數據一起導入序列比對軟體(MatGat2.01)，選擇默認計分矩陣（ScoringMatrix:blosum50)進行多重比對（align)，保存計算結果（Similaritytable)，數值保留小數點後一位，根據後續軟體TaxonGap所需格式調整（兩個txt文件，一個是物種名稱目錄，一個為物種DNA序列比對結果，即相似性矩陣）。接下來，利用軟體TaxonGap2.4.1查看鑑別結果。在軟體主界面導入物種名稱目錄（Files-DataFiles一Load)，在Biomarker選項下導入物種DNA序列比對結果(Biomarker一Add一Load一Save)，其他次要參數可參考軟體說明書進行設置。運行軟體後(Run-Execute)獲得結果，在txt文件的適宜圖中，查看待檢樣品序列與溪黃草、線紋香茶菜（包括變種纖花香茶菜）各個樣品序列分別對應的"種間最小變異值"（假設待鑑別樣品是一個新物種），若待檢樣品序列與溪黃草各樣品的序列片段之間的最小變異值（即"種間最小變異值"）等於或小於〇.2,即可判定該待檢物種為溪黃草；若待檢樣品與線紋香茶菜各樣品的序列片段之間的最小變異值（即"種間最小變異值"）為〇,即可判定該待檢物種為線紋香茶菜。[0041]也可以採用諸如下述其它方法，這幾種方法也是通過序列比對、比較匹配度或比較相似性等，確認物種之間的歸屬：[0042]BLAST分析-[0043]來源於未知樣品的DNA條形碼序列（querysequence)與DNA條形碼資料庫（referencelibrary)進行比對，如果在DNA條形碼資料庫中找到完全一樣的序列(referencesequence),那麼未知樣品就是該referencesequence對應的物種；反之未知樣品在資料庫中不存在。可利用下面的方法進一步鑑定，在這種情況下，需要重點關注與未知樣品DNA條形碼序列最相關10個序列的物種，或者比對中出現頻率最商的物種，可以將未知樣品確定為某一科屬。同時該方法也可直接與GenBank資料庫進行比對，以保證利用全球最新的核苷酸數據指導鑑定。[0044]距離法--[0045]計算未知樣品DNA條形碼序列（querysequence)與資料庫中每一個序列（referencesequence)的遺傳距離，未知樣品應為具有最小平均遺傳距離（meandistance)的物種或者具有最小遺傳距離（nearestdistance)的物種。遺傳距離的閾值(threshold)是在"構建藥用植物DNA條形碼鑑定平臺"過程中確定的，理論上對同一個物種，取樣涵蓋了其全部的地理分布（不同居群）和同一居群中的足夠個體，該閾值可以準確反映該物種的遺傳變異大小，也有利於更好地確定未知樣品的物種，但考慮到研究成本，一般認為同一物種取樣最好包括5個居群，每個居群2個個體。[0046]建樹法-[0047]先應用CLUSTAL進行MSA，選用合適的遺傳距離模型（一般用K2P距離模型）計算種內和種間的遺傳距離，應用MEGA或PAUP等軟體構建NJ、UPGMA、MP等系統發育樹，檢驗未知樣品的DNA條形碼序列（querysequence)與資料庫中序列（referencesequence)聚類在一起的物種，根據聚類情況進一步確定物種。[0048]成對序列比對法-[0049]通過以上方法仍不能將未知樣品鑑別到種時，可以將未知樣品與密切相關的10個物種的referencesequence進行成對比對，通過分析鹼基變異位點來鑑別物種，或判斷為新種，或判斷為referencelibrary中尚未收錄的物種。[0050]相比於現有技術，本發明作出了以下貢獻和有益效果：[0051]首先，本發明對溪黃草、線紋香茶菜和纖花香茶菜的基因條形碼進行篩選，從ITS2、matK、psbA-trnH、rbcL4個基因序列中篩選出最適合鑑別溪黃草和線紋香茶菜的DNA條形碼，即rbcL基因或其序列片段。相比於其他基因，rbcL序列具有通用、易擴增、易比對的特點。並且，儘管現有文獻顯示rbcL的變異主要存在於種以上水平，物種水平上通常變異不夠大，本實驗研究發現，在唇形科植物線紋香茶菜與唇形科植物溪黃草中，其有良好的擴增性和鑑別效果。[0052]第二，本發明經過採集溪黃草、線紋香茶菜（包括變種纖花香茶菜）原產地的多份樣品，得到了包括rbcL基因片段的基因庫，從而建立了溪黃草、線紋香茶菜的標準rbcL序列基因庫。[0053]第三，基於上述發現，本發明還建立了新樣品的鑑別方法，包括將新的待鑑別樣品與此基因庫的基因片段進行比對，判斷新樣品的物種。特別是通過計算種內種間變異值；對於基因庫內的溪黃草和線紋香茶菜序列，已經計算出溪黃草和線紋香茶菜各自的種內最大變異值和兩個物種間的種間最小變異值，當新的待鑑別樣品與此基因庫的基因片段進行逐個兩兩比對後，得到多個序列間的最小變異值（即"種間最小變異值"），這些值等於或小於已計算出的某物種的種內最大變異值，可視為與其同一物種。此鑑別方法可以鑑別溪黃草、線紋香茶菜的全草、器官和飲片。相比於溪黃草和線紋香茶菜的現有鑑別方法，本發明的方法具有對於樣品的完整程度要求低，鑑別指標可以量化的優點。【專利附圖】【附圖說明】[0054]以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中：[0055]圖1顯示了本發明提供的DNA條形碼鑑定方法效果圖，其以植物物種為類別，採用TaxonGap法。其中種間最小變異值顯示為深色條；種內最大變異值顯示為淺色條，Rs代表物種溪黃草，Rlvg代表物種纖花香茶菜，Rl代表物種線紋香茶菜。【具體實施方式】[0056]以下參照具體的實施例來說明本發明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅用於說明本發明，其不以任何方式限制本發明的範圍。[0057]下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的藥材原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產品。[0058]實施例IDNA條形碼的篩選和包括rbcL基因序列片段的基因庫的建立[0059]本實施例就溪黃草、線紋香茶菜和線紋香茶菜（變種纖花香茶菜）的DNA條形碼基因的篩選，從ITS2、matK、psbA-trnH、rbcL4個序列中篩選出最適合溪黃草和線紋香茶菜的鑑別的DNA條形碼，即rbcL基因序列片段。此外，本實施例建立了包括溪黃草和線紋香茶菜的rbcL基因序列片段的基因庫。[0060]1儀器、材料與試藥[0061]I.1材料[0062]在7個採樣點（廣東，福建），收集了溪黃草、線紋香茶菜和線紋香茶菜（變種纖花香茶菜）共41份樣品，詳細情況見下表1。下述條形碼篩選實驗以植物葉片為材料。[0063]表1樣品信息表[0064]【權利要求】1.一種包括溪黃草和線紋香茶菜的rbcL基因序列片段的基因庫，所述基因庫包括下述序列編號所示的rbcL基因序列片段：SEQIDNO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41。2.-種鑑別溪黃草和線紋香茶菜植物物種的方法，所述方法包括將待鑑別植物的rbcL基因或其序列片段與根據權利要求1所述的基因庫進行比較的步驟。3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述方法包括下述步驟：1)提取待鑑別植物的基因組DNA;2)以步驟1)得到的基因組DNA為模板，擴增rbcL基因或其序列片段；3)將步驟2)得到的rbcL基因或其序列片段與根據權利要求1所述的基因庫進行比對，從而鑑別所述待鑑別植物的物種。4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述步驟2)中採用下述序列作為引物從所述待鑑別植物的基因組DNA中擴增rbcL基因序列片段：SEQIDNO.42和SEQIDNO.43。5.根據權利要求3或4所述的方法，其特徵在於，所述步驟3)中通過將步驟2)得到的rbcL基因或其序列片段與根據權利要求1所述的基因庫內已有的序列之間進行比對，獲得所述待鑑別植物的序列與基因庫內已有的序列之間的相似性，從而鑑別所述待鑑別植物的物種。6.根據權利要求3至5中任一項所述的方法，其特徵在於，所述步驟3)中在將步驟2)得到的rbcL基因或其序列片段與根據權利要求1所述的基因庫進行比對，相似度最高或匹配度最高或遺傳距離最小的對應物種即為待鑑別植物的物種。7.rbcL基因或其序列片段在鑑別線紋香茶菜和溪黃草中的用途。8.根據權利要求7所述的用途，其特徵在於，所述rbcL基因序列片段為通過採用下述序列作為引物從待鑑別植物的基因組DNA中擴增得到：SEQIDNO.42和SEQIDNO.43。9.根據權利要求1所述的基因庫在鑑別線紋香茶菜和溪黃草中的用途。【文檔編號】C12Q1/68GK104404629SQ201410189583【公開日】2015年3月11日申請日期:2014年5月6日優先權日:2014年5月6日【發明者】張慧曄,馬新業,李楚源,鄧喬華,劉峰申請人:廣州白雲山和記黃埔中藥有限公司