一種製備納米載藥生物微膠囊的方法
2023-05-26 19:14:11 2
專利名稱:一種製備納米載藥生物微膠囊的方法
技術領域：
本發明屬於藥物載體製備技術領域：
，特別涉及一種製備納米載藥生物微膠囊的方法。
二背景技術：
對組織工程而言，現已發現凍幹脫鈣骨的表面為納米結構；對製藥工程而言納米級的藥物載體可以通過透皮吸收將某些刺激性藥物直接帶入體內，做到局部用藥；對生物技術而言，以納米顆粒運載基因更易與細胞外機制發生作用。將無免疫抑制的天然產物製成納米級微膠囊，可以解決組織工程，製藥工程和生物工程面臨的很多問題，對三大工程的發展具有一定的意義。作為無免疫抑制的天然產物，天然多糖由於其優越的性能一直是學界研究的對象，十年來文獻中大量報導了有關天然多糖在生物材料方面的應用，例如Lee等以海藻酸鈉為囊材負載胰島素，Lim等人將微囊化技術與組織細胞移植相結合，製備海藻酸鈉/聚賴氨酸(APA)微膠囊作為免疫隔離工具，這些研究成果較好的解決了組織細胞移植過程中的免疫排斥問題，避免或減少了昂貴的免疫抑制劑的使用，為組織細胞移植治療神經/內分泌系統疾病提供了新思路。但由於製備技術和材料的限制，製備的膠囊無法達到理想效果，往往存在大小不均一或粒徑過大等問題，使該類膠囊在實際應用中受到局限，近幾年對該類膠囊載藥的研究漸漸減少，而轉向其他方面如Risbud等以殼寡糖、明膠製備支架等。
對於傳統材料，製備膠囊的技術包括物理方法、化學方法和物理化學方法，各類方法中乳液法和噴霧乾燥法較為常用，噴霧乾燥法成囊粒徑均一，大小在微米到毫米範圍內可控，但需要特殊的儀器設備較難普及，乳液法雖操作簡單無需特殊設備，但形成的顆粒往往在微米級且影響因素多、大小不均一、成囊條件難以控制。近幾年微乳液法由於體系均一，操作簡便，製備的膠囊粒徑均一等優點被廣泛應用，該方法的使用雖被廣泛報導，但僅局限於無機物和某些化學合成的高分子物質如Catherine等結合納米反應器和微乳聚合兩種技術，對聚苯胺包覆硫酸鋇納米粒子進行研究，發現在微乳體系中兩類物質成囊效果理想大小均一且為納米級。但報導中，微乳液體系和納米反應器所使用的材料往往不具備天然產物的良好生物相容性且會引起免疫系統響應，不是理想的生物材料，無法推廣應用。因此，當前解決製備方法、材料和實際應用之間的矛盾，將是生物材料領域的重大課題，若能以理想的製備方法和理想的材料進行成囊反應將對組織工程，製藥，和生物醫學等領域起到良好的推動作用。
三
發明內容本發明所要解決的技術問題是針對以上傳統工藝中存在製備方法，材料和實際應用之間的矛盾，提出一種製備納米載藥生物微膠囊的方法。
本發明的技術解決方案為一種製備納米載藥生物微膠囊的方法，製備步驟為通過常規方法製備油包水型反相微乳體系；分別對陰、陽離子聚電解質多糖進行降解處理，得到相應的低分子量陰、陽離子聚電解質多糖；向微乳體系中加入經降解處理後的低分子量陰、陽離子聚電解質多糖，通過自組裝反應聚合成囊；將所得的含囊微乳體系固液分離，得到固體微膠囊。
本技術方案提出的以微乳體系為成囊環境，以海藻酸鈉和殼聚糖材料為例，改造後的海藻酸鈉可以在微乳體系中形成納米膠束，在納米反應器中，海藻酸鈉為核與殼寡糖通過正負離子聚合成外表面，該類膠囊在藥物製劑方面的用途很廣，為藥物科學提供了新的劑型。
該類微乳膠囊的合成路線如附圖1所示。從附圖1可以看出微乳膠囊的合成可以分為海藻酸鈉的微乳體系的製備、殼寡糖/海藻酸鈉微乳體系的製備、膠囊在納米反應器中的合成三個步驟。所述的微乳液體系由海藻酸鈉溶液為核形成納米膠束，殼寡糖為殼於外層複合成微球。其中單個納米顆粒粒徑一般在130nm左右。該類膠囊避免了某些複合微球由高分子材料(如聚苯乙烯等)或無機材料(如二氧化矽、碳等)包埋納米顆粒的複雜步驟，且粒徑均勻，分散性好，可通過攪拌速度等條件進一步控制顆粒的大小，膜的厚度等成囊因素。
針對微乳體系可能會在膠囊內殘留表面活性劑和助表面活性劑的問題，本文對膠囊進行了生物相容性評價，通過細胞毒性試驗和全身毒性試驗，研究者發現細胞相對增殖度在七天中從80.30％提高到95.39％，說明材料溶出物對細胞沒有傷害，毒性較小。通過全身急性毒性試驗觀察小鼠，發現小鼠運動飲食均正常，未見腹部刺激症狀，眼瞼下垂，等不良特徵，小鼠各項指標均符合《醫療器械監督管理和評價》2000年6月第一版上所做的詳細規定。實驗結果證實，殼寡糖/海藻酸鈉微膠囊並無急性毒性作用，生物相容性好。
本發明採用的材料價格低廉易獲取，涉及的新技術，路線簡單，技術含量高，且產品載藥量高，緩釋性好，對細胞和生物體無毒，有望取代現階段所使用的傳統材料和製備方法，解決了當前同類材料在膠囊的製備過程中大小不均一，尺寸過大，使用上存在著高洩漏率，低包埋率的問題。
四圖1為製備線路圖；圖2為膠囊結構示意圖；圖3為BSA膠囊緩釋性研究結果曲線 圖4為溶血磷脂酶Al的研究結果曲線圖；圖5為微乳體系中膠囊的TEM照片；圖6為微乳體系中膠囊的TEM照片；圖7為實施例11的照片；圖8為實施例12的照片。
五具體實施方式一、對天然聚電解質多糖如羧甲基纖維素鈉、明膠、透明脂酸鈉、海藻酸鈉、低聚氨基葡萄糖、羥甲基殼聚糖、殼聚糖和殼寡糖進行降解處理，以海藻酸鈉、羥甲基殼聚糖、殼聚糖為例一一說明實施例1以殼聚糖製備低分子量殼聚糖的研究反應在非均相體系中進行，殼聚糖首先分散於去離子水中，然後以質量比1∶1加入雙氧水，於恆溫水浴中進行降解反應，通過調整反應時間來控制產物分子量，具體降解反應的步驟如下根據實驗要求安裝好實驗儀器後，加入稱取的(3.000g)殼聚糖，隨後以質量比25∶1(W∶W)加入去離子水，將殼聚糖充分分散，加熱升溫至75℃到85℃之間，攪拌均勻，使殼聚糖恆溫反應至溶液顏色由無色轉為黃綠，停止反應。濾去不溶性物質，調濾液的pH值至8，過濾，將濾液在旋轉蒸發器上50℃減壓蒸發濃縮至原體積的三分之一左右，用9倍濾液體積的無水乙醇沉澱，90％乙醇洗滌兩次，50℃以內減壓乾燥，最後得到水溶性的低分子量殼聚糖。
實施例2以羥甲基殼聚糖製備低分子量羥甲基殼聚糖進行研究反應在非均相體系中進行，羥甲基殼聚糖首先分散於去離子水中，然後以質量比1∶1加入雙氧水，於恆溫水浴中進行降解反應，通過調整反應時間來控制產物分子量，具體降解反應的步驟如下根據實驗要求安裝好實驗儀器後，加入稱取的(3.000g)羥甲基殼聚糖，隨後以質量比25∶1加入去離子水，將羥甲基殼聚糖充分分散，加熱升溫至75℃到85℃之間，攪拌均勻，使羥甲基殼聚糖恆溫反應至溶液顏色由無色轉為黃綠，停止反應。濾去不溶性物質，調濾液的pH值至8，過濾，將濾液在旋轉蒸發器上50℃減壓蒸發濃縮至原體積的三分之一左右，用9倍濾液體積的無水乙醇沉澱，90％乙醇洗滌兩次，50℃以內減壓乾燥，最後得到水溶性的低分子量羥甲基殼聚糖。
實施例3以海藻酸鈉製備低分子量海藻酸鈉的研究為例在均相體系中進行海藻酸鈉的降解，首先將乾燥過的海藻酸鈉溶於去離子水中，配置成濃度為2％的溶液，平行取三份2％的海藻酸鈉均相溶液10mL，平鋪於18cm2×8cm2的平板上，在紫外儀中降解，自行選取降解模式，紫外光強度為48W，波長為312nm，每平方釐米的照射量為0.120J/cm2。
實施例4以羧甲基纖維素鈉製備低分子量羧甲基纖維素鈉為例在均相體系中進行羧甲基纖維素鈉的降解，首先將乾燥過的羧甲基纖維素鈉溶於去離子水中，配置成濃度為2％的溶液，加熱至100℃，冷卻至室溫後平行取三份2％的羧甲基纖維素鈉均相溶液10mL，平鋪於18cm2×8cm2的平板上，在紫外儀中降解，自行選取降解模式，紫外光強度為48W，波長為312nm，每平方釐米的照射量為0.120J/cm2。
二、微乳體系的設計固定油相(O)的加入量，配製一系列的[表面活性劑(S)/油相(O)]＝1∶3的混合液，其中油相可以為石蠟油，環己烷或辛烷中的一種，表面活性劑可以為TX-100、聚氧乙烯月桂醚、磺基丁二酸二(2-乙基己)酯鈉、聚氧乙烯(20)、山梨醇酐單油酸酯、正丁醇或正戊醇中的一種或幾種，在混合液中滴加聚電解質多糖溶液形成微乳液體系。
實施例5以石蠟油、山梨醇酐單油酸酯、正丁醇和低分子量殼聚糖溶液為例說明將石蠟油分散於山梨醇酐單油酸酯和正丁醇中，高速攪拌(2000轉/秒以上)的過程中分散聚電解質多糖於石蠟油、山梨醇酐單油酸酯、正丁醇中，以山梨醇酐單油酸酯/正丁醇為3∶2(S組分)，石蠟油與S組分混合液的比例為3∶1在2000轉/秒以上高速攪拌的條件下製成混合體系，在攪拌條件下向體系中滴加低分子量殼聚糖溶液，濃度依據常規使用量，滴加量約為上述體系體積的20-30％，繼續攪拌十分鐘以上，形成微乳體系。
實施例6以環己烷、正戊醇和TX-100和低分子量的海藻酸鈉溶液為例說明將正戊醇和TX-100以為3∶2混合(S混合液)，將S混合液與環己烷以1∶3混合，攪拌(500轉/秒以上)分散的過程中滴加低分子量的海藻酸鈉溶液，濃度依據常規使用量，滴加量約為上述體系體積的20-30％，繼續攪拌10分鐘以上，形成微乳體系。
三，微膠囊的製備實施例7結合微乳體系和納米反應器製備膠囊，以海藻酸鈉和殼聚糖為聚電解質多糖，石蠟油、山梨醇酐單油酸酯、正丁醇為油相和表面活性劑為例微膠囊的製備在均相體系中進行，首先將低分子量海藻酸鈉、低分子量殼聚糖粉末分別配製成濃度低於7％溶液，首先將低分子量海藻酸鈉溶液以體積比1∶1分散於乳化劑中製成混合液S』，十五分鐘內迅速加入4倍體積混合液S』的油相，繼續攪拌形成海藻酸鈉水溶液/油相/乳化劑的油包水微乳液體系，以500轉/秒以上攪拌30分鐘以上，30min內向溶液中勻速滴加不少於海藻酸鈉溶液量三分之一的殼聚糖溶液，繼續以同一速度攪拌，十分鐘以上，停止攪拌，將混合體系以大於3000轉/秒的速度離心分離10分鐘以上，取出沉澱以90％的乙醇洗滌，過濾得到微膠囊。如圖2所示，圖5、圖6為微乳體系中膠囊的TEM照片。
該製備方法技術簡單易操作，形成的納米顆粒粒徑分布均勻，顆粒不團聚不粘連易於分離並具有良好的生物相容性是理想的納米顆粒。
實施例8結合微乳體系和納米反應器製備膠囊，以低分子量羧甲基纖維素鈉和低分子量羧甲基殼聚糖為聚電解質多糖，環己烷，正戊醇，TX-100為油相和表面活性劑為例微膠囊的製備在均相體系中進行，首先將低分子量羧甲基纖維素鈉、低分子量羧甲基殼聚糖粉末分別配製成濃度小於7％的溶液，將低分子量羧甲基纖維素鈉溶液以體積比1∶1分散於乳化劑中製成混合液A，十五分鐘內迅速加入4倍體積於混合液A的油相，繼續以500轉/秒以上的轉速攪拌形成低分子量羧甲基纖維素鈉水溶液/油相/乳化劑的油包水微乳液體系，分散30分鐘以上，30分鐘內勻速向溶液中滴加與不少於低分子量羧甲基纖維素鈉溶液三分之一的低分子量羧甲基殼聚糖溶液，繼續以同一速度攪拌，十分鐘以上，停止攪拌，將混合體系將混合體系以大於3000轉/秒的速度離心分離10分鐘以上，取出沉澱以90％的乙醇洗滌，過濾得到微膠囊。
四、反例的研究。不對聚電解質多糖進行技術處理，將沒有降解的殼聚糖或海藻酸鈉直接加入乳化體系，實施例9考察未降解殼聚糖能否製成微乳體系將石蠟油分散於山梨醇酐單油酸酯和正丁醇中，高速攪拌(2000轉/秒以上)的過程中分散殼聚糖於石蠟油、山梨醇酐單油酸酯、正丁醇中，以山梨醇酐單油酸酯/正丁醇為3∶2(S組分)，石蠟油與S組分混合液的比例為3∶1在2000轉/秒以上高速攪拌的條件下製成混合體系，在攪拌條件下向體系中滴加低殼聚糖溶液，濃度依據常規使用量，滴加量約為上述體系體積的20-30％，繼續攪拌十分鐘以上，形成絮狀沉澱，無法形成微乳體系亦無法進行下一步製作微膠囊的工作。
實施例10考察未降解海藻酸鈉能否製成微乳體系將石蠟油分散於山梨醇酐單油酸酯和正丁醇中，高速攪拌(2000轉/秒以上)的過程中分散殼聚糖於石蠟油、山梨醇酐單油酸酯、正丁醇中，以山梨醇酐單油酸酯/正丁醇為3∶2(S組分)，石蠟油與S組分混合液的比例為3∶1在2000轉/秒以上高速攪拌的條件下製成混合體系，在攪拌條件下向體系中滴加低殼聚糖溶液，濃度依據常規使用量，滴加量約為上述體系體積的20-30％，繼續攪拌十分鐘以上，形成絮狀沉澱，無法形成微乳體系亦無法進行下一步製作微膠囊的工作。
實施例11考察相似體系取海藻酸鈉水溶液以1∶10乳化於石蠟油中，充分攪拌使反應體系呈乳狀液，並維持20min。然後緩慢滴加含7％殼聚糖以下的3％Ca-Cl2水溶液。30min後，離心分離(轉速不低於2000轉/秒)，過濾洗滌，用煤油充分洗滌，再用無水乙醇於索氏提取器中抽提除去殘留有機物。烘乾，真空乾燥，待用，由照片顯示膠囊難以達到納米級如圖7所示。
實施例12考察相似體系取海藻酸鈉水溶液以1∶10乳化於石蠟油中，充分攪拌使反應體系呈乳狀液，並維持20min。然後緩慢滴加含7％殼聚糖以下的水溶液。30min後，離心分離(轉速不低於2000轉/秒)，過濾洗滌，用煤油充分洗滌，再用無水乙醇於索氏提取器中抽提除去殘留有機物，真空乾燥。由照片顯示膠囊粘聯現象嚴重如圖8所示。
五、在微乳體系中可製備包埋BSA，BCA等蛋白類或酶類物質的膠囊，並對膠囊進行載藥量和緩釋性能的考察。
實施例11考察微乳體系中製備BSA膠囊的過程以微乳體系製備BSA膠囊將BSA與海藻酸鈉溶液共混製備成0.2-1.0mg/mL的均相體系，製備時注意不能急速攪拌，否則體系中出現大量泡沫影響BSA的活性。將包埋BSA的均相體系分散於正戊醇和TX-100為3∶2的混合乳化劑(S混合液)中使BSA與S混合液的體積比為1∶1製成A混合液，十五分鐘內迅速加入4倍於A混合液的油相，繼續攪拌形成海藻酸鈉/BSA/水溶液(W)/油相/乳化劑的油包水的半透明乳液體系，高速攪拌(1000轉/秒以上)，在30min內向溶液中滴加濃度低於7％的低分子量殼聚糖溶液使其不少於海藻酸鈉的加入量三分之一，繼續以同一轉速攪拌30分鐘以上，停止攪拌，將混合液離心分離(3000轉/秒以上)，取出沉澱以濃度為90％乙醇洗滌，過濾得到微膠囊。
膠囊對BSA載藥量的研究將微膠囊用濃度為4％檸檬酸鈉液化，通過酶標儀測微囊的BSA包封率，通過BSA試劑盒製作標準曲線，測試破囊液中BSA的OD值，推算BSA的含量，並通過下列公式計算微膠囊的包封率
包封率＝(藥物含量/投藥量)×100％經計算知膠囊對BSA的載藥量可達88.4％。
膠囊緩釋性能的研究精密稱取微膠囊適量，以PBS(pH＝7.4)為釋放介質，恆溫(37±0.5)℃，以100r/min的速率振蕩在四十八小時中以遞增趨勢取5mL釋放介質同時補充等量同溫的釋放液，測定溶液吸光度，由藥物濃度繪製累計釋藥率-時間曲線。見圖3實施例12考察微乳體系中製備溶血磷脂酶Al膠囊的過程以微乳體系製備溶血磷脂酶Al膠囊取0.5ml酶液與5ml 3％海藻酸鈉溶液共混製備成均相體系。將包埋溶血酶Al的均相體系分散於乳化劑吐溫中，十五分鐘內迅速加入一定量的油相，使乳化劑和油相的比例為1；3，繼續攪拌形成以海藻酸鈉/溶血磷脂酶Al水溶液為水相同時包含油相和乳化劑的反相W/O清澈透明乳液體系，分散30分鐘以上，在30min內向溶液中緩慢滴加不少於海藻酸鈉溶液三分之一的低分子量殼聚糖溶液，繼續以500轉/秒以上攪拌，反應30分鐘，停止反應，將體系離心分離，取出沉澱以梯度乙醇洗滌，過濾得到微膠囊。
膠囊對溶血磷脂酶A活力的研究以5％的新鮮蛋黃5ml為底物，以10ml 0.05mol/L的Tris-HCl為緩衝溶液，加入5ml 0.01mol/L的去氧膽酸鈉，5ml 25mmol/L的CaCl2，加入實驗所用量的酶液，50℃恆溫振蕩，在10min時間內用0.1 mol/L的NaOH滴定，保持恆定pH值，測定所消耗的NaOH體積。酶活力單位定義為，在上述條件下每分鐘釋放1μmol游離脂肪酸的酶量，為一個酶學單位(μ)。
精密稱取微膠囊適量，以上述方法測定一周內的酶活，繪製酶活半衰期曲線。見圖4五、對膠囊進行生物相容性評價實施例13對膠囊進行小鼠全身急性毒性，細胞毒性試驗小鼠全身毒性試驗本實驗是一種非特異性急性毒性試驗，將實驗材料或材料浸提液通過動物靜脈或腹腔注射到動物體內，觀察其生物學反應以判定材料的急性毒性作用。
選擇未經過任何其他實驗的昆明小白鼠十隻，每隻重約23g-25g，實驗前在同一環境條件下，使用同一飼料培養3日，在此期間體重不減輕，精神、食慾、排洩等無異常現象。以0.9％氯化鈉溶液為陰性對照，考察海藻酸鈉/殼寡糖膠囊浸提液的生物相容性。浸提液製備方法為在製作浸提液前，先用與陰性對照同一批號的滅菌0.9％氯化鈉溶液衝洗3遍，浸提液按照「試樣」「滅菌0.9％氯化鈉溶液」＝0.1(g)∶1(ml)(W/V)浸提，外部條件為恆溫搖床上於37±0.15℃，50r·min-1振搖，浸提時間為48h。
將昆明小鼠分為兩組每組五隻，為兩組小鼠分別注射滅菌0.9％氯化鈉溶液和材料浸提液，注射量為每公斤50mL(50mL/kg)，將兩組昆明小鼠稱重並在同一環境條件下，使用同一飼料培養24h、48h、72h分別稱量小鼠的體重。記錄小鼠有無不良反映。經觀察試驗組中一隻小鼠在四小時有輕微運動能力減退的現象18小時後又恢復正常其他小鼠均沒有出現異常情況。符合《藥典》的相關規則細胞毒性試驗復甦L-929細胞於25mL培養瓶中，0.25％胰酶消化傳代兩到三次，配製成1×104個/mL細胞懸液接種於96孔塑料培養皿內，每孔100uL，除去孔板邊緣的孔，每組每期平行觀察6孔，塑料培養皿置於含5％(V/V)二氧化碳培養箱內培養24h。棄去原培養基，用PBS液洗滌兩次，試驗組分別加入上述樣品浸提液0.1mL於無菌濾紙上，然後連同對照組一併加入100μL/孔新鮮培養液，放入上述的培養環境保持2d。加入20μL/孔的MTT(2mg/mL)液，繼續培養6h拋棄孔內的培養液和樣品，用PBS溶液洗滌孔內殘餘樣品兩到三次，加入150μL/孔的DMSO，震蕩10min，在免疫酶標儀上以490nm波長測定吸光度。根據以下公式計算細胞的相對增殖度(RGR)RGR＝(實驗組平均吸光度/陰性對照組平均吸光度)×100％.
權利要求
1.一種製備納米載藥生物微膠囊的方法，其特徵在於製備步驟為a.通過常規方法製備油包水型反相微乳體系；b.分別對陰、陽離子聚電解質多糖進行降解處理，得到相應的低分子量陰、陽離子聚電解質多糖；c.向步驟a製備的微乳體系中加入經步驟b降解處理後的低分子量陰、陽離子聚電解質多糖，通過自組裝反應聚合成囊；d.將步驟c所得的含囊微乳體系固液分離，得到固體微膠囊。
2.根據權利要求
1所述的一種製備納米載藥生物微膠囊的方法，其特徵在於所述的油包水型反相微乳體系，其中油相可以為石蠟油，環己烷或辛烷中的一種，表面活性劑可以為TX-100、聚氧乙烯月桂醚、磺基丁二酸二(2-乙基己)酯鈉、聚氧乙烯(20)、山梨醇酐單油酸酯、正丁醇或正戊醇中的一種或幾種，將油相混合於表面活性劑中。
3.根據權利要求
1所述的一種製備納米載藥生物微膠囊的方法，其特徵在於所述的陰離子聚電解質多糖為羧甲基纖維素鈉、明膠、透明脂酸鈉或海藻酸鈉中的一種或幾種的混合物；陽離子聚電解質多糖為低聚氨基葡萄糖、殼聚糖、羥甲基殼聚糖或殼寡糖中的一種或幾種混合物。
4.根據權利要求
1所述的一種製備納米載藥生物微膠囊的方法，其特徵在於所述的低分子量陰、陽離子聚電解質多糖為小於未降解前聚電解質多糖分子量三分之二的陰、陽離子聚電解質多糖。
專利摘要
一種製備納米載藥生物微膠囊的方法，製備步驟為通過常規方法製備油包水型反相微乳體系；分別對陰、陽離子聚電解質多糖進行降解處理，得到相應的低分子量陰、陽離子聚電解質多糖；向微乳體系中加入經降解處理後的低分子量陰、陽離子聚電解質多糖，通過自組裝反應聚合成囊；將所得的含囊微乳體系固液分離，得到固體微膠囊。本發明採用的材料價格低廉易獲取，涉及的新技術，路線簡單，技術含量高，且產品載藥量高，緩釋性好，對細胞和生物體無毒，有望取代現階段所使用的傳統材料和製備方法，解決了當前同類材料在膠囊的製備過程中大小不均一，尺寸過大，使用上存在著高洩漏率，低包埋率的問題。
文檔編號A61K47/38GK1994284SQ200610098381
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月14日
發明者王婷, 何農躍, 馮章啟 申請人:東南大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan