一種乳中α-酪蛋白含量的檢測方法

2023-05-26 13:38:51

專利名稱：一種乳中α-酪蛋白含量的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種乳中a-酪蛋白含量的檢測方法，尤其是一種利用毛細管電 泳檢測乳中a-酪蛋白含量的方法，特別是關於毛細管電泳檢測乳中oc-酪蛋白含 量過程中樣品的處理步驟的改進。
背景技術：
酪蛋白製品是乳品工業的主要產品之一，由於其具有優良的功能特性和較 高的營養價值，因此在食品工業和其他工業上都得到了廣泛的應用。酪蛋白具 有較高的營養價值，可添加到其他食品中強化蛋白質。酪蛋白能夠在水中形成 膠體，具有一定的粘度和良好的持水特性，在冰淇淋生產中。添加酪蛋白酸鈉 做穩定劑，具有增強脂肪乳化、保溼和改善粘度等作用。酪蛋白中存在著明顯 的疏水區和親水區，因此具有較好的乳化性和發泡性。近年來，對酪蛋白生理 功能及生物活性的研究日益增多，對酪蛋白採用各種方法改性製備改性產品也 越來越受到關注，因此酪蛋白改性製品的生產必將成為今後食品工業發展的一 大趨勢。因此準確檢測出乳中oi-酪蛋白含量對於乳品加工過程中各種功能及營 養的配比具有非常重要的意義。
(x-酪蛋白大約佔牛乳總酪蛋白含量的45-55%，是酪蛋白膠粒結構中的基 本組成部分，主要有asl-酪蛋白和as2-酪蛋白兩種形態。a-酪蛋白由199個氨 基酸組成，每個分子上結合8個磷酸根離子，結合位點主要集中在肽鏈的第 43—79位置處，在這個部位經酶解可得到磷肽。
目前，國內尚未有oi-酪蛋白含量檢測方法的國家標準和行業標準。相關國 標有DIN-10466 —2001《牛奶和牛奶製品的全部蛋白中乳清蛋白含量的測定》、 DIN-10470-1999C牛奶和牛奶製品的全部蛋白質中乳蛋白含量和酪蛋白含量測 定》、DIN—10472 —1996《牛奶和乳製品總蛋白量中乳蛋白和酪蛋白成分量測 定-電泳法》。
毛細管電泳儀是一類包括電泳、色譜及其交叉內容的液相微分離技術。它能快速精確檢測出牛奶中的摻假成分、抗生素、添加的功能性因子、乳清蛋白、 免疫球蛋白、酶、糖、添加劑和其他小分子的含量。毛細管電泳儀檢測最低濃
度能達到10.5-10.8 mol/L。該方法操作簡便、準確，檢測到出結果時間僅為l-2h 左右。目前，毛細管電泳儀的應用前景非常廣泛。
《毛細管電泳在牛乳中酪蛋白含量測定及摻假檢測方面的應用》(《食品與 發酵工業》，2005年第31巻第1期，張東送、龐廣昌、高法國、張濤、陳慶森、 胡志和)公開了一種毛細管電泳法分離和檢測原料乳中酪蛋白的方法，該方法 離心處理原料乳來分離脂肪，但離心30min的時間較長，容易引起部分蛋白沉 澱或者脂肪殘留。此外，該方法還公開了一種樣品緩衝溶液，然而其對酪蛋白 的分離效果仍不夠理想。
《奶製品中蛋白質測定的毛細管電泳法研究》，(《分析科學學報》，2006 年2月，第22巻第1期，唐萍、田晶、佘振寶、翁前鋒、許國旺)也公開了一 種使用毛細管電泳法檢測奶製品中酪蛋白的定量分析方法。
上述兩種方法均使用了較長的塗層毛細管柱，但較長的毛細管柱分離時間 也較長，塗層毛細管柱的價格相對較高、容易損壞、對使用環境要求苛刻。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種利用毛細管電泳檢測乳中a-酪蛋白 含量的方法，以提高a-酪蛋白的分離效果，縮短檢測時間，降低檢測成本。
本發明要解決的另一個技術問題是提供一種乳中a-酪蛋白含量的檢測方 法，以提供一種改進的樣品處理步驟。
本發明要解決的另一個技術問題是通過採用較短的未塗層毛細管柱，降低 檢測成本，提高檢測速度。
為解決上述技術問題，本發明提供了一種乳中ct-酪蛋白含量的檢測方法， 該方法包括以下步驟將需要檢測的乳樣品與樣品緩衝液進行混合處理，將混 合處理之後的樣品通過毛細管電泳儀進行檢測，所述樣品緩衝液的配製方法 是三甲基氨基甲垸緩衝液加3-嗎啉代丙烷磺酸、乙二胺四乙酸二鈉、尿素， 處理樣品時再添加(3-巰基乙醇，甲基羥乙基纖維素。
優選的，樣品緩衝液的配製方法為160mmol/L三甲基氨基甲垸緩衝液加 40mmol/L3-嗎啉代丙烷磺酸、60mmol/L乙二胺四乙酸二鈉、7mol/L尿素，處 理樣品時再添加5ul/ml的(3-巰基乙醇，甲基羥乙基纖維素0.05%，調節pH值
至8.5。
優選的，在所述乳樣品與所述樣品緩衝液混合前，對乳樣品進行離心處理， 離心的條件為2000-6000r/min、離心5-15min，優選4500r/min、 10min。離心 的目的是去除脂肪，避免脂肪顆粒對分離峰值和分離時間的影響。
優選的，在通過所述毛細管電泳儀對所述混合處理之後的樣品進行檢測 前，將所述混合處理之後的樣品以超聲波清洗l-10min。超聲波清洗可防止緩 衝液中有氣體，緩衝液中含有氣體將影響電流，使其忽高忽低，影響檢測結果。
優選地，所述檢測方法進一步包括如下步驟l)將ot-酪蛋白溶於所述樣品 緩衝液中，製備得到多個不同含量a-酪蛋白的標準溶液，並對所述多個標準溶 液通過所述毛細管電泳儀分別檢測得到ot-酪蛋白含量與檢測結果之間的標準 曲線；2)將通過所述毛細管電泳儀檢測獲得的所述乳樣品的檢測結果與所述 標準曲線比對，得到所述乳樣品中a-酪蛋白的含量。
上述步驟l)中，在所述樣品緩衝液中溶解(x-酪蛋白標準物質，配製成 4mg/ml、 2mg/ml、 lmg/ml、 0.5mg/ml、 0.25mg/ml的標準溶液。
所述乳樣品的上清液或所述(x-酪蛋白標準物質與所述樣品緩衝液使用漩 渦混合器搖勻。該儀器能混合樣品比較均勻，同時對樣品不會產生任何破壞作 用。
上述毛細管電泳儀檢測參數如下檢測溫度15-40°C，毛細管柱直徑 25-75pm、長度20-600 mm， 二極體陣列檢測器或紫外光檢測器，壓力進樣或 電動進樣，壓力為0-lpsi，進樣時間ls-20s，檢測溫度為15-40°C，工作電壓 7-30 kV;優選參數為檢測溫度為3(TC，毛細管柱直徑25-75pim、長度20mm， 壓力進樣，壓力為0.5psi，進樣時間5s-20s，工作電壓15-"kV。
上述毛細管柱可使用塗層石英毛細管柱也可以使用未塗層的石英毛細管柱。
優選的，使用塗層石英毛細管柱時，上述電泳工作電壓為20kV，使用未 塗層石英毛細管柱時，電泳工作電壓為25kV。
優選的，上述毛細管電泳檢測時電泳模式為區帶電泳或凝膠電泳，其電泳 緩衝液為無機鹽緩衝液，pH2.0-9.0，優選磷酸鹽、硼酸或檸檬酸緩衝液。
上述的檢測結果為樣品分離的圖譜，運用毛細管電泳儀所帶的分析軟體, 積分各峰的峰高或峰面積，與標準曲線比對，計算出樣品濃度，再乘稀釋倍數， 即得實際濃度。本發明所提供的檢測方法與現有的方法相比具有以下優點
1. 樣品離心時間短，不會引起部分蛋白沉澱或者脂肪殘留，其離心分離效 果較好；
2. 樣品緩衝液能有效防止蛋白質吸附於毛細管管壁上，能準確反映出蛋白 質實際含量；同時能使各種蛋白保持獨立狀態，去除相互幹擾和聚集，與現有 技術相比，明顯提高蛋白質分離效果。更具體的說與現有技術相比，其尿素 含量的提高提高了吸光度值，分離效果好，分離吸光度值增加了50%左右；(3-巰基乙醇作為電荷表面活性劑，使分離效果明顯提高；使用甲基羥乙基纖維素
作為動態網絡形成劑其分離效果比使用甲基羥乙基纖維素更佳。
3. 本發明的方法可以使用塗層石英毛細管柱也可以使用未塗層的石英毛細 管柱，使用未塗層石英毛細管柱價格低廉、堅韌耐用，對使用環境要求底，可 以降低檢測成本。
4. 本發明的方法可以使用較短的石英毛細管柱，其分離速度較快。
5. 本發明的方法線性回歸方程相關係數〉0.98，其線性範圍在 0.01mg/ml-2mg/ml，最低檢出限為0.15ng，最低檢出濃度為0.005mg/ml，精確 度達90%以上，標準樣品回收率達到90%以上，樣品回收率達70%以上，能有 效檢測出樣品中的(x-酪蛋白的含量。


圖1是本發明一個實施例中的a-酪蛋白標準曲線； 圖2是本發明一個實施例中的a-酪蛋白檢測分離圖譜； 圖3是本發明的另一實施例中的a-酪蛋白標準標準曲線； 圖4是本發明的另一實施例中的a-酪蛋白檢測分離圖譜； 圖5是本發明的又一實施例中的a-酪蛋白檢測分離圖譜； 圖6是本發明的又一實施例中的(x-酪蛋白檢測分離圖譜-， 圖7是不同離心轉速下酪蛋白檢測分離圖譜； 圖8是不同尿素濃度下酪蛋白檢測分離圖譜；
圖9是分別使用e-巰基乙醇和DL-二硫蘇糖醇作為電荷表面活性劑的酪 蛋白檢測分離圖譜；
圖10是使用羥丙基甲基纖維素和甲基羥乙基纖維素的酪蛋白檢測分離圖
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具體實施例方式
下面將結合具體實施方案對本發明的方法做更詳細的說明。本領域技術人 員應當理解，下述實施例均用於對本發明所要求保護的範圍進行實例性的描 述，以此概括本發明的各參數的相對範圍，因而不能將之理解為對本發明的一 種具體限制。
實施例l檢測牛乳中ot-酪蛋白含量(使用塗層石英毛細管柱)
1. 樣品緩衝液的配製160 mmol/L三甲基氨基甲烷緩衝液中加40 mmol/L 3-嗎啉代丙垸磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，7mol/L尿素，處理樣品時 添加5ul/ml的p-巰基乙醇，甲基羥乙基纖維素0.05%，使用0.1M氫氧化鈉溶 液把pH值調至8.5。
2. 電泳緩衝液的配製0.32mol/L檸檬酸，20 mmol/L檸檬酸三鈉，7 mol/L 尿素，羥丙基甲基纖維素0.05%。
3. 高壓毛細管電泳儀(美國貝克曼庫爾特公司P/ACE MDQ毛細管電泳儀)， 檢測參數檢測溫度控制在3(TC，使用直徑為50pm、長度為20mm的塗層石 英毛細管柱，二極體陣列檢測器(DAD檢測器)，壓力進樣，進樣壓力為0.5psi， 進樣時間為5s，工作電壓為20kV。
4. 標準曲線的制定將(X-酪蛋白標準品溶於樣品緩衝液中，配製成濃度分 別為4mg/ml、 2mg/ml、 lmg/ml、 0.5mg/ml、 0.25mg/ml的標準溶液。使用漩渦 混合器搖勻，精確提取40ul處理後的標準溶液加入樣品管中，之後使用前述 高壓毛細管電泳儀測定。利用毛細管電泳儀自帶軟體32KamtTM8.0獲得的圖譜 各峰積分後的峰面積分別為2851350、 1398500、 740061、 368065、 150017，利 用高壓毛細管電泳儀自帶32KamtTM8.0軟體得出標準曲線如圖1所示(圖中的 橫坐標代表採樣值，單位為AU;縱坐標代表擬合值，單位ml/L)，其線性回 歸相關係數為0.9995，最低檢出限為O.Olug，最低檢出含量為0.25mg/ml，標 準樣品回收率達91%。分離前，把電泳緩衝液加入到儀器所特有的容量瓶中， 待檢測。
5. 樣品處理和檢測取牛乳樣品加入15ml的離心管中，在4500r/min離心 條件下離心10min。準確提取離心處理之後的牛乳樣品上清液100ul置入凍存 管(或其他容器)。提取900ul樣品緩衝液加入凍存管(或其他容器)，並使用
漩渦混合器混勻。精確提取40ul處理後的樣品加入樣品管中，放置於超聲波
清洗機3min，之後使用高壓毛細管電泳儀測定。
6.樣品定量讀數儀器檢測後得到樣品分離的圖譜，如圖2所示(圖中的 橫坐標代表分離時間，單位為min;縱坐標代表吸光值，單位AU)，利用高壓 毛細管電泳儀所自帶的32KaratTM8.0軟體，得到a-酪蛋白的峰面積為1036081， 利用毛細管電泳儀自帶32KaratTM8.0軟體自動套入上述圖1所示標準曲線方程 內計算出試樣濃度為1.4mg/ml，再乘稀釋倍數10，即得實際濃度為14mg/ml， 所以該奶樣含有的a-酪蛋白濃度為14g/L。
實施例2檢測牛乳中ot-酪蛋白含量(使用未塗層石英毛細管柱)
1. 樣品緩衝液的配製160mmol/L三甲基氨基甲垸緩衝液中加40mmol/L 3-嗎啉代丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，7 mol/L尿素,處理樣品時添 加5ul/ml的P-巰基乙醇，甲基羥乙基纖維素0.05%。使用0.1M氫氧化鈉調至 pH值為8.5。
2. 電泳緩衝液的配製0.32 mol/L檸檬酸，20 mmol/L檸檬酸三鈉，7 mol/L 尿素，羥丙基甲基纖維素0.05%。
3. 毛細管電泳儀(美國貝克曼庫爾特公司P/ACEMDQ毛細管電泳儀)，檢 測參數檢測溫度控制在3(TC，使用直徑為75pm、長度為600 mm的未塗層 石英毛細管柱，DAD檢測器，壓力進樣，進樣壓力為0.5psi，進樣時間為5s， 工作電壓為25kV。
4. 校準曲線的制定將ot-酪蛋白標準品溶於樣品緩衝液中，配製成濃度分 別為4mg/ml、 2mg/ml、 lmg/ml、 0.5mg/ml、 0.25mg/ml的標準溶液。使用漩渦 混合器搖勻，精確提取40ul處理後的標準溶液加入樣品管中，使用高壓毛細 管電泳儀測定。檢測得到的圖譜各峰積分後的峰面積分別為，2951350、 1487620、 751200、 369034、 140010，利用32KaratTM8.0分析軟體得出標準曲 線如圖3所示，其線性回歸相關係數為0.9996，最低檢出線為O.Olug，最低檢 出含量為0.25mg/ml，標準樣品回收率達90%。分離前，把電泳緩衝液加入到 儀器所特有的容量瓶中，待檢測。圖中的橫坐標代表採樣值，單位為AU;縱 坐標代表擬合值，單位ml/L。
5. 樣品處理和檢測取牛乳樣品加入15ml的離心管中，在4500r/min離
心條件下離心5min。準確提取離心處理之後的牛乳樣品上清液100ul置入凍存 管(或其他容器)。提取900ul樣品緩衝液加入凍存管(或其他容器)，並使用 漩渦混合器混勻。精確提取40ul處理樣品加入樣品管中，放置於超聲波清洗 機3min，之後使用毛細管電泳儀測定。
6.樣品定量讀數儀器檢測後得到樣品分離的圖譜，如圖4所示，運用毛 細管電泳儀所帶的分析軟體，積分a-酪蛋白的峰面積為1124510，利用分析軟 件自動套入上述圖3所示標準曲線方程內計算出試樣濃度為1.49mg/ml，再乘 稀釋倍數IO，即得實際濃度為14.9mg/ml，所以該奶樣含有的a-酪蛋白濃度為 14.9g/L。
實施例3 —種巴氏滅菌乳中ot-酪蛋白含量的檢測方法
使用與實施例1相同的樣品緩衝液、電泳緩衝液、以及高壓毛細管電泳儀， 使用與實施例1相同的儀器檢測參數。採用實施例1得到的標準曲線。
樣品處理和檢測步驟為把巴氏滅菌乳樣品加入15ml的離心管中，在 4500r/min離心條件下離心10min。準確提取離心處理之後的巴氏滅菌乳樣品上 清液100ul置入凍存管(或其他容器)。提取300ul樣品緩衝液加入凍存管(或 其他容器)，並使用漩渦混合器混勻。精確提取40ul處理樣品加入樣品管中， 放置於超聲波清洗機3min，之後使用毛細管電泳儀測定。
樣品定量讀數儀器檢測後得到樣品分離的圖譜，如圖5所示，運用毛細 管電泳儀所帶的分析軟體，積分oi-酪蛋白的峰面積為192993，利用分析軟體 自動套入圖1所示標準曲線方程內計算出試樣濃度為2.76mg/ml,再乘稀釋倍 數5，即得實際濃度為13.8mg/ml，所以該樣品含有的a-酪蛋白濃度為13.8g/L。
實施例4 一種UHT滅菌乳中a-酪蛋白含量的檢測方法
使用與實施例1相同的樣品緩衝液、電泳緩衝液、以及高壓毛細管電泳儀， 使用與實施例相同的儀器檢測參數。採用實施例1得到的標準曲線。
樣品處理和檢測步驟為把UHT滅菌乳樣品加入15ml的離心管中，在 4500r/min離心條件下離心10min。準確提取離心處理之後的UHT滅菌乳樣品 上清液50ul置入凍存管(或其他容器)。提取950ul樣品緩衝液加入凍存管(或 其他容器)，並使用漩渦混合器混勻。精確提取40ul處理樣品加入樣品管中，
放置於超聲波清洗機3min，之後使用毛細管電泳儀測定。
樣品定量讀數儀器檢測後得到樣品分離的圖譜，如圖6所示，運用毛細 管電泳儀所帶的分析軟體，積分(x-酪蛋白的峰面積為574181，利用分析軟體 自動套入圖1所示標準曲線方程內計算出試樣濃度為0.78mg/ml，再乘稀釋倍 數20，即得實際濃度為15.6mg/ml，所以該樣品含有的a-酪蛋白濃度為15.6g/L。
實施例5 —種原料乳中a-酪蛋白含量的檢測方法
樣品緩衝液、電泳緩衝液以及指定標準曲線的方法與實施例l相同。高壓 毛細管電泳儀(美國貝克曼庫爾特公司P/ACEMDQ毛細管電泳儀)，檢測參數 檢測溫度控制在15°C，使用直徑為25|im、長度為60 mm的未塗層石英毛細管 柱，紫外光檢測器，電動進樣，進樣壓力為Opsi，進樣時間為20s，工作電壓 為7kV。
檢測得到標準曲線，其線性回歸相關係數為0.9996，最低檢出限為O.Olug， 最低檢出含量為0.15mg/ml，標準樣品回收率達90%，樣品回收率70%。
樣品處理和檢測取原料乳樣品加入15ml的離心管中，在2000r/min離心 條件下離心15min。準確提取離心處理之後的原料乳樣品上清液40ul置入凍存 管(或其他容器)。提取800ul樣品緩衝液加入凍存管(或其他容器)，並使用 漩渦混合器混勻。精確提取40ul處理樣品加入樣品管中，放置於超聲波清洗 機lmin，之後使用毛細管電泳儀測定。
樣品定量讀數儀器檢測後得到樣品分離的圖譜，運用毛細管電泳儀所帶 的分析軟體，積分a-酪蛋白的峰面積為1134560，利用分析軟體自動套入標準 曲線方程內計算出試樣濃度為1.69mg/ml，再乘稀釋倍數21，即得實際濃度為 35.49mg/ml，所以該奶樣含有的a-酪蛋白濃度為35.49g/L。
實施例6—種原料乳中a-酪蛋白含量的檢測方法
樣品緩衝液、電泳緩衝液以及指定標準曲線的方法與實施例1相同。高壓 毛細管電泳儀(美菌貝克曼庫爾特公司P/ACEMDQ毛細管電泳儀)，檢測參數: 檢測溫度控制在15°C，使用直徑為50pm、長度為60 mm的未塗層石英毛細管 柱，紫外光檢測器，壓力進樣，進樣壓力為lpsi，進樣時間為ls，工作電壓為 30kV。檢測得到標準曲線，其線性回歸相關係數為0.9991，最低檢出限為0.01ug， 最低檢出含量為0.15mg/ml，標準樣品回收率達92。/。，樣品回收率90%。
樣品處理和檢測取原料乳樣品加入15ml的離心管中，在6000r/min離心 條件下離心5min。準確提取離心處理之後的原料乳樣品上清液100ul置入凍存 管(或其他容器)。提取900ul樣品緩衝液加入凍存管(或其他容器)，並使用 漩渦混合器混勻。精確提取40ul處理樣品加入樣品管中，放置於超聲波清洗 機10min，之後使用毛細管電泳儀測定。
樣品定量讀數儀器檢測後得到樣品分離的圖譜，運用毛細管電泳儀所帶 的分析軟體，積分cx-酪蛋白的峰面積為11563020，利用分析軟體自動套入標 準曲線方程內計算出試樣濃度為1.32mg/ml，再乘稀釋倍數10，即得實際濃度 為13.20mg/ml，所以該奶樣含有的a-酪蛋白濃度為13.20g/L。
實施例7對比實施例
1. 不同離心轉速下分離效果對比
按照實施例1的方法進行試驗，調整離心轉速，結果如圖7所示a-酪蛋 白分離效果好到差的順序依次為4500 r/min、 4000 r/min和3500 r/min。
2. 不同樣品緩衝液組成時分離效果的對比
1) 不同尿素含量下，分離效果對比，具體實驗歩驟為固定其他成分，分 別使用尿素濃度為7mol/L和6mol/L的樣品緩衝液處理樣品，檢測原奶，得到 a -酪蛋白如圖8所示，尿素含量為7mol/L的吸光值比6mol/L的吸光值要高， 而且整個圖譜清晰、分離效果更好，分離吸光值增加50%左右。
2) 不同電荷表面活性劑的分離效果對比，固定其他成分，分別使用P-巰 基乙醇和DL-二硫蘇糖醇(DTT)，以上兩種物質均為電荷表面活性劑。但是 P-巰基乙醇功效比DTT大六倍，很顯然功能越強分離效果越好。檢測原奶後 得到的圖譜如圖9所示，可見使用(3-巰基乙醇的圖譜明顯比使用DTT的分離 效果好。
3) 使用羥丙基甲基纖維素和甲基羥乙基纖維素的分離效果對比，兩者均 為動態網絡形成劑。分離巴氏殺菌乳，得到的分離圖譜如圖10所示可以看 到，使用羥丙基甲基纖維素比使用了甲基羥乙基纖維素分離效果更佳。
權利要求
1.一種乳中α-酪蛋白含量的檢測方法，包括以下步驟將需要檢測的乳樣品與樣品緩衝液進行混合處理，將混合處理之後的樣品通過毛細管電泳儀進行檢測，其特徵在於，所述樣品緩衝液的配製方法是三甲基氨基甲烷緩衝液加3-嗎啉代丙烷磺酸、乙二胺四乙酸二鈉、尿素，處理樣品時再添加β-巰基乙醇，甲基羥乙基纖維素。
2. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述樣品緩衝液的配製方法是160mmol/L三甲基氨基甲烷緩衝液加40mmol/L3-嗎啉代丙垸磺酸、 60mmol/L乙二胺四乙酸二鈉、7mol/L尿素，處理樣品時再添加5ul/ml的|3-巰基乙醇，甲基羥乙基纖維素0.05%，調節pH值至8.5。
3. 根據權利要求1或2所述的檢測方法，其特徵在於，在所述乳樣品與所述 樣品緩衝液進行混合處理前，將所述乳樣品進行離心處理，離心的條件為 轉速2000-6000r/min、離心5-15min;優選轉速4500r/min、離心時間10min。
4. 根據權利要求3所述的檢測方法，其特徵在於，在通過所述毛細管電泳儀 對所述混合處理之後的樣品進行檢測前，將所述混合處理之後的樣品以超 聲波清洗l-10min。
5. 根據權利要求1-4之一所述的檢測方法，其特徵在於，在所述乳樣品與所 述樣品緩衝液進行混合處理的步驟中，取所述乳樣品或離心後的的上清液 與所述樣品緩衝液進行混合處理，乳樣品的上清液與所述樣品緩衝液的混 合比例為l:(3-20)(v/v)。
6. 根據權利要求5所述的檢測方法，其特徵在於，該方法進一步包括如下步 驟1)將a-酪蛋白溶於所述樣品緩衝液中，製備得到多個不同含量a-酪蛋 白的標準溶液，並對所述多個標準溶液通過所述毛細管電泳儀分別檢測得 到a-酪蛋白含量與檢測結果之間的標準曲線；2)將通過所述毛細管電泳儀 檢測獲得的所述乳樣品的檢測結果與所述標準曲線比對，得到所述乳樣品 中cc-酪蛋白的含量。
7. 根據權利要求6所述的檢測方法，其特徵在於，在所述步驟l)中，在所述 樣品緩衝液中溶解a-酪蛋白標準物質，配製成4mg/ml、 2mg/ml、 lmg/ml、 0.5mg/ml、 0.25mg/ml的標準溶液。
8. 根據權利要求7所述的檢測方法，其特徵在於，所述乳樣品的上清液或所 述a-酪蛋白標準物質與所述樣品緩衝液使用漩渦混合器搖勻。
9. 根據權利要求7或8所述的檢測方法，其特徵在於，所述毛細管電泳儀的 檢測參數為檢測溫度15-40°C，毛細管柱直徑25-75pm、長度20-600 mm， 二極體陣列檢測器或紫外光檢測器，壓力進樣或電動進樣，壓力為0-lpsi， 進樣時間ls-20s，檢測溫度為15-40°C，工作電壓7-30kV;優選參數為 檢測溫度為3(TC，毛細管柱直徑25-75pm、長度20mm，壓力進樣，壓力 為0.5psi，進樣時間5s-20s，工作電壓15-25 kV。
10. 根據權利要求9所述的檢測方法，其特徵在於，所述毛細管柱為塗層石英 毛細管柱，所述工作電壓為20kV;或所述毛細管柱為未塗層石英毛細管柱， 所述工作電壓為25kV。
全文摘要
本發明涉及一種乳中α-酪蛋白含量的檢測方法，包括以下步驟將需要檢測的乳樣品與樣品緩衝液進行混合處理，將混合處理之後的樣品通過毛細管電泳儀進行檢測，所述樣品緩衝液的配製方法是三甲基氨基甲烷緩衝液加3-嗎啉代丙烷磺酸、乙二胺四乙酸二鈉、尿素，處理樣品時再添加β-巰基乙醇，甲基羥乙基纖維素。其中乳樣品處理的步驟包括乳樣品的離心處理，取離心處理後的樣品上清液與樣品緩衝液混合，再經超聲波清洗。本發明的方法分離效果好、速度快，可使用未塗層毛細管柱。本發明的方法線性回歸方程相關係數＞0.98，最低檢出線為0.15ng，最低檢出濃度為0.005mg/ml，精確度達90％以上。
文檔編號G01N27/447GK101339159SQ20081014695
公開日2009年1月7日 申請日期2008年8月28日 優先權日2008年8月28日
發明者劉衛星, 孫國慶, 康小紅, 胡新宇 申請人:內蒙古蒙牛乳業(集團)股份有限公司