一種含中性蛋白酶的小麥日糧酶及其製備方法

2023-05-26 18:24:41

一種含中性蛋白酶的小麥日糧酶及其製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種含中性蛋白酶的小麥日糧酶及其製備方法，屬於酶製劑製備【技術領域】。所述小麥日糧酶以枯草芽孢桿菌培養物、酸性蛋白酶、酸性木聚糖酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、澱粉酶、β-甘露聚糖酶、中草藥提取物、保護劑、激活劑科學復配而成，枯草芽孢桿菌培養物可提高動物機體免疫力、促進免疫器官的發育、促進動物腸道結構和機能的成熟、提高動物日增重和改善飼料轉化率。本發明的小麥日糧酶為畜禽提供了安全消化酶，有效減輕了消化負擔，提高了原料利用率和生長率，保護了環境，同時適量的激活劑可在同等條件下充分發揮酶製劑的效力，節約酶製劑添加量，中草藥提取物科學復配既延長複合酶製劑的保質期，又可提高飼養畜禽的免疫力。
【專利說明】一種含中性蛋白酶的小麥日糧酶及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於酶製劑製備【技術領域】，具體是一種含中性蛋白酶的小麥日糧酶及其製備方法。
【背景技術】
[0002]在飼料中添加酶製劑主要有以下4個理由:1.降解在動物飼料中存在的抗營養因子。這些物質不能被動物內源酶降解，從而幹擾動物的正常代謝，導致動物消化不良，生產性能下降。2.提高澱粉、蛋白質和礦物質的利用率。這些物質或者被富含纖維的細胞壁包圍，或者以某些不能被動物消化的結構形式存在(例如在植物飼料原料中，大量的磷以植酸磷的形式存在。)。3.在原料中降解某些特定的化學鍵。這些化學鍵不能被動物自身的酶所降解，加入外源酶以後可以釋放更多的營養物。4.由於幼齡動物自身消化系統還不成熟，內源酶不足添加外源酶可以提高飼料消化率，防止出現消化不良症狀。除了可以提高日糧的利用率以外，加酶還可以減少飼料原料之間的差異，提高飼料配方的精確性，同時還可以提高動物生長的整齊性，減少管理成本，提高經濟效益。使用酶製劑還可以保護環境。由於飼料的利用率提高了，相應的糞便排放量下降了。在效果比較明顯的情況下，糞便的排放量可以減少20%左右，豬糞中氮的排放下降15%左右，雞糞中氮的排放下降20%。對於植酸磷，可以大幅度減少磷對環境的汙染。
[0003]目前在飼料工業中應用的酶製劑主要有4大類:分別用來降解纖維素、蛋白質、澱粉和植酸。
[0004]纖維降解酶:對於單胃動物來說，消化的最大阻力是不能產生降解纖維的酶，在含有小麥、大麥、燕麥等組分的日糧中，很大一部分纖維是阿拉伯木聚糖和β—葡聚糖。水溶性的纖維能提高小腸內容物的粘度，阻礙養分的吸收，從而降低動物的生長性能。同時這種狀況還和一些由於消化不良引起的疾病有關。如豬的食慾減退、禽的黑趾症和小豬拉稀。由於品種、生長地點和氣候條件等因素的影響，大麥和小麥中纖維含量的變化很大，導致含有這些組分的日糧的營養價值差異很大。纖維降解酶、木聚糖酶和β—葡聚糖可以減少這些差異，提高動物的生長性能和整齊度。同時還可以減少某些消化不良的疾病。
[0005]蛋白降解酶:在動物日糧中蛋白質來自各種詞料原料，它們最終通過降解的氣基酸存積在瘦肉中。在單胃動物日糧中，添加蛋白酶(不同飼料原料蛋白質和品質和可利用性)除了能充分降解大部分儲蛋白質或儲藏蛋白質或為動物可利用的小分子肽外，還能夠通過降解抗營養因素而改善飼料營養價值。存積的效率差異很大。在植物蛋白源，如豆餅粉中存在著一些抗營養因子，如幾鞣質和胰蛋白酶抑制因子，可能會對小腸吸收表面造成損害，影響營養物的吸收。另外，幼齡動物不完善的消化體系使得植物蛋白(如豆餅粉)中的蛋白質不能得到很好的利用。
[0006]澱粉降解酶:許多營養學家認為玉米是飼料原料的「黃金標準」。絕大數營養學家認為玉米不存在消化不良性，消化率超過95%，但是最近Noy和Sklan研究表明(1994年)在理想狀態下，4一 12日齡的肉雞日糧中，澱粉的消化率很少超過85%，添加澱粉酶可以使澱粉在小腸得到更多更快的降解。在仔豬斷奶期，由於營養、環境和免疫系統的變化，體重會下降。在日糧中添加澱粉酶和其他一些酶，可以增加動物內源消化酶分泌，進而改進營養的消化吸收，提高飼料轉化率和動物生長率。
[0007]植酸降解酶:對於所有的動物來說，磷對於骨骼的礦化、免疫、繁殖、生長都是至關重要的。豬和家禽單胃動物只能裡利用植物飼料中30— 40%的磷，其餘60— 70%的植酸磷是無法利用的。在許多情況下，飼料日糧中必須補充無機磷來滿足動物生長的需要。飼料中一半以上的磷隨著糞便排放到環境中，汙染環境。添加植酸酶可以降解植酸，釋放植酸分子中的磷。這樣可以產生2個益處:1.減少了飼料中磷的添加量。2.減少了畜禽糞便對環境的憐汙染。
[0008]顯而易見:作為飼料酶種的四大主角，他們的作用機理和模式在很大程度決定或推動了動物飼料產業對於酶製劑技術的吸收運用。目前在肉雞料中添加酶的產出投入比例超過2:1。相對而言，在養豬業領域，酶製劑的使用情況就比較複雜，顯得不明朗。集約化程度低，涉及環節比較多，酶製劑的使用效果很難進行商業計算。儘管在20世紀50年代已經有了使用酶製劑的設想，但是直到20世紀80年代才開始懂得如何在飼料工業中發揮酶的力量。飼料穀物，如小麥和大麥都含有比較高的單胃動物不能利用的纖維。如果纖維能夠被降解，動物就能更好地利用營養物。在歐洲，大麥比較便宜，禽類營養學家和酶學家投入了大量精力研究了在含有大麥的肉雞日糧中添加β—葡聚糖酶以減少其負面影響的可能性。其結果被證明是成功的，並得到了一個黃金定律:大麥+β—葡聚糖酶=小麥。受到上述成功的鼓舞，小麥是第二個的研究對象。理論假設是:小麥+木聚糖酶=玉米。這一步的研究也獲得了成功。在20世紀90年代中期，酶在飼料工業得到了普遍認可。可以毫不誇張地說:1996年，在歐洲80%的肉雞料(粘性穀物為`能量來源)中含有纖維降解酶。由此強化和加快飼料產業對新技術的應用。從全球範圍來看，大約65%的含有能產生粘性穀物的家禽飼料添加了纖維降解酶。而在豬飼料中的應用比例要低得多，接近10%。其主要原因是市場的結構比較複雜，市場呈多元化，甚至無法測算。從地理分布來看，使用纖維素降解酶的地區主要集中在粘性穀物作為主要能量飼料的產區，例如:歐洲、加拿大、澳大利亞和紐西蘭。另外，在美國、南美和亞太地區，使用情況取決於玉米和小麥之間的比價。從這個意義上講，歐洲是使用降解纖維素酶的核心細分市場。為了獲得全球的認可，飼用酶廠家必須大舉進軍以玉米一豆柏型日糧為主的北美和亞太地區。玉米一豆柏型日糧歷來被看作是「黃金標準」，儘管許多營養學家認為這些原料的變動性要比原來設想的變動性要大得多。現在，越來越多的證據表明這種黃金日糧也可以通過酶而改善其生產性能，儘管這類日糧與粗纖維或粘度相關的問題不嚴重。過去10年在研發玉米-豆柏第一代飼料酶上耗費很多，並於1996年開始成功應用，初期應用結果五花八門，但業界正開始變得越來越明白如何才能得心應手，加酶技術獲得最大經濟回報。據估算，該部分飼料酶市場份額為2千萬美元，實際在使用玉米-豆柏日糧的肉雞飼料只有5%為加酶飼料。1999/2000年一降低粘度和粗纖維為日糧的飼料酶市場價值超過I億美元。目前，植酸酶已經得到了全球的承認和應用。植酸酶的市場份額大約是每年5000萬美元，在全球約有8.0%左右的畜禽飼料添加植酸酶。除了經濟利益的原因外，還有一個因素是減少了糞中植酸磷的含量有利於保護環境。
[0009]綜上所述，小麥日糧酶的應用有著其廣闊的市場空間和巨大的經濟價值，但小麥日糧酶的熱穩定性、安全性、復配全面性及作用效果的充分發揮仍是酶製劑生產廠家和廣大養殖戶共同關注的一個重要問題，製備更安全，更全面，酶作用效果更好的小麥日糧酶是本行業技術人員的共同責任和追求。

【發明內容】

[0010]本發明所解決的技術問題是以含高酶活力、作用條件寬泛、穩定性強的中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌培養物為基礎，併科學復配中草藥提取物、保護劑、激活劑和其它食品級飼料酶，製得的含中性蛋白酶的小麥日糧酶，不但為飼養畜禽提供了安全、全面的消化酶，減輕消化負擔， 提高原料利用率和生長率，有效保護環境，同時適量的激活劑可在同等條件下充分發揮酶製劑的效力，物盡其用，節約酶製劑添加量，中草藥提取物的科學復配既可延長複合酶製劑的保質期，又可提高飼養畜禽的免疫力，從而達到一酶多用的效果。
[0011]為了達到上述目的，本發明採用以下技術方案:
[0012]一種含中性蛋白酶的小麥日糧酶，由以下重量份數的酶製劑組成:
[0013]枯草芽孢桿菌培養物20-30份，酸性蛋白酶20-30份，酸性木聚糖酶20_30份，纖維素酶20-30份，β -葡聚糖酶15-20份，澱粉酶15-20份，β -甘露聚糖酶10-15份，中草藥提取物10-15份，保護劑10-15份，激活劑10-15份。
[0014]所述酸性蛋白酶、酸性木聚糖酶、纖維素酶、葡聚糖酶、澱粉酶、甘露聚糖酶、均為食品級酶製劑；
[0015]所述枯草芽孢桿菌培養物由產強熱穩定性中性蛋白酶的菌株枯草芽孢桿菌1398-2-12經液體深層發酵製備，其成分主要包括中性蛋白酶和枯草芽孢桿菌菌體；
[0016]所述枯草芽孢桿菌培養物的製備方法如下:
[0017]枯草芽孢桿菌1398-2-12經斜面菌種活化和逐級擴大培養(包括一、二、三級種子培養以及一級種子罐培養)獲得液體種子；將液體種子以6%接種量接入發酵罐，培養溫度30-36°C，攪拌速度200-700rpm，通風量(V/V) 1:1-3，培養時間10_15h ;然後以1-2°C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C，恆溫培養15-20h ;繼續以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至
2-5°C，此時，將液體種子以4%接種量追加接入發酵罐，恆溫培養20-30h ;最後以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至10_15°C，恆溫培養15-20h ;繼續以1-2°C /h升溫速率緩慢升溫至30-36°C，恆溫培養15-20h ;發酵液經孔徑10-1000 μ m過濾紙板粗濾，然後於10_20°C循環超濾濃縮去除水分得固形物含量20-40%濃縮液；濃縮液經真空冷凍乾燥、超微粉碎得枯草芽孢桿菌培養物。
[0018]所述斜面培養基組成為:牛肉膏3-10g，氯化鈉5_12g，蛋白腖10_20g，葡萄糖 2-5g, (NH)2S043-5g，K2HP046_8g，CaCl2l_3g，瓊脂 15_20g，中草藥粉劑 5-10g,蒸餾水1000mL, pH 值 7.0-7.2，121°C滅菌 20min ；
[0019]所述中草藥粉劑的製備方法如下:
[0020]以重量份數計，稱取黃芪20-30份；黨參10-18份；柴胡10-15份；黃芩10-15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然後於容器中均勻混合併添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C~90°C保持2~4h，然後降溫至45-60°C，加入混合酶製劑進行酶解，用乳酸調節PH值為5.5-6.8，酶解2-4h，最後添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至60°C~78°C保持3~4h，過濾；濾液真空濃縮後冷凍乾燥獲得中草藥粉劑。[0021]所述混合酶添加量為混合物料總重量的5_10%。
[0022]所述混合酶的重量份數組成為:內β -葡聚糖酶10-20份，外β -葡聚糖酶10-20份，β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普魯蘭酶20-30份，β -澱粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5_10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份。
[0023]所述乙醇和丙醇的質量比例為1:1-1.5。
[0024]所述一、二、三級種子培養基重量組成為:
[0025]酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白腖0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氫二鉀0.8-1.5%，中草藥粉劑1.5-2%，海藻糖1-3%，硫酸鈣0.1%,氯化鎂0.2%,檸檬酸鈉0.1-0.3%，不足部分純淨水補足，pH 值 7.0-7.2，121_123°C滅菌 30_40min。
[0026]所述一級種子罐培養基重量組成為:
[0027]麥芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0.8%，中草藥粉劑1.5-2%,海藻糖1-3%,蛋白腖
0.1-0.5%，玉米漿 0.1-0.5%，磷酸氫二鉀 0.8-1.5%，硫酸鎂 0.05-0.1%，檸檬酸鈉 0.1-0.5%，不足部分純淨水補足，pH值7.0-7.2，121-123°C滅菌30_40min。
[0028]所述種子罐發酵液菌體濃度為7.0x108-8.0xlO8個/ml ；
[0029]所述發酵培養基組成為:麥芽糊精50_150g，玉米粉50_60g，豆餅粉15_25g，中草藥粉劑30-50g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米漿l_5g，硫酸銨l_3g，磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀l_2g，檸檬酸鈉l_5g，消泡劑0.1-lg,純淨水lOOOmL，pH值7.0-7.2，121°C滅菌 20min ；
[0030]所述補料培養基重量組成為:麥芽糊精20-30%，玉米粉10-20%，豆粉15_25%，中草藥粉劑5-10%，不足部分純淨水補足，pH值7.0-7.2，121_123°C滅菌30_40min。
[0031]所述發酵培養基的調配方法為:
[0032]按比例準確稱取原料，將原料中的純淨水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調節PH值7.0-7.2，加入中溫澱粉酶(3u/g玉米粉)與高溫澱粉酶(30u/g玉米粉)，同時邊攪拌邊升溫至70°C保溫15-30min，然後緩慢升溫至90°C保溫15_30min進行液化，最後加入其它原料，攪拌均勻，調初始PH7.0-7.2，121-123°C滅菌30_40min備用。
[0033]所述中草藥提取物的製備方法為:分別將中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然後於容器中均勻混合併添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C~90°C保持2~4h，然後降溫至45-60°C，加入混合酶製劑進行酶解，用乳酸調節pH值為5.5-6.8，酶解2_4h，最後添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至60°C~78°C保持3~4h，過濾；濾液減壓濃縮至固形物含量為20%以上，然後冷凍乾燥獲得中草藥提取物。
[0034]所述中草藥的重量份數組成為:沙棘20-30份，決明子20-30份，枸杞10_15份，山藥10-15份，北沙參5-10份，黃荊子5-10份，玉竹3-5份，薏米3_5份，大麥芽3_5份，桂花
3-5份，黃芪3-5份；
[0035]所述混合酶添加量為混合物料總重量的5-10% ；
[0036]所述混合酶的重量份數組成為:內β -葡聚糖酶10-20份，外β -葡聚糖酶10-20份，β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普魯蘭酶20-30份，β -澱粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5_10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份；[0037]所述保護劑由以下重量份數的原料組成:海藻糖20-30份，NaC120-30份，(NH4)2S0410-15 份，半胱氨酸 10-15 份。
[0038]所述激活劑是由如下質量組份的無機鹽均勻混合而成:氯化鋅30-40份，氯化鈣10-20份，硫酸鈉10-20份，氯化鎂5-10份。
[0039]本發明含中性蛋白酶的小麥日糧酶的製備方法:
[0040]將所述保護劑、中草藥提取物分別超微粉碎，確保粒度小於其它酶製劑，然後與枯草芽孢桿菌培養物、酸性蛋白酶、酸性木聚糖酶、纖維素酶、β_葡聚糖酶、澱粉酶、β_甘露聚糖酶、均勻混合，最後加入激活劑，混合均勻後密封包裝即得成品含中性蛋白酶的小麥日糧酶。
[0041 ] 所述小麥日糧酶適用於飼料加工廠和養殖場自配飼料，使用時應與飼料中的其它原料混合均勻，可事先將本發明與少量飼料混合均勻，再混合到大批飼料中，直接飼喂。建議每噸全價料添加量為:飼料中小麥重量低於30%時，添加100g ;小麥重量超過30%時，添加 120-150g ；
[0042]本發明提供的枯草芽孢桿菌1398-2-12是由實驗室保藏的一株產中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)1398_2經紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯複合誘變篩選獲得。
[0043]本發明提供的產強熱穩定性中性蛋白酶的菌株具體為枯草芽孢桿菌1398-2-12。該菌株已於2013年11月3日保藏於中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為:湖北省武漢市武昌區珞珈山武漢 大學生命科學學院郵編:430072)，保藏號為CCTCC NO:M2013539，分類命名為:枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 1398-2-12。
[0044]所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 1398-2-12菌株特點如下:
[0045]所述菌株在固體平板上菌落顏色為乳白色，表面乾燥不透明，邊緣整齊，為具有運動性的好氧菌。鏡檢為長杆狀，革蘭氏染色呈陽性。該菌可利用檸檬酸鹽，硝酸還原、V-P實驗成陽性。
[0046]本發明提供的枯草芽孢桿菌1398-2-12具有所產中性蛋白酶耐受溫度高、適用pH值範圍寬泛的特點，發酵液粗酶液75°C酶活完全穩定，最適反應溫度70°C，pH值4.5-8.5酶活穩定，最適反應pH值7.2。該菌株最適生長PH值7.0-7.2，最適生長溫度30-36°C，最適產酶溫度32-35 °C。
[0047]按誘變篩選方案，對突變株逐級篩選淘汰，最後對優良菌株經發酵性能測試篩選，得到一株產強熱穩定性中性蛋白酶的菌株枯草芽孢桿菌菌1398-2-12，發酵液中性蛋白酶酶活可達5500-7000U/mL，對酶的熱穩定性進行了分析，將粗酶液分別置於40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C下，每隔 10 分鐘取樣測定酶活。40°C、45°C、50°C、55°C下，60分鐘酶活沒有下降。60°C與65°C下，30分鐘降到原有酶活的95%，60分鐘降到85%。70°C下，30分鐘降到原有酶活的85%，60分鐘降到80%。75°C下，30分鐘降到原有酶活的80%,60分鐘降到70%。
[0048]有益效果:
[0049]1.本發明枯草芽孢桿菌培養物發酵液中含有的中性蛋白酶酶活可達5500-7000U/mL，在40-70°C之間具有較高的酶活，最適反應溫度為70°C;在pH值為4.5-8.5時酶活完全穩定，最適反應pH值為7.2 ;該酶在70°C條件下保存Ih後仍能保持80%以上酶活，75°C條件下保存Ih後保持70%以上酶活。比現有的中性蛋白酶熱穩定性強，酶活力較高，酶作用最適PH值範圍寬泛，儲存穩定性高，更加適合飼養畜禽飼料的添加。
[0050]2.本發明枯草芽孢桿菌培養物中的枯草芽孢桿菌菌體可提高動物機體免疫力、促進免疫器官的發育、促進動物腸道結構和機能的成熟、提高動物日增重和改善飼料轉化率，更加適合飼養畜禽飼料的添加。
[0051]3.本發明含中性蛋白酶的小麥日糧酶中的保護劑採用多糖、無機鹽和胺基酸科學復配，有效減緩了複合酶製劑的回潮；同時可增強複合酶的耐凍、耐熱性能，保持相同的酶活力，其耐熱溫度可提高20-30°C，耐冷凍溫度可降低10-15°C，有效防止了複合酶在運輸、保存和使用過程中酶活力的損失，延長了複合酶的保質期，達到同樣的酶活力，比同類產品保質期可延長2-3年。
[0052]4.本發明含中性蛋白酶的小麥日糧酶添加無機鹽作為激活劑，創造了酶催化作用的最佳條件，充分發揮了複合酶各酶組份的活力，徹底有效的分解了飼料中澱粉、蛋白質、纖維素、植酸等大分子物質，大大減輕了畜禽動物的消化負擔，提高了原料利用率和畜禽的生長率，同時有效防止了畜禽糞便造成的環境汙染，保護了飼養環境。
[0053]5.本發明含中性蛋白酶的小麥日糧酶添加的中草藥提取物既可延長複合酶製劑的保質期，又可提高飼養畜禽的免疫力，有效防止畜禽流行性疾病的發生。[0054]6.本發明含中性蛋白酶的小麥日糧酶中枯草芽孢桿菌培養物、保護劑、激活劑、中草藥提取物與酶製劑的協同作用，使得複合酶的酶活力和效力最大限度的發揮，並相應的提高了飼料的利用率和動物的生長率，增強了動物的食慾和抗病能力，延長了複合酶的保質期和保護了環境。
【具體實施方式】
[0055]下面通過具體的實施方案敘述本發明。除非特別說明，本發明中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發明的範圍，本發明的實質和範圍僅由權利要求書所限定。對於本領域技術人員而言，在不背離本發明實質和範圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬於本發明的保護範圍。
[0056]實施例1
[0057]—種含中性蛋白酶的小麥日糧酶，由以下重量份數的酶製劑組成:
[0058]枯草芽孢桿菌培養物25份，酸性蛋白酶25份，酸性木聚糖酶25份，纖維素酶25份，葡聚糖酶17份，澱粉酶17份，β-甘露聚糖酶12份，中草藥提取物12份，保護劑13份，激活劑12份。
[0059]所述酸性蛋白酶、酸性木聚糖酶、纖維素酶、葡聚糖酶、澱粉酶、甘露聚糖酶、均為食品級酶製劑；
[0060]所述枯草芽孢桿菌培養物的製備方法包括如下步驟:
[0061](I)將保存完好的枯草芽孢桿菌1398-2-12的斜面菌種接種於斜面培養基，30°C培養24h進行菌種活化，如此活化2次；
[0062]所述斜面培養基組成為:牛肉膏3g，氯化鈉5g，蛋白腖10g，葡萄糖2g，(NH)2S043g,K2HP046g, CaCl2Ig,瓊脂 15g，中草藥粉劑 5g，蒸餾水 lOOOmL, pH 值 7.0,121°C滅菌 20min ；[0063]所述中草藥粉劑的製備方法如下:
[0064]以重量份數計，稱取黃芪20份；黨參10份；柴胡10份；黃芩10份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然後於容器中均勻混合併添加3倍重量的水，控制溫度70°C保持2h，然後降溫至45°C，加入混合物料總重量5%的混合酶製劑進行酶解，用乳酸調節pH值為5.5，酶解2h，最後添加混合物料0.5倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的質量比例為1:1，控制溫度至60°C保持3h，過濾；濾液真空濃縮後冷凍乾燥獲得中草藥粉劑。
[0065]所述混合酶的重量份數組成為:內葡聚糖酶10份，外葡聚糖酶10份，β -葡萄糖苷酶10份，木聚糖酶15份，戊聚糖酶15份，普魯蘭酶20份，β -澱粉酶10份，中性蛋白酶10份,酸性蛋白酶10份,超氧化物歧化酶5份,葡萄糖氧化酶5份,酸性磷酸酶5份。
[0066](2)液體種子擴大培養
[0067]①一級種子培養:將步驟(1)活化後的斜面菌種I環接入500毫升搖瓶中，培養基裝量100毫升，旋轉式搖床180轉/分，培養溫度30°C，培養時間IOh ；
[0068]②二級種子培養:將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養條件與一級種子相同；
[0069]③三級種子培養:將二級種子以10%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，培養基裝量1000毫升，旋轉式搖床100轉/分，培養溫度30°C，培養時間IOh ；
[0070]④一級種子罐培 養:將三級種子以10%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發酵培養基裝量100L，培養溫度30°C，攪拌速度200rpm，通風量(V/V) 1:1,罐壓0.05Mpa,培養時間IOh ；
[0071]所述一級、二級、三級種子培養基重量組成為:
[0072]酵母粉0.3%，葡萄糖1%，蛋白腖0.3%，牛肉膏0.5%，磷酸氫二鉀0.8%，中草藥粉劑
1.5%，海藻糖1%，硫酸鈣0.1%,氯化鎂0.2%,檸檬酸鈉0.1%，不足部分純淨水補足，pH值7.0,121°C滅菌 30min。
[0073]所述一級種子罐培養基重量組成為:
[0074]麥芽糊精5%，酵母粉0.4%，中草藥粉劑1.5%，海藻糖1%，蛋白腖0.1%，玉米漿0.1%，磷酸氫二鉀0.8%，硫酸鎂0.05%,檸檬酸鈉0.1%，不足部分純淨水補足，pH值7.0，121°C 滅菌 30min。
[0075]所述種子罐發酵液菌體濃度為7.0xlO8個/ml ；
[0076](3)發酵罐發酵
[0077]將步驟(2)中一級種子罐發酵液以6%接種量接入發酵罐，培養溫度30°C，攪拌速度200r/m，通風量(V/V)l:l，培養時間IOh ;然後以1°C /h降溫速率緩慢降溫至10°C，恆溫培養15h ;繼續以1°C /h降溫速率緩慢降溫至2°C，此時，將步驟(2)中一級種子罐發酵液以4%接種量追加接入發酵罐，恆溫培養20h ;最後以1°C /h升溫速率緩慢升溫至10°C，恆溫培養15h ;繼續以1°C /h升溫速率緩慢升溫至30°C，恆溫培養15h ；
[0078]溶解氧控制:通過調整攪拌轉速及通風量，控制溶解氧15% ；
[0079]pH控制:通過補氨水或稀磷酸，控制發酵過程中pH值保持在7.0 ；
[0080]補料控制:添加補料培養基，以維持發酵液還原糖含量為2_5mg/ml ；[0081 ] 放罐標準:60-80%菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢。
[0082]所述發酵培養基組成為:麥芽糊精50g，玉米粉50g，豆餅粉15g，中草藥粉劑30g，海藻糖30g，酵母粉4g，玉米漿lg，硫酸銨lg，磷酸氫二鉀lg，磷酸二氫鉀lg，檸檬酸鈉lg，消泡劑 0.1g,純淨水 lOOOmL, pH 值 7.0,121°C滅菌 20min ；
[0083]所述補料培養基重量組成為:麥芽糊精20%，玉米粉10%，豆粉15%，中草藥粉劑5%，不足部分純淨水補足，pH值7.0，121°C滅菌30min。
[0084]所述發酵培養基的調配方法為:
[0085]按比例準確稱取原料，將原料中的純淨水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調節PH值7.0，加入中溫澱粉酶(3u/g玉米粉)與高溫澱粉酶(30u/g玉米粉)，同時邊攪拌邊升溫至70°C保溫15min，然後緩慢升溫至90°C保溫15min進行液化，最後加入其它原料，攪拌均勻，調初始ρΗ7.0,121°C 滅菌30min備用。
[0086](4)發酵液經孔徑10 μ m過濾紙板粗濾，然後於10°C循環超濾濃縮去除水分得固形物含量為20%濃縮液；濃縮液經真空冷凍乾燥、超微粉碎得枯草芽孢桿菌培養物。
[0087]所述中草藥提取物的製備方法為:分別將中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然後於容器中均勻混合併添加5倍重量的水，控制溫度80°C保持3h，然後降溫至53°C，加入混合酶製劑進行酶解，用乳酸調節PH值為6.2，酶解3h，最後添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至69°C保持4h，過濾；濾液減壓濃縮至固形物含量為20%以上，然後冷凍乾燥獲得中草藥提取物。
[0088]所述中草藥的重量份數組成為:沙棘25份，決明子25份，枸杞17份，山藥13份，北沙參8份，黃荊子7份，玉竹4份，薏米4份，大麥芽4份，桂花4份，黃芪4份；
[0089]混合酶添加量為混合物料總重量的5-10% ；
[0090]所述混合酶的重量份數組成為:內β -葡聚糖酶15份，外β -葡聚糖酶15份，β -葡萄糖苷酶13份，木聚糖酶13份，戊聚糖酶13份，普魯蘭酶25份，β -澱粉酶12份，中性蛋白酶13份，酸性蛋白酶13份，超氧化物歧化酶7份，葡萄糖氧化酶7份，酸性磷酸酶7份；
[0091]所述保護劑由以下重量份數的原料組成:海藻糖25份，NaC125份，(NH4) 2S0413份，半胱氨酸12份。
[0092]所述激活劑是由如下質量組份的無機鹽均勻混合而成:氯化鋅35份，氯化鈣15份，硫酸鈉15份，氯化鎂7份。
[0093]含中性蛋白酶的小麥日糧酶的製備方法:
[0094]將所述保護劑、中草藥提取物分別超微粉碎，確保粒度小於其它酶製劑，然後與枯草芽孢桿菌培養物、酸性蛋白酶、酸性木聚糖酶、纖維素酶、β_葡聚糖酶、澱粉酶、β_甘露聚糖酶、均勻混合，最後加入激活劑，混合均勻後密封包裝即得成品含中性蛋白酶的小麥日糧酶。
[0095]實施例2:
[0096]一種含中性蛋白酶的小麥日糧酶，由以下重量份數的酶製劑組成:
[0097]枯草芽孢桿菌培養物20份，酸性蛋白酶20份，酸性木聚糖酶20份，纖維素酶20份，葡聚糖酶15份，澱粉酶15份，β-甘露聚糖酶10份，中草藥提取物10份，保護劑10份，激活劑10份。[0098]所述酸性蛋白酶、酸性木聚糖酶、纖維素酶、β_葡聚糖酶、澱粉酶、甘露聚糖酶均為食品級酶製劑；
[0099]所述枯草芽孢桿菌培養物的製備方法包括如下步驟:
[0100](I)菌種活化
[0101]將保存完好的枯草芽孢桿菌1398-2-12的斜面菌種接種於斜面培養基，33°C培養30h進行菌種活化，如此活化2次；
[0102]所述斜面培養基組成為:牛肉膏6g,氯化鈉8g,蛋白腖15g,葡萄糖4g, (NH)2S044g,K2HP047g, CaCl22g，瓊脂 18g，中草藥粉劑 8g，蒸餾水 lOOOmL, pH 值 7.2，121°C滅菌 20min ；
[0103]所述中草藥粉劑的製備方法如下:
[0104]以重量份數計，稱取黃芪25份；黨參16份；柴胡12份；黃芩12份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然後於容器中均勻混合併添加5倍重量的水，控制溫度80°C保持3h，然後降溫至50°C，加入混合物料總重量8%的混合酶製劑進行酶解，用乳酸調節pH值為6.0,酶解3h，最後添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的質量比例為1:1.2，控制溫度至70°C保持4h，過濾；濾液真空濃縮後冷凍乾燥獲得中草藥粉劑。
[0105]所述混合酶的重量份數組成為:內葡聚糖酶15份，外葡聚糖酶15份，β -葡萄糖苷酶12份，木聚糖酶18份，戊聚糖酶18份，普魯蘭酶25份，β -澱粉酶12份，中性蛋白酶12份，酸性蛋白酶12份，超氧化物歧化酶8份，葡萄糖氧化酶8份，酸性磷酸酶8份。
[0106](2)液體種子擴大培養
[0107]①一級種子培養:將步驟(1)活化後的斜面菌種2環接入500毫升搖瓶中，培養基裝量100毫升，旋轉式搖床180轉/分，培養溫度33°C，培養時間12h ；
[0108]②二級種子培養:將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養條件與一級種子相同；
[0109]③三級種子培養:將二級種子以10%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，培養基裝量1000毫升，旋轉式搖床100轉/分，培養溫度33°C，培養時間12h ；
[0110]④一級種子罐培養:將三級種子以10%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發酵培養基裝量100L，培養溫度33 °C，攪拌速度300rpm，通風量(V/V) 1: 1.5，罐壓
0.05Mpa,培養時間15h ；
[0111]所述一級、二級、三級種子培養基重量組成為:
[0112]酵母粉0.4%，葡萄糖1.2%，蛋白腖0.4%，牛肉膏0.6%，磷酸氫二鉀1.0%，中草藥粉劑1.8%，海藻糖2%，硫酸鈣0.1%,氯化鎂0.2%,檸檬酸鈉0.2%，不足部分純淨水補足，pH值7.2，121°C 滅菌 30min。
[0113]所述一級種子罐培養基重量組成為:
[0114]麥芽糊精10%，酵母粉0.5%，中草藥粉劑1.8%，海藻糖2%，蛋白腖0.2%，玉米漿
0.3%，磷酸氫二鉀1.0%，硫酸鎂0.08%,檸檬酸鈉0.3%，不足部分純淨水補足，pH值7.2，121°C 滅菌 30min。
[0115] 所述種子罐發酵液菌體濃度為7.5xl08個/ml ；
[0116](3)發酵罐發酵[0117]將步驟(2)中一級種子罐發酵液以6%接種量接入發酵罐，培養溫度35°C，攪拌速度400r/m，通風量(V/V)l:2，培養時間12h ;然後以2V /h降溫速率緩慢降溫至12°C，恆溫培養18h ;繼續以2V /h降溫速率緩慢降溫至4°C，此時，將步驟(2)中一級種子罐發酵液以4%接種量追加接入發酵罐，恆溫培養25h ;最後以2°C /h升溫速率緩慢升溫至12°C，恆溫培養18h ;繼續以2V /h升溫速率緩慢升溫至33°C，恆溫培養18h ；
[0118]溶解氧控制:通過調整攪拌轉速及通風量，控制溶解氧20% ；
[0119]pH控制:通過補氨水或稀磷酸，控制發酵過程中pH值保持在7.2 ；
[0120]補料控制:添加補料培養基，以維持發酵液還原糖含量為2_5mg/ml ；
[0121]放罐標準:60-80%菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢。
[0122]所述發酵培養基組成為:麥芽糊精100g，玉米粉55g，豆餅粉20g，中草藥粉劑40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米漿3g，硫酸銨2g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鉀2g，檸檬酸鈉3g，消泡劑 0.5g,純淨水 lOOOmL, pH 值 7.2，121°C 滅菌 20min ；
[0123]所述補料培養基重量組成為:麥芽糊精25%，玉米粉15%，豆粉20%，中草藥粉劑8%，不足部分純淨水補足，pH值7.2，121°C滅菌30min。
[0124]所述發酵培養基的調配方法為:
[0125]按比例準確稱取原料，將原料中的純淨水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調節PH值7.2，加入中溫澱粉酶(311/^玉米粉)與高溫澱粉酶(3011/^玉米粉)，同時邊攪拌邊升溫至70°C保溫20min，然後緩慢升 溫至90°C保溫20min進行液化，最後加入其它原料，攪拌均勻，調初始ρΗ7.2，121°C滅菌30min備用。
[0126](4)發酵液經孔徑500 μ m過濾紙板粗濾，然後於15°C循環超濾濃縮去除水分得固形物含量為30%濃縮液；濃縮液經真空冷凍乾燥、超微粉碎得枯草芽孢桿菌培養物。
[0127]所述中草藥提取物的製備方法為:分別將中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然後於容器中均勻混合併添加3倍重量的水，控制溫度70°C保持2h，然後降溫至45°C，加入混合酶製劑進行酶解，用乳酸調節pH值為5.5，酶解2h，最後添加混合物料0.5倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至60°C保持3h，過濾；濾液減壓濃縮至固形物含量為20%以上，然後冷凍乾燥獲得中草藥提取物。
[0128]所述中草藥的重量份數組成為:沙棘20份，決明子20份，枸杞10份，山藥10份，北沙參5份，黃荊子5份，玉竹3份，薏米3份，大麥芽3份，桂花3份，黃芪3份；
[0129]混合酶添加量為混合物料總重量的5% ；
[0130]所述混合酶的重量份數組成為:內葡聚糖酶10份，外β-葡聚糖酶10份，β -葡萄糖苷酶10份，木聚糖酶15份，戊聚糖酶15份，普魯蘭酶20份，β -澱粉酶10份，中性蛋白酶10份,酸性蛋白酶10份，超氧化物歧化酶5份，葡萄糖氧化酶5份，酸性磷酸酶5份；
[0131]所述保護劑由以下重量份數的原料組成:海藻糖20份，NaC120份，(NH4) 2S0410份，半胱氨酸10份。
[0132]所述激活劑是由如下質量組份的無機鹽均勻混合而成:氯化鋅30份，氯化鈣10份，硫酸鈉10份，氯化鎂5份。
[0133]含中性蛋白酶的小麥日糧酶的製備方法如實施例1。
[0134]實施例3:[0135]一種含中性蛋白酶的小麥日糧酶，由以下重量份數的酶製劑組成:
[0136]枯草芽孢桿菌培養物30份，酸性蛋白酶30份，酸性木聚糖酶30份，纖維素酶30份，葡聚糖酶20份，澱粉酶20份，β-甘露聚糖酶15份，中草藥提取物15份，保護劑15份，激活劑15份。
[0137]所述酸性蛋白酶、酸性木聚糖酶、纖維素酶、葡聚糖酶、澱粉酶、甘露聚糖酶、均為食品級酶製劑；
[0138]所述枯草芽孢桿菌培養物的製備方法包括如下步驟:
[0139](I)菌種活化
[0140]將保存完好的枯草芽孢桿菌1398-2-12的斜面菌種接種於斜面培養基，36°C培養36h進行菌種活化，如此活化3次；
[0141]所述斜面培養基組成為:牛肉膏10g，氯化鈉12g，蛋白腖20g，葡萄糖5g, (NH)2S045g, K2HP048g, CaCl23g，瓊脂 20g,中草藥粉劑 IOg,蒸餾水 lOOOmL, pH 值 7.2，121°C 滅菌 20min ；
[0142]所述中草藥粉劑的製備方法如下:
[0143]以重量份數計，稱取黃芪30份；黨參18份；柴胡15份；黃芩15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然後於容器中均勻混合併添加6倍重量的水，控制溫度90°C保持4h，然後降溫至60°C，加 入混合物料總重量10%的混合酶製劑進行酶解，用乳酸調節pH值為6.8，酶解4h，最後添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的質量比例為1:1.5，控制溫度至78°C保持4h，過濾；濾液真空濃縮後冷凍乾燥獲得中草藥粉劑。
[0144]所述混合酶的重量份數組成為:內葡聚糖酶20份，外β-葡聚糖酶20份，β -葡萄糖苷酶15份，木聚糖酶20份，戊聚糖酶20份，普魯蘭酶30份，β -澱粉酶15份，中性蛋白酶15份，酸性蛋白酶15份，超氧化物歧化酶10份，葡萄糖氧化酶10份，酸性磷酸酶10份。
[0145](2)液體種子擴大培養
[0146]①一級種子培養:將步驟(1)活化後的斜面菌種2環接入500毫升搖瓶中，培養基裝量100毫升，旋轉式搖床180轉/分，培養溫度36°C，培養時間15h ；
[0147]②二級種子培養:將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養條件與一級種子相同；
[0148]③三級種子培養:將二級種子以10%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，培養基裝量1000毫升，旋轉式搖床100轉/分，培養溫度36°C，培養時間15h ；
[0149]④一級種子罐培養:將三級種子以10%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發酵培養基裝量100L，培養溫度36°C，攪拌速度400rpm，通風量(V/V) 1:2,罐壓0.05Mpa,培養時間20h ；
[0150]所述一級、二級、三級種子培養基重量組成為:
[0151]酵母粉0.5%，葡萄糖1.5%，蛋白腖0.5%，牛肉膏0.8%，磷酸氫二鉀1.5%，中草藥粉劑2%，海藻糖3%，硫酸鈣0.1%,氯化鎂0.2%,檸檬酸鈉0.3%，不足部分純淨水補足，pH值
7.2，123°C滅菌 40min。
[0152]所述一級種子罐培養基重量組成為:[0153]麥芽糊精15%，酵母0.8%，中草藥粉劑2%，海藻糖3%，蛋白腖0.5%，玉米漿0.5%，磷酸氫二鉀1.5%，硫酸鎂0.1%，檸檬酸鈉0.5%，不足部分純淨水補足，pH值7.2，123°C滅菌40mino
[0154]所述種子罐發酵液菌體濃度為8.0xlO8個/ml ；
[0155](3)發酵罐發酵
[0156]將步驟(2)中一級種子罐發酵液以6%接種量接入發酵罐，培養溫度36°C，攪拌速度700r/m，通風量(V/V)l:3，培養時間15h ;然後以2V /h降溫速率緩慢降溫至15°C，恆溫培養20h ;繼續以2V /h降溫速率緩慢降溫至5°C，此時，將步驟(2)中一級種子罐發酵液以4%接種量追加接入發酵罐，恆溫培養30h ;最後以2°C /h升溫速率緩慢升溫至15°C，恆溫培養20h ;繼續以2V /h升溫速率緩慢升溫至36°C，恆溫培養20h ； [0157]溶解氧控制:通過調整攪拌轉速及通風量，控制溶解氧30% ；
[0158]pH控制:通過補氨水或稀磷酸，控制發酵過程中pH值保持在7.2 ；
[0159]補料控制:添加補料培養基，以維持發酵液還原糖含量為2_5mg/ml ；
[0160]放罐標準:60-80%菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢。
[0161 ] 所述發酵培養基組成為:麥芽糊精150g，玉米粉60g，豆餅粉25g，中草藥粉劑50g，海藻糖40g，酵母粉Sg，玉米漿5g，硫酸銨3g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鉀2g，檸檬酸鈉5g，消泡劑Ig,純淨水lOOOmL, pH值7.2，121°C滅菌20min ；
[0162]所述補料培養基重量組成為:麥芽糊精30%，玉米粉20%，豆粉25%，中草藥粉劑10%,不足部分純淨水補足，pH值7.2，123°C滅菌40min。
[0163]所述發酵培養基的調配方法為:
[0164]按比例準確稱取原料，將原料中的純淨水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調節PH值7.2，加入中溫澱粉酶(311/^玉米粉)與高溫澱粉酶(30u/g玉米粉)，同時邊攪拌邊升溫至70°C保溫30min，然後緩慢升溫至90°C保溫30min進行液化，最後加入其它原料，攪拌均勻，調初始ρΗ7.2，123°C滅菌40min備用。
[0165](4)發酵液經孔徑1000 μ m過濾紙板粗濾，然後於20°C循環超濾濃縮去除水分得固形物含量為40%濃縮液；濃縮液經真空冷凍乾燥、超微粉碎得枯草芽孢桿菌培養物。
[0166]所述中草藥提取物的製備方法為:分別將中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然後於容器中均勻混合併添加6倍重量的水，控制溫度90°C保持4h，然後降溫至60°C，加入混合酶製劑進行酶解，用乳酸調節pH值為6.8，酶解4h，最後添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至78°C保持4h，過濾；濾液減壓濃縮至固形物含量為20%以上，然後冷凍乾燥獲得中草藥提取物。
[0167]所述中草藥的重量份數組成為:沙棘30份，決明子30份，枸杞15份，山藥15份，北沙參10份，黃荊子10份，玉竹5份，薏米5份，大麥芽5份，桂花5份，黃芪5份；
[0168]混合酶添加量為混合物料總重量的10%;
[0169]所述混合酶的重量份數組成為:內葡聚糖酶20份，外β-葡聚糖酶20份，β -葡萄糖苷酶15份，木聚糖酶20份，戊聚糖酶20份，普魯蘭酶30份，β -澱粉酶15份，中性蛋白酶15份，酸性蛋白酶15份，超氧化物歧化酶10份，葡萄糖氧化酶10份，酸性磷酸酶10份；
[0170]所述保護劑由以下重量份數的原料組成:海藻糖30份，NaC130份，(NH4) 2S0415份，半胱氨酸15份。
[0171]所述激活劑是由如下質量組份的無機鹽均勻混合而成:氯化鋅40份，氯化鈣20份，硫酸鈉20份，氯化鎂10份。
[0172]含中性蛋白酶的小麥日糧酶的製備方法如實施例1。
[0173]實施例4本發明實施例1小麥日糧酶的使用效果試驗
[0174]1.飼料種類:全價小麥日糧，其中飼料中小麥重量為40% ；
[0175]2.小麥日糧酶添加量:每噸飼料添加120g ;
[0176]3.小麥日糧酶試驗組設計:小麥日糧酶重量份數組成分為試驗組、對照組1、對照組2 ;其中試驗組為本發明實施例1製備的小麥日糧酶；對照組I為試驗組組份中除了枯草芽孢桿菌培養物的其餘組份；對照組2是市售的小麥日糧酶並且其包含的各酶種類、酶活力和酶重量份數與試驗組和對照組I相同；各試驗組的具體重量份數組成如表1
[0177]表1
[0178]
【權利要求】
1.一種含中性蛋白酶的小麥日糧酶，由以下重量份數的酶製劑組成:枯草芽孢桿菌培養物20-30份，酸性蛋白酶20-30份，酸性木聚糖酶20-30份，纖維素酶20-30份，β -葡聚糖酶15-20份，澱粉酶15-20份，β -甘露聚糖酶10-15份，中草藥提取物10_15份，保護劑10-15份，激活劑10-15份； 所述枯草芽孢桿菌培養物的製備方法如下:枯草芽孢桿菌CCTCC NO:Μ2013539經斜面菌種活化和一、二、三級種子培養及一級種子罐培養逐級擴大培養得到種子液；將液體種子以6%接種量接入發酵罐，培養溫度30-36 °C，攪拌速度200-700rpm，通風量(V/V) 1:1-3，培養時間10_15h ;然後以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C，恆溫培養15_20h ;繼續以1-2°C /h降溫速率緩慢降溫至2-5°C，此時，將液體種子以4%接種量追加接入發酵罐，恆溫培養20-30h ;最後以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至10-15°C，恆溫培養15_20h ;繼續以 1-2°C /h升溫速率緩慢升溫至30-36°C，恆溫培養15-20h ;發酵液經孔徑10-1000 μ m過濾紙板粗濾，然後於10-20°C循環超濾濃縮去除水分得固形物含量為20-40%濃縮液；濃縮液經真空冷凍乾燥、超微粉碎得枯草芽孢桿菌培養物； 所述保護劑由以下重量份數的原料組成:海藻糖20-30份，NaC120-30份，(NH4) 2S0410-15 份，半胱氨酸 10-15 份； 所述激活劑是由如下質量組份的無機鹽均勻混合而成:氯化鋅30-40份，氯化鈣10-20份，硫酸鈉10-20份，氯化鎂5-10份。
2.如權利要求1所述的一種含中性蛋白酶的小麥日糧酶，其特徵在於，製備枯草芽孢桿菌培養物的斜面培養基組成為:牛肉膏3-10g，氯化鈉5-12g，蛋白腖10-20g，葡萄糖 2-5g, (NH)2S043-5g，K2HP046_8g，CaCl2l_3g，瓊脂 15_20g，中草藥粉劑 5-10g,蒸餾水1000mL, pH 值 7.0-7.2，121°C滅菌 20min。
3.如權利要求1所述的一種含中性蛋白酶的小麥日糧酶，其特徵在於，製備枯草芽孢桿菌培養物的種子培養基組成為:酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白腖0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氫二鉀0.8-1.5%，中草藥粉劑1.5-2%，海藻糖1_3%，硫酸鈣0.1%,氯化鎂0.2%,檸檬酸鈉0.1-0.3%，不足部分純淨水補足，pH值7.0-7.2，121_123°C滅菌30_40min。
4.如權利要求1所述的一種含中性蛋白酶的小麥日糧酶，其特徵在於，製備枯草芽孢桿菌培養物的種子罐培養基組成為:麥芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0.8%，中草藥粉劑1.5-2%，海藻糖1-3%，蛋白腖0.1-0.5%，玉米漿0.1-0.5%，磷酸氫二鉀0.8-1.5%，硫酸鎂0.05-0.1%，檸檬酸鈉0.1-0.5%，不足部分純淨水補足，pH值7.0-7.2，121-123 °C滅菌30_40mino
5.如權利要求1所述的一種含中性蛋白酶的小麥日糧酶，其特徵在於，製備枯草芽孢桿菌培養物時種子罐發酵液菌體濃度為7.0x108-8.0xlO8個/ml。
6.如權利要求1所述的一種含中性蛋白酶的小麥日糧酶，其特徵在於，製備枯草芽孢桿菌培養物的發酵培養基組成為:麥芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆餅粉15-25g，中草藥粉劑30-50g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米漿l_5g，硫酸銨l_3g，磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀l_2g，檸檬酸鈉l_5g，消泡劑0.Ι-lg,純淨水lOOOmL，pH值7.0-7.2，121 °C滅菌 20min。
7.一種含中性蛋白酶的小麥日糧酶的製備方法，其特徵在於，將保護劑、中草藥提取物分別超微粉碎，確保粒度小於其它酶製劑，然後與枯草芽孢桿菌培養物、酸性蛋白酶、酸性木聚糖酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、澱粉酶、β-甘露聚糖酶、均勻混合，最後加入激活劑，混合均勻後密封包裝即得成品含中性蛋白酶的小麥日糧酶。
8.如權利要求7所述的一種含中性蛋白酶的小麥日糧酶的製備方法，其特徵在於，所述含中性蛋白酶的小麥日糧酶由以下重量份數的酶製劑組成:枯草芽孢桿菌培養物20-30份，酸性蛋白酶20-30份，酸性木聚糖酶20-30份，纖維素酶20-30份，β -葡聚糖酶15-20份，澱粉酶15-20份，β -甘露聚糖酶10-15份，中草藥提取物10-15份，保護劑10-15份，激活劑10-15份； 所述枯草芽孢桿菌培養物的製備方法如下:枯草芽孢桿菌1398-2-12經斜面菌種活化和一、二、三級種子培養及一級種子罐培養逐級擴大培養得到種子液；將液體種子以6%接種量接入發酵罐，培養溫度30-36°C，攪拌速度200-700rpm，通風量(V/V) 1:1-3，培養時間10-15h ;然後以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C，恆溫培養15_20h ;繼續以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至2-5°C，此時，將液體種子以4%接種量追加接入發酵罐，恆溫培養20-30h ;最後以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至I O-15 °C，恆溫培養15_20h ;繼續以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至30-36°C，恆溫培養15-20h ;發酵液經孔徑10-1000 μ m過濾紙板粗濾，然後於10-20°C循環超濾濃縮去除水分得固形物含量為20-40%濃縮液；濃縮液經真空冷凍乾燥、超微粉碎得枯草芽孢桿菌培養物； 所述保護劑由以下重量份數的原料組成:海藻糖20-30份，NaC120-30份，(NH4) 2S0410-15 份，半胱氨酸 10-15 份； 所述激活劑是由如下質量組份的無機鹽均勻混合而成:氯化鋅30-40份，氯化鈣10-20份，硫酸鈉10-20份，氯化鎂5-10份。
9.如權利要求8所述的一種含中性蛋白酶的小麥日糧酶的製備方法，其特徵在於，所述中草藥提取物的製備方法為:分別將中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然後於容器中均勻混合併添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C~90°C保持2~4h，然後降溫至45_60°C，加入混合酶製劑進行酶解，用乳酸調節PH值為5.5-6.8，酶解2-4h，最後添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至60V~7`8°C保持3~4h，過濾；濾液減壓濃縮至固形物含量為20%以上，然後冷凍乾燥獲得中草藥提取物； 所述中草藥的重量份數組成為:沙棘20-30份，決明子20-30份，枸杞10-15份，山藥10-15份，北沙參5-10份，黃荊子5-10份，玉竹3-5份，薏米3_5份，大麥芽3_5份，桂花3_5份，黃芪3-5份； 所述混合酶添加量為混合物料總重量的5-10% ； 所述混合酶的重量份數組成為:內β -葡聚糖酶10-20份，外β -葡聚糖酶10-20份，β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普魯蘭酶20-30份，β -澱粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5_10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份。
10.如權利要求8所述的一種含中性蛋白酶的小麥日糧酶的製備方法，其特徵在於，所述含中性蛋白酶的小麥日糧酶，由以下重量份數的酶製劑組成:枯草芽孢桿菌培養物25份，酸性蛋白酶25份，酸性木聚糖酶25份，纖維素酶25份，β -葡聚糖酶17份，澱粉酶17份，β -甘露聚糖酶12份，中草藥提取物12份，保護劑13份，激活劑12份； 所述枯草芽孢桿菌培養物的製備方法包括如下步驟:(O將保存完好的枯草芽孢桿菌1398-2-12的斜面菌種接種於斜面培養基，30°C培養24h進行菌種活化，如此活化2次； 所述斜面培養基組成為:牛肉膏3g，氯化鈉5g，蛋白腖10g，葡萄糖2g，(NH)2S043g,K2HP046g, CaCl2Ig,瓊脂 15g，中草藥粉劑 5g，蒸餾水 1000mL, pH 值 7.0,121°C滅菌 20min ； 所述中草藥粉劑的製備方法如下: 以重量份數計，稱取黃芪20份；黨參10份；柴胡10份；黃芩10份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然後於容器中均勻混合併添加3倍重量的水，控制溫度70°C保持2h，然後降溫至45°C，加入混合物料總重量5%的混合酶製劑進行酶解，用乳酸調節pH值為5.5，酶解2h，最後添加混合物料0.5倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的質量比例為1:1，控制溫度至60°C保持3h，過濾；濾液真空濃縮後冷凍乾燥獲得中草藥粉劑； 所述混合酶的重量份數組成為:內β -葡聚糖酶10份，外β -葡聚糖酶10份，β -葡萄糖苷酶10份，木聚糖酶15份，戊聚糖酶15份，普魯蘭酶20份，β -澱粉酶10份，中性蛋白酶10份，酸性蛋白酶10份，超氧化物歧化酶5份，葡萄糖氧化酶5份，酸性磷酸酶5份； (2)液體種子擴大培養 ①一級種子培養:將步驟(1)活化後的斜面菌種I環接入500毫升搖瓶中，培養基裝量.100毫升，旋轉式搖床180轉/分，培養溫度30°C，培養時間IOh ； ②二級種子培養:將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養條件與一級種子相同； ③三級種子培養:將二級種子以10%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，培養基裝量1000毫升，旋轉式搖床100轉/分，培養溫度30°C，培養時間IOh ； ④一級種子罐培養:將三級種子以10%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發酵培養基裝量100L，培養溫度30°C，攪拌速度200rpm，通風量(V/V)l:l，罐壓0.05Mpa，培養時間IOh ； 所述一級、二級、三級種子培養基重量組成為: 酵母粉0.3%，葡萄糖1%，蛋白腖0.3%，牛肉膏0.5%，磷酸氫二鉀0.8%，中草藥粉劑.1.5%，海藻糖1%，硫酸鈣0.1%,氯化鎂0.2%,檸檬酸鈉0.1%，不足部分純淨水補足，pH值.7.0,121°C滅菌 30min ； 所述一級種子罐培養基重量組成為: 麥芽糊精5%，酵母粉0.4%，中草藥粉劑1.5%，海藻糖1%，蛋白腖0.1%，玉米漿0.1%，磷酸氫二鉀0.8%，硫酸鎂0.05%，檸檬酸鈉0.1%，不足部分純淨水補足，pH值7.0,121°C滅菌.30min ； 所述種子罐發酵液菌體濃度為7.0xlO8個/ml ； (3)發酵罐發酵 將步驟(2)中一級種子罐發酵液以6%接種量接入發酵罐，培養溫度30°C，攪拌速度.200r/m，通風量(V/V)l:l，培養時間IOh ;然後以1°C /h降溫速率緩慢降溫至10°C，恆溫培養15h ;繼續以1°C /h降溫速率緩慢降溫至2°C，此時，將步驟(2)中一級種子罐發酵液以.追加接入發酵罐，恆溫培養20h ;最後以1°C /h升溫速率緩慢升溫至10°C，恆溫培養15h ;繼續以1°C /h升溫速率緩慢升溫至30°C，恆溫培養15h ； 溶解氧控制:通過調整攪拌轉速及通風量，控制溶解氧15% ；pH控制:通過補氨水或稀磷酸，控制發酵過程中pH值保持在7.0 ； 補料控制:添加補料培養基，以維持發酵液還原糖含量為2-5mg/ml ； 放罐標準:60-80%菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢； 所述發酵培養基組成為:麥芽糊精50g，玉米粉50g，豆餅粉15g，中草藥粉劑30g，海藻糖30g，酵母粉4g，玉米漿lg，硫酸銨lg，磷酸氫二鉀lg，磷酸二氫鉀lg，檸檬酸鈉lg，消泡劑 0.1g,純淨水 1000mL, pH 值 7.0,121°C滅菌 20min ； 所述補料培養基重量組成為:麥芽糊精20%，玉米粉10%，豆粉15%，中草藥粉劑5%，不足部分純淨水補足，pH值7.0，121。。滅菌30min ； 所述發酵培養基的調配方法為: 按比例準確稱取原料，將原料中的純淨水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調節PH值7.0，加入中溫澱粉酶(3u/g玉米粉)與高溫澱粉酶(30u/g玉米粉)，同時邊攪拌邊升溫至70°C保溫15min，然後緩慢升溫至90°C保溫15min進行液化，最後加入其它原料，攪拌均勻，調初始ρΗ7.0,121°C滅菌30min備用； (4)發酵液經孔徑IOym過濾紙板粗濾，然後於10°C循環超濾濃縮去除水分得固形物含量為20%濃縮液；濃縮液經真空冷凍乾燥、超微粉碎得枯草芽孢桿菌培養物； 所述中草藥提取物的製備方法為:分別將中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然後於容器中均勻混合併添加5倍重量的水，控制溫度80°C保持3h，然後降溫至53°C，加入混合酶製劑進行酶解，用乳酸調節PH值為6.2，酶解3h，最後添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至69°C保持4h，過濾；濾液減壓濃縮至固形物含量為20%以上，然後冷凍乾燥獲得中草藥提取物； 所述中草藥的重量份數組成為:沙棘25份，決明子25份，枸杞17份，山藥13份，北沙參8份，黃荊子7份，玉竹4份，薏米4份，大麥芽4份，桂花4份，黃芪4份； 混合酶添加量為混合物料總重量的5-10% ；所述混合酶的重量份數組成為:內β -葡聚糖酶15份，外β -葡聚糖酶15份，β -葡萄糖苷酶13份，木聚糖酶13份，戊聚糖酶13份，普魯蘭酶25份，β -澱粉酶12份，中性蛋白酶13份，酸性蛋白酶13份，超氧化物歧化酶7份，葡萄糖氧化酶7份，酸性磷酸酶7份；所述保護劑由以下重量份數的原料組成:海藻糖25份，NaC125份，(NH4) 2S0413份，半胱氨酸12份； 所述激活劑是由如下質量組份的無機鹽均勻混合而成:氯化鋅35份，氯化鈣15份，硫酸鈉15份，氯化鎂7份； 含中性蛋白酶的小麥日糧酶的製備方法: 將所述保護劑、中草藥提取物分別超微粉碎，確保粒度小於其它酶製劑，然後與枯草芽孢桿菌培養物、酸性蛋白酶、酸性木聚糖酶、纖維素酶、葡聚糖酶、澱粉酶、甘露聚糖酶、均勻混合，最後加入激活劑，混合均勻後密封包裝即得成品含中性蛋白酶的小麥日糧酶。
【文檔編號】A23K1/165GK103740683SQ201310738229
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月27日 優先權日:2013年12月27日
【發明者】李洪兵, 李海清, 張錦傑, 胡永明, 易繼雲 申請人:湖南鴻鷹生物科技有限公司