一種螢光探針NACL及其製備和應用的製作方法
2023-05-26 18:20:31
本發明涉及螢光探針領域，具體涉及一種可用於選擇性，比率型檢測人血清白蛋白的螢光探針。4-氨基-1，8-萘酐的一種包含氨基甲酸內酯的結構，在與人血清白蛋白作用後，出現螢光波長的紅移以及強度變化。並且該過程不受到其它酯酶的影響。因此能夠比率型地定量人血清白蛋白的含量。
背景技術：
人血清白蛋白(human serum albumin，簡稱HSA)是人血漿中最豐富的蛋白質，佔到了血漿蛋白質的50％左右。在體液中人血清白蛋白可以運輸脂肪酸、膽紅素、胺基酸、類固醇激素、金屬離子和許多藥物分子等：同時維持血液正常的滲透壓。HSA作為一種下調急性期蛋白，在炎症狀態下處於低水平。HSA也是人體血漿中重要的酯酶，可以水解碳酸酯，磷酸酯以及醯胺等。HSA對底物的偏好，以及與其它酯酶的相同與異同都是研究的熱點，可能對與疾病通路的研究有指導意義。另外有研究表明HSA的酯酶活性要比其它物種SA的高很多，雖然HSA/SA的三維晶體結構並無多大差異。
螢光探針是有效檢測生命體酶類的重要手段之一，相比吸光度法具有檢測靈敏的優勢。一個具有應用前景的螢光探針應具有作用前後螢光變化明顯、對目標分子響應快、選擇性好、合成簡單等優點。目前應用於檢測HSA的方法主要是溴甲酚綠檢測法，主要基於白蛋白在酸性PH下帶正電荷的特性。另外基於白蛋白的酯酶活性，p-nitrophenyl acetate(PNPA)檢測方法也比較普遍。但是如上兩種方法,如溴甲酚綠法，它必須在30s內完成檢測，否則受其他蛋白影響很大。PNPA法，它能被多種酶代謝，因此面臨著選擇性的問題。檢測HSA的螢光探針目前也都是基於白蛋白結合機制的，很難達到準確定量血漿HSA的目標。因此開發定量檢測HSA的探針具有重大意義。
技術實現要素：
本發明就是針對上述問題，提供了一種可用於選擇性檢測細胞內HSA的螢光探針，此探針可以在生理條件下選擇性地與HSA作用，作用後螢光顯著增強。
本發明採用如下技術方案：採用4-氨基-1，8-萘酐作為螢光母體，引入了一種氨基甲酸內酯的結構。該結構在與人血清白蛋白作用後，反應物的螢光降低，產物的螢光升高，並且不受其它酯酶的影響。因此能夠比率型地定量人血清白蛋白的含量。
所述螢光探針的結構式Ⅰ如下。
結構式Ⅰ
所述的螢光探針的製備方法為：以4-氨基-1，8-萘酐作為螢光母體，引入了一種氨基甲酸內酯的結構；具體製備步驟如下，
1)在20ml乙醇中，加入4-氨基-1，8-萘酐(cas：81-86-7)0.775g與1-丁胺(cas：109-73-9)353uL，78度回流4小時。反應完後旋幹溶劑，得到產物1(0.97g，產率100％)。
2)在20ml的二氧六環中，加入0.5g(1.86mmol)產物1,和氯甲酸氯乙酯232uL(1.86mmol)，加入三乙胺(774uL，5.58mmol)作為縛酸劑。反應混合液加熱到100℃，反應兩小時。TLC跟蹤反應進程，到原料黃點(365nm激發下)全部轉化為產物藍點(365nm激發下)則停止反應。反應後旋幹，簡單柱層析(CH2Cl2)分離。得到產物2(0.55g,79％yield).
3)在5ml甲醇裡，加入四甲基胍65uL，加入0.1g(0.26mmol)產物2,常溫攪拌15min後，旋幹，簡單柱層析(CH2Cl2)分離。得到產物3(0.09g，產率95％)。
所述的螢光探針的製備方法，其特徵在於：步驟4)中所述反應溶劑為二氧六環，反應溫度為100℃，縛酸劑三乙胺使用量為3N；步驟5)中縛酸劑四甲基胍的使用量為2N,反應溫度為常溫。
所述的製備方法，其特徵在於：所述步驟1-5)中，所用的實驗條件均為氮氣保護；所述的步驟1)—5)中攪拌的方式為磁力攪拌。
所述的螢光探針可以用於人血清白蛋白(human serum albumin,簡稱HSA)的定性或定量檢測。所述的螢光探針應用於檢測HSA時，其是生成具有結構II的化合物，從而導致螢光變化，結構2的名稱為4-乙醇胺基-1,8-萘酐。
結構II
所述的螢光探針在定量檢測HSA中，與HSA作用後，512nm/460nm螢光強度正比於HSA的酯酶活性。
所述的螢光探針可用於血漿中HSA的定量檢測。
本發明的有益效果：該化合物在HSA存在下出現螢光波長的紅移以及強度改變，可用於高選擇性、高靈敏性地檢測HSA。尤其是，該化合物可用於中的HSA檢測，這對於深入研究HSA在生物體內生理和病理過程的動力學機理具有重要意義。
附圖說明
圖1實施例1中提供的螢光探針NACL的合成路線圖；
圖2本發明提供的螢光探針NACL檢測HSA的原理示意圖；
圖3實施例1中合成的探針NACL的1H NMR(a)，13C NMR(b)，譜圖；
圖4實施例2中螢光探針NACL水溶液的紫外可見吸收光譜(a)、螢光激發光譜(b)、發射光譜(c)；
圖5實施例3中螢光探針NACL對HSA的選擇性示意圖；
圖6實施例4中產物4-乙醇胺-1,8-萘酐(NAEA)的液相質譜圖(a)/核磁H譜圖(b)；
圖7實施例5中NAEA的紫外可見吸收光譜(a)、螢光激發光譜(b)、發射光譜(c)；
圖8實施例6中NAEA發射光譜受HSA的結合影響示意圖。
圖9實施例7中螢光探針NACL對不同濃度的HSA響應後，460nm螢光的減弱示意圖(a)及512nm螢光的增強示意圖(b)；
圖10實施例8中螢光探針NACL在HSA被抑制作用下示意圖,(a)時間動力學圖；(b)測試抑制劑FA的IC50值圖；(c)在血漿中用各種酶的抑制劑抑制，只有FA能夠明顯抑制白蛋白活性；
圖11實施例9中螢光探針NACL用於檢測血清中HSA的定量標線。
具體實施方式
下述實施例用於進一步說明本發明，但本發明不限於實施例。
實施例1(探針的合成)：
如圖1所示，NACL的合成：1)在20ml乙醇中，加入4-氨基-1，8-萘酐(cas：81-86-7)0.775g與1-丁胺(cas：109-73-9)353uL，78度回流4小時。反應完後旋幹溶劑，得到產物1(0.97g，產率100％)。
2)在20ml的二氧六環中，加入0.5g(1.86mmol)產物1,和氯甲酸氯乙酯232uL(1.86mmol)，加入三乙胺(774uL，5.58mmol)作為縛酸劑。反應混合液加熱到100℃，反應兩小時。TLC跟蹤反應進程，到原料黃點(365nm激發下)全部轉化為產物藍點(365nm激發下)則停止反應。反應後旋幹，簡單柱層析(CH2Cl2)分離。得到產物2(0.55g,79％yield).3)在5ml甲醇裡，加入四甲基胍65uL，加入0.1g(0.26mmol)產物2,常溫攪拌15min後，旋幹，簡單柱層析(CH2Cl2)分離。得到產物3(0.09g，產率95％)。MS:339.13(positiveion)。1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ(ppm):δ＝8.64(d,1H,J＝7.2Hz),8.61(d,1H,J＝8.0Hz),8.28(d,1H,J＝8.6Hz),7.80(t,1H,J＝7.8Hz),7.69(d,1H,J＝7.6Hz),4.71(t,2H,J＝8.2Hz),4.20(m,4H),1.72(m,2H),1.45(m,2H),0.98(t,3H,J＝7.2Hz).13CNMR(100MHz,Chloroform-d)δ(ppm):163.90,163.44,156.59,140.13,131.11,129.32,127.78,127.36,123.35,123.29,122.22,62.77,48.68,40.34,30.18,20.37,13.85。
實施例2
如圖4所示，將NACL溶於10mM的PBS緩衝液中，配置成20uM的溶液。用螢光酶標儀(Thermofisher)檢測器檢測NACL水溶液的紫外可見吸收光譜(a)、螢光激發光譜(b)、發射光譜(c))；結果顯示探針NACL的最大吸收/激發/發射波長為350nm/350nm/460nm。
實施例3
配置HSA/BSA的水溶液(酶濃度為50mg/ml)CES1/CES2/PON1/PON2/AChE/BChE/ALP/ACP/IgG/A1AT酶/蛋白分別等分成若干份。配置NACL(50mM)的DMSO溶液。每個反應在196ul 100mM的PBS緩衝液中加2ul NACL(50mM)以及2ul酶，使用全波長掃描式多功能讀數儀進行測量，探針和酶的終濃度分別為50uM和1mg/ml。測量該工作液的螢光發射光譜，λex＝450nm，光柵寬度為5nm，發射範圍從470nm-700nm。圖5表明NACL在HSA的作用下，512nm的螢光強度增加，其它酶則沒有顯著變化。
實施例4
在PBS(PH＝7.4)溶液5ml中，加入HSA 50mg/ml的溶液250ul，取NACL (50mM)的DMSO溶液50ul，在37℃下孵育2h。反應後加入二氯甲烷溶液2ml，萃取，分出有機相，重複萃取三次，得到的有機相濃縮。用矽膠柱色譜的方法分出產物。如圖6，產物經液相質譜/核磁鑑定，發現為4-乙醇胺-1,8-萘酐(NAEA)。
實施例5
將NAEA溶於10mM的PBS緩衝液中，配置成20uM的溶液。用螢光酶標儀(Thermofisher)檢測器檢測NACL水溶液的紫外可見吸收光譜(a)、螢光激發光譜(b)、發射光譜(c))；結果顯示NAEA的最大吸收/激發/發射波長為450/450/512nm,如圖7所示。
實施例6
在濃度為20uM的NAEA溶液中(10mM的PBS緩衝液中)，分別加入5％的0.5/1/2/5/10/50mg/ml HSA溶液。如圖8所示，隨著HSA溶液的濃度增高，NAEA的發射光譜逐漸從550nm藍移到510nm，並且螢光強度有所增加。
實施例7
配置HSA不同濃度(酶濃度為50/40/30/20/10/5mg/ml)酶分別等分成若干份。配置NACL(2mM)的DMSO溶液(重要的極性非質子溶劑)。每個反應在178ul100mM的PBS緩衝液中加2ul NACL(2mM)以及20ul酶，使用全波長掃描式多功能讀數儀及96孔酶標板進行測量，探針和酶的終濃度分別為20uM和5/4/3/2/1/0.5mg/ml。測量該工作液的螢光發射光譜，λex1＝350nm，光柵寬度為5nm，發射範圍從370nm-600nm。λex2＝450nm，光柵寬度為5nm，發射範圍從470nm-700nm。如圖7所示，NACL與HSA作用後，隨HSA濃度增加,460nm螢光降低(a)，512nm螢光升高(b)，如圖9所示。
實施例8
配置NACL特異性抑制劑flufenamic acid儲液。每個反應在176ul的PBS緩衝液(10mM)中加2ul NACL(2mM)以及2ul的酶(10mg/ml)以及2ul的抑制劑或2ul緩衝液(對照)。使用全波長掃描式多功能讀數儀及96孔酶標板進行測量。測量該工作液的螢光發射光譜，λex＝450nm，光柵寬度為5nm，λem＝512nm。結果顯示：如圖10，NACL被HSA的催化作用可以被500uM flufenamic acid HSA抑制劑完全抑制，再次證明NACL是HSA的探針底物。另外以NACL為底物測flufenamic acid(FA)抑制劑的IC50,得到其IC50值為88uM。用血漿孵育NACL,同時加入flufenamic acid(FA):HSA的抑制劑；phenylmethyl sulfonylfluoride(PMSF):trpsin,chymotrypsin等絲氨酸蛋白酶的抑制劑；ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA):PON的抑制劑；bis-p-nitrophenyl phosphate(BNPP):carboxylesterase的抑制劑；ISO-OMPA:cholinesterase的抑制劑；levamisole:ALP的抑制劑；發現只有FA能夠明顯抑制血漿中的NASA代謝，說明NASA可以用於血漿中白蛋白的檢測。
實施例9(探針NACL用於HSA的檢測的定量標線)：同實施例7，用不同濃度HSA(酶濃度為50/40/30/20/10/5mg/ml)孵育,發現512nm/460nm處螢光值 比值F510/460nm與濃度成線性關係(a)。(圖11)在不連續的四天內同做標線(b)，發現差異不大，穩定性很好。因此該標線可用於HSA的定量檢測中。