一種C型肝炎病毒環介導等溫擴增檢測試劑盒的製作方法
2023-05-26 06:32:16
專利名稱：一種C型肝炎病毒環介導等溫擴增檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及病原體檢測技術領域，尤其涉及的是ー種C型肝炎病毒環介導等溫擴增檢測試劑盒。
背景技術：
C型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)屬於黃病毒科,是慢性C型肝炎的病原，迄今為止大約有2億人感染HCV，感染人口約佔全球人口的2 3%。據報導有些國家HCV感染率可高達10%以上例如在非洲和中東ー些國家。HCV病毒在遺傳變異出表現出來的高變異的特性、以及高效率的細胞培養體系和合適的HCV感染小動物模型的缺乏是目前抑制對HCV深入研究的瓶頸，嚴重阻礙了科學家對HCV生活史、疫苗和特異性抗病毒藥物的研究。隨著科學技術的發展和不斷的深入研究，HCV在病原學、分子生物學、流行病學等領域取得了很多備受關注的研究成果。HCV是一直徑約為50nm的球狀顆粒。顆粒外表有脂質包膜，結合著宿主來源的脂質或免疫球蛋白。HCV的基因組是ー單股正鏈RNA分子。不同個體來源或同一個體不同病程階段的HCV顆粒可表現出顯著不同的浮力密度，主要為1. 06g/ mL和1. 17g/mL兩種密度。HCV在被感染宿主體內的主要寄生地是肝臟，其病毒的濃度是外周循環血中的120倍。HCV有嚴格的宿主限制性，迄今已證實的可感染宿主只有人類和黑猩猩。雖有利用連續傳代的細胞系在體外培養條件下支持HCV複製的報導，但是目前尚不能形成 可供 進行分子生物學研究的體外模型。HCV僅有Huh7，Huh7. 5，Huh7. 5.1三種體外細胞培養系統，黒猩猩、恆河猴等靈長類動物可感染HCV，但症狀較輕。
發明內容
提高C型肝炎病人療效的最佳途徑是早發現、早診斷、早治療，要實現這一目的最關鍵的是早期對HCV病原學的確診，迄今為止廣泛應用於臨床的C型肝炎的病原學確診方法操作繁瑣，費時費力，檢測試劑和儀器昂貴，檢測費用相對較高的缺點。本發明的目的為提供一種特異性高、操作簡便、反應迅速、成本低廉的C型肝炎病毒環介導等溫擴增檢測試劑盒。本發明的技術方案如下一種C型肝炎病毒環介導等溫擴增檢測試劑盒，包括外引物F3、B3和內引物FIP、BIP，所述引物序列依次如SEQ ID NO 1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3 SEQ ID N0:4所示。所述C型肝炎病毒環介導等溫擴增檢測試劑盒的使用方法分別取5ML HCV RNA模板、取引物FIP和BIP各40 pmol/L，引物F3和B3各5pmol/L,混勻後置於冰上，加入1. 6 mol/L betaine, 16 mmol/L MgSO4,40 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，20 mmol/L KCl, 20 mmol/L (NH4)2SO4, 0. 2% Tween 20，2.8 mmol/L dNTPs,Bst DNA聚合酶8U，AMV逆轉錄酶50U，補充DEPC處理水至25ML。輕輕混勻反應液，分別置恆溫水槽60°C反應60min，最後80°C孵育5min以滅活酶終止反應。反應產物幹2. 5%瓊脂糖凝膠IOOV電泳40min, EB染色,全自動凝膠圖象分析系統觀察。結果判定方法如擴增產物條帶呈LAMP特徵性梯狀條帶為陽性，無任何條帶為陰性。HCV RNA經RT-LAMP擴增後加入SYBR Green I螢光染料，反應液變綠為陽性，反應液保持橙色為陰性。HCV RNA經RT-LAMP擴增後加入SYBR Green I螢光染料，在紫外燈下觀察反應液發出螢光為陽性而陰性對照管未見螢光為陰性。C型肝炎疾病的早期快速確診是治療C型肝炎的基礎和首要條件，尋找敏感性高、特異性強、簡便及能批量操作的方法具有重要意義。迄今為止廣泛應用於臨床的C型肝炎的病原學確診方法是實時定量RT-PCRJS操作繁瑣，費時費力，檢測試劑和儀器昂貴，檢測費用相對較高。本發明通過BLAST比對GeneBank上已公布的27個HCV國際參考毒株的5』 -非編碼區(5』 -UTR)的保守區域和部分核心保守區序列確定RT-LAMP目標序列，根據我國流行的HCV主要為Ib型這ー特性，以GenBank公布的HCV Ib型基因組全序列(登錄號⑶451224)的5』_UTR和核心蛋白的保守區域為目標序列，設計出HCV特異的內引物FIP、BIP和外引物F3、B3，構建了 HCV逆轉錄環介導等溫擴增檢測法。該方法與臨床常用的PCR·檢測法相比具有很好的敏感性，其最低檢測限度可達600 IU/mL。特異性試驗中，以HAV，HBV和HEV為模板均擴增不出陽性結果，顯示該方法有較好的特異性。在對臨床樣品的檢測比較中我們發現，其檢測率比巢式RT-PCR高，幾乎和實時定量RT-PCR的檢測率相同，並且沒有發現HCV的基因型差異對敏感性有影響。該方法在急性HCV感染的早期診斷上有廣闊的應用前景。本發明提供了一種特異性高、操作簡便、反應迅速、成本低廉的介導等溫擴增檢測試劑盒對C型肝炎進行病原學診斷，為C型肝炎的早期快速診斷提供新方法。
圖1 RT-LAMP反應時間的優化結果圖2 RT-LAMP擴增HCV RNA後加入SYBR Green I螢光染料肉眼觀察3 RT-LAMP擴增HCV RNA後加入SYBR Green I螢光染料紫外燈下觀察結果圖4 RT-LAMP檢測HCV的特異性分析圖5 RT-LAMP和RT-PCR檢測HCVRNA以及LAMP和PCR檢測重建質粒的敏感性分析。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。2.1 RT-LAMP 引物設計通過BLAST比對GeneBank上已公布的27條代表7個基因型的HCV國際參考毒株的全基因組序列(基因型分類參考http //euhcvdb.1bcp. fr/euHCVdb.登錄號見表I)以確定RT-LAMP目標序列，根據GenBank公布的HCVlb型基因組全序列(登錄號⑶451224)的5-UTR和核心蛋白的保守序列，輸入在線軟體primer Explorer V4 (http://primerexplorer. jp/e/)設計 RT-LAMP 特異的內引物 FIP、BIP 和外引物 F3、B3。表127條代表7個基因型的HCV國際參考毒株登錄號
權利要求
1.一種C型肝炎病毒環介導等溫擴增檢測試劑盒，其特徵在於，包括外引物F3、B3和內引物 FIP、BIP，所述引物序列依次如 SEQ ID NO 1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3 SEQ IDNO -A所示。
全文摘要
本發明公開了一種C型肝炎病毒環介導等溫擴增檢測試劑盒，包括外引物F3、B3和內引物FIP、BIP，所述引物序列依次如SEQ ID NO1 、SEQ ID NO2、 SEQ ID NO3 SEQ ID NO4所示。本發明提供了一種特異性高、操作簡便、反應迅速、成本低廉的介導等溫擴增檢測試劑盒對C型肝炎進行病原學診斷，為C型肝炎的早期快速診斷提供新方法。
文檔編號C12Q1/70GK103060472SQ20131000613
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月8日 優先權日2013年1月8日
發明者劉學忠, 胡錦松, 李慶林, 劉驍 申請人:成都市學忠農業發展有限公司, 四川農業大學