一種食品及飼料中狐狸源成分檢測側向流試紙條檢測試劑盒及其應用的製作方法與工藝

2023-05-26 19:47:31

本發明屬於分子生物學和免疫學領域，食品及飼料中狐狸源DNA的PCR核酸擴增，及側向流免疫膠體金試紙條試劑盒的製備和應用方法。

背景技術：
為防止牛海綿狀腦病(bovinespongiformencephalopathy,BSE)經添加在動物飼料中的牛肉、牛骨傳播，1994年歐盟和1997年美國分別在1994年和1997年制定禁止在反芻動物的飼料中添加反芻動物源性蛋白的法規，2000年歐盟將這項禁令擴大到禁止向用於食用的動物飼餵加工過的哺乳動物、鳥類和魚類蛋白成分。我國農業部於2004年頒布的《動物源性飼料產品安全衛生管理辦法》中規定禁止在反芻動物飼料中使用動物源性飼料產品(乳及乳製品除外)，但在動物飼料中人為摻入反芻動物（主要是牛、羊）肉和骨製品的現象時有發生。近年來，國內外食品市場上假羊肉、假牛肉等以假亂真現象層出不窮，動物源性食品摻雜摻假等各種食品安全事件的頻發越來越讓老百姓心驚膽顫。2013年初，歐洲的「馬肉風波」愈演愈烈，使得消費者「聞馬色變」。之後歐美的」魚肉風波」又再一次拉響了食品安全的警鐘。要保證食品及飼料的安全，需要靈敏、便捷、準確的檢測方法提供基礎。傳統的食品及飼料中動物性成分鑑定主要通過顯微鏡檢、基於蛋白質檢測的免疫學方法以及基於核酸檢測的各類PCR方法，近年還發展了近紅外檢測法(NIRS)。食品及飼料成分中摻入的各種動物源成分在高溫處理和加工過程中易於受到破壞，不同種屬動物的蛋白質序列之間差異不大，難以區別，發明專利「SDS-PAGE法鑑別肉及肉製品中動物源性成份」（公開號：CN102213720A）提供了一種以蛋白質的SDS-PAGE電泳方式鑑定豬、牛、羊、鵝、魚的動物蛋白的方法，但不同來源和處理方式的蛋白電泳譜帶不同，帶來結果判別的障礙，對於飼料中的動物成分更難以實施。因為基因編碼序列的簡併性特徵和非編碼序列的存在，核酸成為較蛋白更易檢出差異的靶分子，特別是線粒體DNA，拷貝數高，存在物種間差異，對其差異片段的分析是主要的鑑定方法，這類方法因靈敏度高，特異性好，耗時少而發展迅速，主要的方法包括普通/螢光PCR方法及基因晶片技術。在以線粒體DNA序列進行物種的種屬鑑別時，常用的區域包括編碼細胞色素B的Cytochromeb基因（cytB）、核糖體小亞基12SRNA編碼序列（12SribosomalRNA）、細胞色素C亞基I（cytochromeCoxidasesubunitI）的編碼基因coxI、編碼ATP8及ATP6的atp8及atp6基因以及控制區D-loop片段。這些區域的序列變異適中，即在種內有一定的保守性，又體現出一定的種間差異。螢光定量PCR技術是一種高靈敏度核酸檢測和定量方法，基本原理是在實時螢光定量PCR反應中，引入了一種螢光化學物質，隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷積累，螢光信號強度也等比例增加。螢光定量PCR技術使定性檢測邁上了可以量化的臺階，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強、能實現多重反應、自動化程度高、無汙染性，具有實時性和準確性等特點，特別是依賴探針結合的TaqMan方法，目前已廣泛應用於分子生物學研究和醫學研究等領域。在物種鑑定應用方面，國內已經發布的國家標準或行業標準涵蓋了鵝、羊、鹿、駱駝、馬、驢、豬、兔、狗和魚等哺乳動物或水生生物。發明專利「用於檢測食品和飼料中狐狸成分的引物和探針」（公開號：CN103060435A）描述了一種能本發明選取狐狸的線粒體細胞色素C氧化還原酶I亞單位基因序列，設計一組特異性引物和探針，使用該引物和探針，採用實時螢光PCR技術，可快速、靈敏、特異地檢測食品和飼料中的狐狸成分，公開號為CN103088116A的發明專利「食品和飼料中狐狸成分快速檢測試劑盒的製備和檢測方法」以用實時螢光PCR技術檢測食品和飼料中狐狸成分的試劑盒及方法，主要目的是防止以其他動物源製品替代狐狸源成分。出於此種目的檢測方法，比如，檢測方法公開號為CN103361422A的發明「一種鑑別摻假肉及其製品的多重PCR快速檢測方法」涉及一種多重PCR快速檢測技術快速檢測肉品中是否含有某種被測定肉的技術。上述方法均為常規的PCR方法，需要對產物凝膠電泳後進行圖像採集和分析，耗費時間較長，且難以保證檢測的靈敏度。通過將免疫學檢測的方法移植於核酸產物檢測可以有效提高核酸產物的檢測效率。通過將PCR擴增使用的引物標記特定的蛋白質或化合物可以在其擴增產物中引入同時包括兩種化合物/蛋白質標記的核酸複合物，這個標記的產物可以通過抗體或者配體以類似雙抗體夾心的方式進行檢測，這個過程類似常規的免疫金標記檢測技術，這種方法已經在單核苷酸多態性以及恆溫擴增靶基因的方法中使用，特別是對病原微生物或疾病關聯基因的鑑定，公開號為CN102134596A的發明專利-一種基於核酸橫向流試紙條檢測單核苷酸多態性的方法即以此方法進行單核苷酸多態性的檢測。而公開號為CN102520172A的發明專利-單增李斯特氏菌核酸層析檢測試劑盒及其檢測方法和應用描述了一種分別採用生物素和地高辛標記引物的單增李斯特氏菌基因組檢測方法。因此類方法僅對擴增產物的有無進行判斷，不對產物的分子量確認，因此在擴增反應中的幹擾因素更多一些，常見的引起假陽性的原因包括：非特異性擴增、引物二聚體、擴增產物間的異常復性，解決引物二聚體、異常退火造成的幹擾可以從PCR聚合酶的選擇、引物序列優化、dNTP底物、雜交過程的控制幾個方面開展。選擇具有熱啟動（Hot-start）功能的DNA聚合酶可以明顯降低引物二聚體和非特異擴增產物的形成。在引物優化方面，公開號為CN102146432A的發明專利-「一對部分同序引物減少其二聚體的方法」描述了一種在引物5′端帶有短迴文序列的引物設計方法，該引物常溫下自身環化，避免形成異源二聚體，公開號為CN102719547A的發明專利-「檢測HER2基因表達水平的實時螢光定量PCR試劑」也採用了類似的方法用於實時定量PCR的擴增；公開號為CN101842494A的發明專利-「使用嵌合引物降低異源二聚體形成」描述了一種使用嵌合引物進行擴增的方法；在對反應底物的優化中，公開號CN101171343A的發明專利「含有假異胞嘧啶核酸鹼基衍生物的3′修飾寡核苷酸及其作為引物或探針的應用」提供了一種使用特別修飾的核苷酸作為底物以減少引物二聚體形成的方法，使用探針或者引入內控探針也可以降低非特異擴增的幹擾，公開號為CN101957373A的發明專利-「一種加入內控核酸對病原體核酸進行半定量檢測的方法」即採用內控探針來降低幹擾，上述方法中，使用熱啟動技術和環化引物是通行的方法，其餘方法或者採用了特殊合成的底物及底物，或者需要通過探針引入第二次雜交過程，都會增加檢測過程的複雜程度，特別是探針雜交方法，因需要保溫過程而失去了試紙條方法的便利性。本發明引物設計中，在保持特異性基礎上，對引物對及引物內5′及3′末端退火的自由能進行評估後選擇合適的區域避免二聚體的形成，針對試紙條檢測方法二聚體的幹擾情況以適當的擴增子長度，配合展開緩衝液中去汙劑及變性劑的濃度優化，可以實現引物二聚體和非特異擴增產物的有效清除。

技術實現要素：
將生物小分子或化合物標記的核酸分子可以被該小分子或化合物的抗體特異性識別，從而通過免疫學方法檢測。常見的可用於核酸分子標記的分子包括半抗原分子生物素（Biotin）、地高辛（Digoxin），螢光染料分子羅丹明(RBITC)、異硫氰酸螢光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)、Cy3、Cy5等。上述標記分子中，地高辛、異硫氰酸螢光素都易於獲得特異的抗體，而生物素分子與其配體-鏈親和素具有高度特異的結合特性，因此這幾種分子都可以選擇用於核酸分子的標記和免疫學檢測。本發明旨在將抗原或半抗原小分子標記單鏈寡核酸作為引物，對待檢的靶核酸特異性擴增，形成的複合物分子同時具備兩種抗原或半抗原標記，免疫原性的，該複合物即可用與特異抗體或特異配體結合，實現核酸擴增產物的免疫膠體金檢測。因此，一方面，本發明提供一種試紙條法檢測食品及飼料中狐狸源成分的的檢測技術，主要包括：1)設計兩條獨特的擴增引物，其中正向引物Fox-CYTB-F具有如下序列：5′-CCCTATATCGGAACCGATC-3′，用抗原或半抗原分子生物素（Biotin）、異硫氰酸螢光素（FITC）或地高辛（Digoxin）中的一種標記；下遊引物Fox-CYTB-R的序列為5′-GAACTGAAAGGAGAAGTAAAAC-3′，以不同於上遊引物的一種標記，；在適宜的擴增條件下，可擴增狐狸線粒體基因組COX區域一段長度為250bps的DNA片段；當無被檢核酸模板存在時，無特異性核酸片段擴增產物；2)將一種標準的通用抗體，如抗FITC抗體與膠體金顆粒交聯，在顆粒表面形成包被的抗體；3)將另一種標記分子的抗體或配體，如抗地高辛抗體或生物素分子的配體-鏈親和素分子以線條狀固定於膜上形成檢測線；4)當存在待檢的特異性擴增產物時，因上、下遊引物的作用，擴增產物中同時帶有上述三種標記物中的兩種，形成標記分子1-擴增產物-標記分子2的複合物；5)將步驟4)形成的標誌物1-擴增產物-標誌物2與膠體金顆粒表面包被的標誌物1的抗體結合，形成抗標誌物1抗體-標誌物1-擴增產物-標誌物2有色顆粒複合物；6)將步驟5)得到的有色顆粒複合物在溶液中通過毛細現象沿纖維膜向上流動至塗布有標誌物2的抗體或配體的線條上，複合物因與標誌物2的抗體（配體）結合而沉積，滯留在檢測線上，形成肉眼可見的有色線條，判定為陽性；7)當特異性擴增產物不存在時，不發生上述步驟4)-6)，不能形成標誌物1-擴增產物-標誌物2複合物，也就不能形沉積於檢測線上標誌物2的抗體（配體）之上，不形成可見的條帶，判為陰性。另一方面，本發明還提供了用於核酸序列檢測的展開液，該展開液可以減少引物二聚體對實驗結果的幹擾；另一方面，本發明提供了用於食品及飼料中狐狸源成分的快速檢測的試紙條，其包括在帶有不乾膠的襯墊，按順序有：1：吸水濾紙墊；2：結合物墊，附有第一種核酸標記物的抗體或配體的生色顆粒（膠體金或乳膠）；3：側向層析基質（硝酸纖維素膜或尼龍膜）；4：檢測帶，附有第二種核酸標記物的抗體；5：質控帶，附有可結合特定種屬來源抗體的抗體；6：襯底；7：吸水墊。另一方面，本發明還提供了用於檢測核酸擴增產物的通用標準試紙條。最後，本發明還提供了上述檢測方法和試紙條在食品及飼料中狐狸源性成分檢測中的用途。本發明說明書中所使用的技術術語解釋：引物：DNA合成的起始物。一般為一對單鏈寡核甘酸，在與模板雜交後，DNA合成從其3′末端開始。標記：將可檢測的信號分子(如半抗原，螢光，放射性等)與單鏈寡核苷酸相偶聯的方法。雜交：特指互補的DNA單鏈通過鹼基配對形成雙鏈結構。展開：經擴增反應的PCR產物在展開緩衝液的層析作用下由試紙條吸水墊底端開始向檢測線、質控線方向移動的過程。核酸：脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的通稱。抗原和半抗原：具備免疫原性的物質。通常為大分子蛋白質或細胞組分。但有些小分子也具備免疫原性，被稱為半抗原((Hapten)。半抗原常被用於標記探針。抗體：能與抗原或半抗原特異性結合的蛋白質分子。複合體：由兩種或兩種以上分子特異性結成的結合物。引物二聚體：在聚合酶鏈式反應（PCR）過程中，因引物對間、或單條引物相互退火形成的二聚體分子，由兩條不同引物構成的二聚體為異二聚體，因帶有兩種標記而可能引起與種抗體（配體）的結合而造成假陽性，由單一引物退火形成的二聚體為同二聚體，僅帶有一種標記而不會引起假陽性，但過多的二聚體形成會降低擴增效率。免疫試紙條：用於快速檢測的醫學工具。又稱為呈色薄膜層析。核酸聚合酶：合成核酸長鏈的酶類。分為DNA聚合酶和RNA聚合酶兩大類。有益效果由於本發明是以標記的特異性引物擴增適當長度的基因片段，能夠保證檢測的高度特異性，從而保證了檢測結果的準確性。本發明的新穎之處避免了擴增產物稀釋和探針雜交等流程，保持了免疫膠體金(試紙條)技術直觀、快速、方便、成熟、廉價等優點，又具備PCR擴增方法高度靈敏度、高度特異性的特點，因此，本發明的方法是一種有效的狐狸源動物成分檢測方法。作為一個核酸擴增產物檢測的通用技術平臺，本發明的方法及其試紙條可以廣泛用於飼料中動物源成分的鑑定及食源性病原微生物的檢測，在農牧業、海關檢驗檢疫都有廣泛的應用前景。目前雖有多種基於PCR的動物源成分鑑定方法，但其引物設計和產物片段都適於探針法或凝膠電泳，而對於膠體金試紙條法中降低引物二聚體及非特異復性的幹擾去除缺乏必要的考慮，解決方法也並不適用。本發明目的在於提供一種基於免疫膠體金方法檢測狐狸源動物成分的PCR引物、擴增和檢測方法，以及該方法的應用。其他常見物種，如羊、豬、牛、驢、兔、駱駝、羊、雞、鴨、貂、鹿等的鑑定都可以採用與此類似的方法完成。核酸試紙條檢測方法的發明將大大簡化核酸擴增後的檢測程序。結果判讀簡單明了、直觀(檢測示意結果如附圖2)。本專利所申請的食品及飼料中狐狸源成分試紙條快速檢測技術，作為一種新型的核酸擴增後檢測技術，具有以下優點：操作簡單：只需要把核酸擴增後的樣品直接滴到核酸試劑檢測版上即可，不需要專業人員操作，便於推廣；快速：檢測5分鐘後判讀結果；靈敏：與瓊脂糖凝膠電泳相比，檢測靈敏度提高近100～200倍；特異性高：由於在檢測過程中加使用的為特異性標記引物，使結果更加準確；價格便宜：費用大大低於傳統的凝膠電泳和ELISA檢測。附圖說明圖1顯示本發明的核酸序列擴增產物檢測的試紙條的基本結構；圖2是核酸檢測試紙條的檢測結果示意圖；圖3是顯示用實施例1的方法，採用特異性標記引物檢測狐狸成分PCR-試紙條的檢測結果；圖4是顯示用實施例2的方法，採用檢測狐狸特異性標記引物的特異性PCR-試紙條的檢測結果；圖5是用實施例2的方法，顯示核酸擴增後試紙條與凝膠電泳檢測法的敏感度比較結果。具體實施方式如下實施例舉例說明本發明的檢測方法及其檢測效果。實施例僅用來舉例，並不構成對本發明保護範圍的任何限制，本發明的保護範圍在所附的權利要求書說明。實施例11材料與方法狐狸線粒體DNA1.2引物設計1.3PCR擴增體系：1.3PCR擴增體系：反應條件：同時分別取5μl用於核酸試紙條檢，測取5μL擴增產物，加入到95μL展開液中進行檢測點於樣品墊，5分鐘後觀察結果。1.4PCR特異性實驗利用建立起來的PCR反應體系對1：狐狸；2：鼠；3：牛；4：鹿5：貂；6：狗；7：豬；8：貓；9：雞；10：鴨；11：鵝；12：NTC空白對照（水）驗證其特異性。2結果2.1PCR反應體系及條件採用TaKaRa公司的HSTaqDNApolymerase，總反應體系為20μl。用Bio-RadPCR儀進行檢測，反應參數為：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s進行擴增，30個循環後轉入72℃5min，4℃保存。取5μl產物在含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳中進行電泳，電泳後判斷有無特異性條帶。核酸擴增後試紙條與凝膠電泳的檢測結果顯示於附圖4中。2.2特異性試驗本發明建立的PCR方法對狐狸基因組DNA具有較好的特異性，對其他哺乳動物及家禽類物種等無交叉反應。實施例2核酸試紙條檢測方法的靈敏性，將PCR模板以1/10，1/102，1/103，1/104，1/105，1/106，1/107，1/108，1/109，1/1010的比例稀釋後，按已建立的PCR體系進行擴增。1材料與方法狐狸線粒體DNA1.2引物設計1.3PCR擴增體系：反應條件：分別取5μl用於瓊脂糖凝膠電泳。凝膠電泳條件為：1XTBE緩衝液，電壓100V，電泳時間30分。同時分別取5μl用於核酸試紙條檢測，取5μl樣品點於樣品墊，加入到95μL展開液中進行檢測，5分鐘後觀察結果。2結果2.1PCR反應體系及條件採用TaKaRa公司的HSTaqDNApolymerase，總反應體系為20μl。用Bio-RadPCR儀進行檢測，反應參數為：94℃5min，94℃30s，56.5℃30s，72℃80s進行擴增，30個循環後轉入72℃5min，4℃保存。取5μl產物在含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳中進行電泳，電泳後判斷有無特異性條帶。核酸擴增後試紙條與凝膠電泳的敏感度比較結果顯示於附圖5中，由附圖5的結果可以看出，與傳統的凝膠電泳相比，其敏感度增加10~102倍以上。