重組水蛭素口服腸溶緩釋製劑的製作方法

2023-05-26 01:48:56

專利名稱：重組水蛭素口服腸溶緩釋製劑的製作方法
從世界範圍來看，血栓相關性疾病如腦卒中、冠心病、肺栓塞、脈管炎的發病率居高不下，在我國和某些發達國家已佔死亡原因的第一位。雖然目前已有眾多抗凝血的藥物如肝素和阿斯匹林等，但其抗凝血機理均不是直接抑制凝血酶的活性。本發明的目的在於提供一種口服抗凝藥物，其有效成分為水蛭素，它是迄今為止發現的效力最強的凝血酶直接抑制劑。水蛭素由醫用吸血水蛭頭部唾液腺提取純化而得，含65-66個胺基酸的小肽，能特異地抑制凝血酶的活性。水蛭素可與凝血酶的催化位點和纖維蛋白原識別位點結合，抑制凝血酶將纖維蛋白原轉化成纖維蛋白而達到抗凝血功能；此外，還可使凝血酶誘導的血小板聚集功能受抑，使成纖維細胞、內皮細胞和血管平滑肌細胞的激活受抑制，從而發揮特導性抗凝和抗栓作用。目前重組水蛭素在臨床上均採用注射給藥方式，已證明具有用量小，免疫原性弱，無明顯毒副作用，不易通過血腦屏障，注射給藥後大多數以原形從尿中排洩，其血藥濃度和凝血功能指標相關性好，便於檢測之優點，故在國外的抗凝治療中已有取代肝素的趨勢。由於天然水蛭素的來源有限，應用基因工程技術生產的重組水蛭素獲得了極大的成功。重組水蛭素和天然水蛭素具有相同的生物活性，由酵母表達製備的重組水蛭素已由諾華公司和赫切斯特公司分別開發上市，用於治療肝素引起的血小板減少症和接受關節置換術患者的術後治療。
天然水蛭素是一個由多種變異體組成的家族，已發現的變異體達十餘種，其中主要是HV1、HV2和HV3三型。應用蛋白工程技術和基因工程技術對水蛭素的改造，可獲得水蛭素的突變體如HV1-HV2的雜交型，HV2-K47突變型等。以上各種水蛭素的變異體和突變體表達體系不僅在原核系統的大腸桿菌，在真核系統的酵母和昆蟲中均有成功報導。重組水蛭素與天然水蛭素在結構上的最大差異在於其63位酪氨酸殘基上無硫酯化，但相關資料認為有無硫酯化對水蛭素的抗凝血酶作用無影響。
早期研究發現水蛭唾液腺提取物口服給藥後具有一定的抗凝效果，因此，用水蛭製成的中藥口服膠囊已在臨床上用於治療瘀血症。後續研究發現，水蛭素對胃蛋白酶十分敏感，對胰蛋白酶有一定的抗性。水蛭素在酸性條件下不穩定，但對熱穩定。用重組水蛭素水溶液在十二指腸給藥的動物模型中證明，水蛭素可以由腸道黏膜吸收入血，但生物利用度低。大劑量的重組水蛭素溶液(5mg/kg)直接灌胃給藥的動物實驗顯示能起到一定的抗凝血作用。國外專利報導用脂質體製成的重組水蛭素口服劑型在0.1-1.0mg/kg劑量範圍內，在動物實驗中有顯著的抗血栓形成的作用。從而證明重組水蛭素可以由腸黏膜吸收進入血液，並起到一定的抗凝血功效。
本專利在綜合考慮重組水蛭素的腸黏膜吸收特性和對胃腸蛋白敏感及低pH不穩定的因素基礎上，發明了加入保護穩定劑如人血清白蛋白和甘露醇，加入胃腸蛋白酶抑制劑如抑肽酶的一種新型重組水蛭素腸溶緩釋口服製劑。有關資料表明抑肽酶可廣泛抑制多種胃腸道消化酶的蛋白水解作用，從而提高口服蛋白的生物利用度，現已成為蛋白質口服劑型中最常用的酶抑制劑。另該製劑的最大優點在於重組水蛭素在胃溶液中不被釋放，因此能避開胃蛋白酶和胃酸的降解作用；加入蛋白質的穩定劑和酶抑制劑，使重組水蛭素在腸液中緩釋後抵制消化道蛋白酶的降解作用。從而有效地提高其腸道吸收的生物利用度，起到顯著的抗凝血功能。由於重組水蛭素的熱穩定性，將其按實例中的方法製備成的腸溶緩釋劑型有很好的穩定性。因此，本發明的重組水蛭素口服腸吸收緩釋制型具有性質穩定，口服方便、生物利用度好和抗凝血、抗血栓的功效。
藥物口服製劑有多種，其中腸溶和腸吸收製劑主要在於主藥成份應於腸道中釋放並吸收。通過添加各種相應的劑型輔料包括成形劑、粘合劑、骨架劑等，製成臨床上常用的片劑或膠囊。隨著劑型的發展，普通釋放製劑已發展到緩釋，控釋製劑階段。這方面的技術已相當成熟，並得到了臨床的廣泛應用。本發明的重組水蛭素口服腸溶緩釋製劑主要指按緩釋方法製備成的片劑或膠囊，經動物實驗證明有良好的抗凝血和抗血栓形成的功效。發明實例一、重組水蛭素的製備重組水蛭素HV1變異體65個胺基酸序列為ValValTyrThrAspCysThrGluSerGlyGlnAsnLeuCysLeuCysGluGlySerAsnValCysGlyGlnGlyAsnLysCysIleLeuGlySerAspGlyGluLysAsnGlnCysValThrGlyGluGlyThrProLysProGlnSerHisAsnAspGlyAspPheGluGluIleProGluGluTyrLeuGln，重組水蛭素HV2-K47突變體(HV2型突變體47位胺基酸變異為賴氨酸)65個胺基酸序列為IleThrTyrThrAspCysThrGluSerGlyGlnAsnLeuCysLeuCysGluGlySerAsnValCysGlyLysGlyAsnLysCysIleLeuGlySerAsnGlyLysGlyAsnGlnCysValThrGlyGluGlyThrProLysProGluSerHisAsnAsnGl
yAspPheGluGluIleProGluGluTyrLeuGln兩種重組水蛭素相對應的CDNA序列由人工合成，嵌入畢節酵母分泌型表達質粒PIC9k的XhoI和EcoRI中，重組質粒篩選後分別命名為PIC-HV1和PIC-K47。轉化畢節酵母宿主菌GS115，表達篩選相應的工程菌標示為GS-HV1和GS-K47。表達篩選用標準的抗凝血酶活性測定的Chromozym T方法。兩種表達重組水蛭素HV1和HV2-K47工程菌經發酵，純化得到純度大於95％，N末端胺基酸序列分析與理論設計值完全一致。其中重組水蛭素HV1比活性為14000ATU/mg，重組水蛭素HV2-K47比活性為15500ATU/mg。二、重組水蛭素口服腸溶包衣緩釋片的製備重組水蛭素HV1溶液用Lowry法測定蛋白濃度後，按1克中加20克甘露醇，2.5克人血清白蛋白，0.5克抑肽酶後過濾凍幹成白色乾粉。按以下組分取量按以下組分取量重組水蛭素HV1 1g 主藥人血清白蛋白 2.5g 保護劑抑肽酶 0.5g 穩定劑甘露醇 20g 保護劑微晶纖維素 150g 粘合劑羥丙基甲基纖維素 125g 緩釋骨架材料a-乳糖 150g 稀釋劑硬脂酸鎂5g 潤滑劑將重組水蛭素、人血清白蛋白、抑肽酶、甘露醇、a-乳糖、微晶纖維素和羥丙基甲基纖維素幹法混勻，以水潤溼制軟材，過16目篩制粒，經真空減壓乾燥後過14目篩整粒，再加入硬脂酸鎂壓片得片心。片心重量280mg，含重組水蛭素HV1 0.5mg，共2000片。腸溶包衣按以下組分取量聚丙烯酸II號樹脂17.2gIII號樹脂 17.2g85％乙醇26.6ml鈦白粉8.6g吐溫804.3ml蓖麻油13ml檸檬黃0.5g滑石粉8.6g將II、III號樹脂置於容器中，加95％乙醇攪拌，使其完全溼潤，放置12-24小時使其完全溶解，再加入其它成分製成混懸液，將片心加熱到35℃左右，噴上包衣後乾燥。每片包衣膜重量為4mg。
按本法可同樣製備腸溶包衣釋緩重組水蛭素HV2-K47片劑。三、重組水蛭素口服腸溶緩釋膠囊的製備重組水蛭素HV2-k47溶液用Lowry法測定蛋白濃度後，按1g中加20g甘露醇，2.5g人血清白蛋白，0.5g抑肽酶後過濾凍幹成白色乾粉。按以下組分取量重組水蛭素HV2-k47 1g 主藥人血清白蛋白25g保護劑抑肽酶 0.5g 穩定劑甘露醇 20g保護劑蔗糖115g 丸芯澱粉115g 丸芯聚乙烯吡咯烷酮 10g粘合劑乙基纖維素 24.9g 包衣材料羥丙基纖維素8.3g 包衣材料丙醇3.3ml 溶劑乙醇660ml 溶劑取30-40目空白丸芯240g(蔗糖115g，澱粉115g，聚乙烯吡咯烷酮10g)置旋轉包衣鍋內，將重組水蛭素、甘露醇、抑肽酶、白蛋白凍乾粉溶於水，噴霧至空白丸芯上乾燥，直至製得重組水蛭素含量為3％的小丸，再用乙基纖維素和羥丙基纖維素和含丙醇的乙醇溶液噴霧包衣至增重10％，乾燥過篩後取20-30目小丸裝入不透明的2號腸溶空白膠囊中即得。每粒膠囊裝量為250mg，含重組水蛭素HV2-k47 0.5mg，共2000粒。按本法同樣可製備腸溶緩釋重組水蛭素HV1膠囊。四.重組水蛭素口服腸溶緩釋膠囊預防給藥對紐西蘭家兔頸靜脈血栓形成的抑制作用紐西蘭家兔45隻，體重2.5kg左右，隨機分為7組對照組為不含重組水蛭素的相同腸溶緩釋膠囊。口服緩釋膠囊HV1和HV2-K47分別為100、250、500ATU/kg 3個劑量組。
家兔實驗前禁食12小時，不禁水。按以上劑量給藥後1小時麻醉家兔，分離局部頸靜脈，置入3cm長的棉線，並在該段靜脈的遠心端和近心端用帶套管的血管夾夾閉，30分鐘後去除兩端的血管夾以恢復血流。90分鐘後從靜脈內取出附有血栓的棉線，80℃加熱1小時烘乾並稱重。計算血栓形成抑制率，結果如下重組水蛭素口服腸溶緩釋膠囊對紐西蘭家兔頸靜脈血栓形成的影響組別 劑量(ATU/kg)血栓重量(mg)血栓形成抑制率(％)對照組 0 34.5-緩釋膠囊 HV1 100 28.417.7250 17.748.7500 7.8 77.4HV2-K47 100 27.520.3250 15.944.0500 8.5 75.4五.重組水蛭素口服腸溶緩釋膠囊對大鼠的抗凝作用。
大鼠50隻，體重150-200克，隨機分成8組，對照組為不含重組水蛭素的同樣腸溶緩釋膠囊，實驗組為重組水蛭素HV1和HV2-K47各三個劑量組分別100ATU/kg、250ATU/kg、500ATU/kg。口服灌胃每日二次，連續給藥三天。分別於給藥前，給藥後3大和停約後1天測定血清中ATPP值。重組水蛭素口服腸溶緩釋膠囊對大鼠凝血功能的影響APTT值劑量 增加增加組別 0天 給藥後3天停藥後1天(ATU/kg)(％)(％)對照組 0 18.7 17.818.2緩釋膠囊HV1 100 24.1 35.4 20.1 10.4250 31.8 78.6 25.3 39.0500 38.2 114.6 30.1 65.3HV2-K47 100 24.9 39.9 20.9 14.8250 35.2 97.2 26.2 43.9500 41.3 132.0 30.9 69.8以上實驗結果證明給大鼠口服腸溶緩釋重組水蛭素膠囊後對凝血功能有顯著改善。其中重組水蛭素HV1和HV2-K47對APTT的延長作用一致。
權利要求
1.本發明是一種含重組水蛭素的抗凝藥物製劑，其特徵為經口服後腸溶緩釋吸收。
2.權利要求1所述的重組水蛭素，包括重組水蛭素的各種變異體和突變體。
3.權利要求1.2所述的重組水蛭素口服腸溶緩釋劑型，其特徵組成為重組水蛭素每1mg中含有甘露醇10mg，人血清白蛋白2.5mg，抑肽酶0.5mg。
4.權利要求3中人血清白蛋白為穩定保護劑，其範圍為重組水蛭素質量的2-5倍，抑肽酶為蛋白酶抑制劑，其範圍為重組水蛭素質量的0.2-1.0倍。
5.權利要求3，4中重組水蛭素腸溶緩釋劑型，其特徵為加入相應的劑型輔料製成的腸溶包衣緩釋片劑或膠囊。
全文摘要
本發明涉及重組水蛭素(hirudin)口服腸溶緩釋製劑的組分、製備和應用範圍，經動物試驗證實，該類製劑口服給藥對家兔頸靜脈血栓形成有明顯的抑制作用，對大鼠外周血有顯著的抗凝功能。該製劑能有效防止胃腸蛋白酶對重組水蛭素的降解作用，適用於有血栓形成傾向患者的抗凝治療。
文檔編號A61P9/10GK1428173SQ0113377
公開日2003年7月9日 申請日期2001年12月25日 優先權日2001年12月25日
發明者範開, 黃洪濤, 張益 , 王建 申請人:重慶富進生物醫藥有限公司