利用竹節參細胞培養和生物轉化技術獲得竹節參次生代謝產物的方法
2023-05-26 01:47:11
專利名稱：利用竹節參細胞培養和生物轉化技術獲得竹節參次生代謝產物的方法
技術領域：
本發明屬於植物細胞培養工程領域，特別涉及一種利用竹節參細胞培養和生 物轉化技術獲得竹節參次生代謝產物的方法，尤其是涉及利用竹節參細胞大規模 培養和生物轉化技術獲得竹節參皂苷等化合物的方法。
背景技術：
竹節參(屍朋au'a/ o/2ic^s C.A.Mey)又名竹節人參或白三七，是五加科人 參屬植物。分布於我國江西、湖北、廣西、四川、貴州、雲南、西藏等省區的高 山灌木叢下，陰溼地或巖石溝澗旁邊。它有許多的異名，《中藥大辭典》上就說不同的書籍中有不同的稱謂，如土參、土精、血參(《花鏡》)，甜七、竹節七(《草本便方》)，竹節參(《科學的民間藥草》)，竹鞭三七、羅漢三七(《中 國藥植志》)，竹節七、竹七(《中藥形性經驗鑑別法》)，蘿蔔七、白三七(《中 藥材品種論述》)，水三七(《貴州草藥》)，明七、野三七、雞頭七(《雲南 經濟植物》)，這種種紛雜的異稱，足見竹節參在中藥藥用中的歷史和地位。民間用於滋補強壯，散瘀止痛，止血等。對於竹節參的作用早有記載，如《草本 便方》中有雲"散血活血破血，治癰腫，療犬傷，金刀，跌扑……"近年來又 由於有報導證實竹節參皂大甙具有擴張冠狀動脈、降低心肌氧耗作用。同時發現
竹節參皂甙能使小鼠心肌細胞內CAMP/CGMP比值明顯升高，此作用與其增強心力， 擴張冠狀動脈有關，其藥用價值潛力巨大，成為一個研究熱點。竹節參的生長緩慢，每年生1節，生物量極為有限，作為藥用的野生竹節參 一般在5年 數十年生不等。據統計我國的竹節參儲量只有2噸左右，屬於珍稀 名貴藥材，目前只是在湖北山區和川西南山區被當地醫生有條件使用，在各大城 市醫院和藥店不見銷售。雖然在江西、湖南、湖北等地有人進行人工栽培，但是 由於其生長量有限，且繁殖困難，又易受病蟲害的困擾，長期以來很難實現大面 積人工栽培。因此利用生物技術大規模生產其替代產品，並且開發成治療心腦血 管疾病的特效新藥具有重要的經濟價值和社會價值。 為此清華大學化工系生化所經過數年研究開發出了一套為了將竹節參的自 然生產方式轉變為工業化生產方式的新技術。該技術的應用可以大幅度減少人們 對野生資源的採摘和依賴，同時可以大量獲得人們所需求的竹節參製品。為人們 對於竹節參的藥用價值進行深入研究奠定物質基礎，為廣大患者提供更優良的廉 價藥物。發明內容本發明的目的是提供一種利用竹節參細胞培養和生物轉化技術生產竹節參 次生代謝產物的方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟(1) 在鼎培養基中，添加a—萘乙酸(NAA)、 2,4-D或卩引哚乙酸(IAA)O. l 10呢/L和6 —卞氨基嘌呤(6 — BA)或激動素(KT)0. 1 10mg/L，蔗糖或葡萄糖20 50g/L，然後用酸或鹼將pH值調整到5.5 7.0，再添加1. 8 8g/L凝固劑，在 115 12(TC， 0. lMPa壓力下消毒15分鐘後，經冷卻製成斜面誘導培養基；(2) 將竹節參幼莖或幼芽作為外植體經70%乙醇表面殺菌30 50秒，然後 再放入5 10%次氯酸鈉或次氯酸鈣溶液中殺菌10 20分鐘，用無菌水衝洗三次 後，在無菌條件下將表面殺菌後的莖尖切下來，或將其幼莖切成lmra長的莖段， 接種到上述斜面誘導培養基中，之後轉移到18 25°C， 2000 3000 Lux， 12 16 小時照光條件下進行誘導培養，1 2個月後形成愈傷組織；(3) 在RW培養基中，添加0.1 5mg/L a—萘乙酸(NAA)、 2, 4—D或卩引哚 乙酸(IAA)， 0. 1 5mg/L和6 —卞氨基嘌呤(6—BA)或激動素(KT) ， 20 50g/L 蔗糖、1.8 8g/L凝固劑,經115 12(TC， 0. 1 0.15MPa壓力下消毒15分鐘後 經冷卻d成平板馴化培養基；(4) 將上述誘導形成的愈傷組織，在上述馴化培養基中進行反覆馴化繼代 培養後，可以篩選出生長速度快，質地疏鬆的高產細胞株；(5) 在RW培養基的基礎上，添加蔗糖20 40g/L， a—萘乙酸(NAA)， 2， 4 一D或吲哚乙酸(IAA) 0. 1 2mg/L， 6—卞氨基嘌呤(6—BA)或激動素(KT) 0. l 2mg/L，然後用酸或鹼將pH值調整到5.5 7.0，再添加1. 8 8g/L凝固劑，在 115 12(TC， 0. lMPa壓力下消毒15分鐘後經冷卻製成大型平面擴增培養基或者 取消凝固劑做成液體培養基；(6) 將上述高產細胞株接種在擴增培養基上，在20 25r，黑暗條件下培 養4 5周後，可以獲得大量高活力細胞，液體培養時搖床或生物反應器的轉速 為80 120轉/分；(7) 在fW培養基中，添加葡萄糖20 50g/L， a—萘乙酸(NM)， 2， 4一D 或吲哚乙酸(IAA) 0. l 2mg/L，6 —卞氨基嘌呤(6—BA)或激動素(KT)O. 1 2mg/L， 再添加組合前體(40 150mg)和組合誘導子(80ug 60mg)，用酸或鹼將pH 值調整到5. 5 7. 0，在115 120°C， 0. 1 0. 15MPa壓力下消毒15分鐘後製成 合成培養基；(8) 將上述擴增的高活力竹節參愈傷組織細胞接種到上述合成培養基內， 在25 3(TC，避光條件，80 120轉/分的搖床或大型生物反應器中懸浮培養1 周，過濾收穫細胞，培養液經調整後可返回反應器繼續反覆利用；(9) 將收穫細胞移送到提取灌中，經過高速攪拌(300 400轉/分)破碎， 經溶劑萃取和減壓濃縮獲得粗提物，再經過分離純化獲得竹節參皂苷等化合物所述組合誘導子組成為赤黴素2 5mg/L、水楊酸20 90mg/L、過氧化氫20 80yl/L、酵母提取物0. 5 2g/L。 所述凝固劑為瓊脂或Gellan Gum。所述組合前體為丙酮酸鈉40 80mg/L、乙酸酐20 40 u 1/L和番茄汁100 200ml/L。本發明的有益效果是將竹節參的自然生產方式轉變為工業化生產方式。該技 術的應用可以大幅度減少人們對野生資源的採摘和依賴，同時可以大量獲得人們 所需求的竹節參製品。為人們對於竹節參的藥用價值進行深入研究奠定物質基 礎，為廣大患者提供更優良的廉價藥物。具體實施例本發明提供一種利用竹節參細胞培養和生物轉化技術生產竹節參次生代謝 產物的方法下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。
實例一(1) 在改良的RW培養基中，添加a—萘乙酸(NAA)2mg/L和6 —卞氨基嘌呤 (6—BA)4mg/升，蔗糖20g/L，然後用酸或鹼將pH值調整到5. 5 7. 0，再添加 1. 9g/L Gellan Gum，在U5。C， 0. 1MPa壓力下消毒15分鐘後，經冷卻製成斜面 誘導培養基；(2) 將竹節參幼莖或幼芽作為外植體經70% (v/V)乙醇表面殺菌50秒，然 後再放入5^(v/v)次氯酸鈉溶液中殺菌20分鐘，用無菌水衝洗三次後，在無菌 條件下將表面殺菌後的莖尖切下來，接種到上述斜面誘導培養基中。之後轉移到 25°C， 2000Lux， 12小時照光條件下進行誘導培養，l個月後形成愈傷組織；(3) 在改良的RW培養基中，添加lmg/L a—萘乙酸(NAA)， 2mg/L和6 —卞 氨基嘌呤(6—BA)， 30g/L蔗糖、L9GellanGum，經115。C， 0. lMPa壓力下消毒 15分鐘後經冷卻製成平板馴化培養基；(4) 將上述誘導形成的愈傷組織，在上述馴化培養基中進行反覆馴化繼代 培養後，可以獲得生長速度快，質地疏鬆的高產細胞系；(5) 在改良RW培養基的基礎上，添加蔗糖40g/L， a —萘乙酸(NAA)O. 8mg/L， 6—卞氨基嘌呤(6-BA)0. 5mg/L，然後用酸或鹼將pH值調整到5. 5 7. 0，再添加 1.9g/L Gellan Gum (是國內外常用的多糖類物質)，在115。C， 0.1MPa壓力下 消毒15分鐘後經冷卻製成大型平面擴增培養基或取消凝固劑做成液體培養基；(6) 將上述高產細胞株接種在擴增培養基上，在25'C，黑暗條件下培養4 周后，可以獲得大量高活力細胞。液體培養時搖床或生物反應器的轉速為80 120 轉/分；(7) 在RW培養基中，添加葡萄糖30g/U a—萘乙酸(NAA) 0.2呢/L, 6 — 卞氨基嘌呤(6—BA) 0. 2mg/L，再添加組合前體(包括丙酮酸鈉40mg/L、乙酸酐 20ul/L和番茄汁100ml/L)和組合誘導子(赤黴素2mg/L、水楊酸30p 1/L、過 氧化氫25"1/L、酵母提取物1.0%)，用酸或鹼將pH值調整到5.5 7.0，在 115°C， 0.1MPa壓力下消毒15分鐘後製成合成培養基；(8) 將上述擴增的高活力竹節參愈傷組織細胞接種到上述合成培養基內，在28。C，避光條件，100轉/分的搖床或大型生物反應器中懸浮培養1周，過濾收穫細胞，培養液經調整後可返回反應器繼續反覆利用；(9)將收穫細胞移送到提取灌中，經過高速攪拌(300轉/分)破碎，經溶劑萃取和減壓濃縮獲得粗提物一竹節參皂苷粗提物及其副產物，再經過純化獲得竹節參總皂苷10%以上，竹節參多糖5%以上以及其它化合物。實例二(1) 在改良的CT培養基中，添加吲哚乙酸(IAA)2mg/L和激動素(KT) 4mg/ 升，蔗糖20g/L，然後用酸或鹼將pH值調整到5.5 7.0，再添加1. 9g/L Gellan Gum，在115'C， 0. lMPa壓力下消毒15分鐘後，經冷卻製成斜面誘導培養基；(2) 將竹節參幼莖或幼芽作為外植體經70%乙醇表面殺菌30秒，然後再放 入8W次氯酸鈣溶液中殺菌i5分鐘，用無菌水衝洗三次後，在無菌條件下將表面 殺菌後的莖尖切下來，接種到上述斜面誘導培養基中。之後轉移到25。C，2000Lux， 14小時照光條件下進行誘導培養，1個月後形成愈傷組織；(3) 在改良的RW培養基中，添加lmg/L a—萘乙酸(NAA)， 2mg/L和激動 素(KT) ， 30g/L蔗糖、1.9GellanGum，經115。C， 0. lMPa壓力下消毒15分鐘 後經冷卻製成平板馴化培養基；(4) 將上述誘導形成的愈傷組織，在上述馴化培養基中進行反覆馴化繼代 培養後，可以獲得生長速度快，質地疏鬆的高產細胞系；(5) 在改良RW培養基的基礎上，添加蔗糖30g/L，添加B引哚乙酸(IAA) lmg/L 和激動素(KT) lmg/升，然後用酸或鹼將pH值調整到5. 5 7.0，再添加1.9g/L Gellan Gum，在115t:， 0. lMPa壓力下消毒15分鐘後經冷卻製成大型平面擴增 培養基或取消凝固劑做成液體培養基；(6) 將上述高產細胞株接種在擴增培養基上，在2(TC，黑暗條件下培養4 周后，可以獲得大量高活力細胞。液體培養時搖床或生物反應器的轉速為80 120 轉/分；(7) 在RW培養基中，添加葡萄糖40g/L， a—萘乙酸(NAA) 0.4mg/L，激動 素(KT) 0.2mg/L，再添加組合前體(包括丙酮酸鈉60mg/L、乙酸酐30ul/L和
番茄汁150ml/L)和組合誘導子(赤黴素3mg/L、水楊酸90mg/L、過氧化氫30u 1/L、酵母提取物1.5%)，用酸或鹼將pH值調整到5. 5 7.0，在115。C， 0. lMPa 壓力下消毒15分鐘後製成合成培養基；(8) 將上述擴增的高活力竹節參愈傷組織細胞接種到上述合成培養基內， 在29"C，避光條件，90轉/分的搖床或大型生物反應器中懸浮培養1周，過濾收 獲細胞，培養液經調整後可返回反應器繼續反覆利用；(9) 將收穫細胞移送到提取灌中，經過高速攪拌(350轉/分)破碎，經溶 劑萃取和減壓濃縮獲得粗提物一竹節參皂苷粗提物及其副產物，再經過純化獲得 竹節參總皂苷10%以上，竹節參多糖5%以上以及其它化合物。實例三(1) 在改良的RW培養基中，添加2， 4一D 1.5mg/L和6—卞氨基嘌吟(6 — BA)3mg/升，蔗糖20g/L，然後用酸或鹼將pH值調整到5. 5 7. 0，再添加6g/L 瓊脂，在120。C， 0. 15MPa壓力下消毒15分鐘後，經冷卻製成斜面誘導培養基；(2) 將竹節參幼莖或幼芽作為外植體經70%乙醇表面殺菌40秒，然後再放 入10%次氯酸鈉溶液中殺菌10分鐘，用無菌水衝洗三次後，在無菌條件下將表 面殺菌後的莖尖切下來，接種到上述斜面誘導培養基中。之後轉移到25°〇， 2000Lux， 16小時照光條件下進行誘導培養，l個月後形成愈傷組織；(3) 在改良的RW培養基中，添加0. 8mg/L 2, 4-D， 0. 5mg/L和6 —卞氨基嘌 呤(6—BA)， 30g/L蔗糖、6g/L瓊脂，經120。C， 0. 15MPa壓力下消毒15分鐘後 經冷卻製成平板馴化培養基；(4) 將上述誘導形成的愈傷組織，在上述馴化培養基中進行反覆馴化繼代 培養後，可以獲得生長速度快，質地疏鬆的高產細胞系；(5) 在改良RW培養基的基礎上，添加蔗糖30g/L， 2，4-D 0. 5mg/L， 6—卞 氨基嘌呤(6—BA)0.3mg/L，然後用酸或鹼將pH值調整到5. 5 7. 0，再添加6g/L 瓊脂，在12(TC， 0. 15MPa壓力下消毒15分鐘後經冷卻製成大型平面擴增培養基 或取消凝固劑做成液體培養基；(6) 將上述高產細胞株接種在擴增培養基上，在22匸，黑暗條件下培養4
周后，可以獲得大量高活力細胞。液體培養時搖床或生物反應器的轉速為80 120 轉/分；(7) 在RW培養基中，添加葡萄糖50g/L, 2,4-D 0. 4mg/L， 6—卞氨基嘌呤 (6—BA)0.4mg/L，再添加組合前體(包括丙酮酸鈉70mg/L、乙酸酐25ul/L和番 茄汁130ml/L)和組合誘導子(赤黴素4mg/L、水楊酸40mg/L、過氧化氫20 u 1/L、 酵母提取物1.3%)，用酸或鹼將pH值調整到5.5 7.0，在120。C， 0. 15MPa壓 力下消毒15分鐘後製成合成培養基；(8) 將上述擴增的高活力竹節參愈傷組織細胞接種到上述合成培養基內， 在3(TC，避光條件，110轉/分的搖床或大型生物反應器中懸浮培養1周，過濾 收穫細胞，培養液經調整後可返回反應器繼續反覆利用；(9) 將收穫細胞移送到提取灌中，經過高速攪拌(400轉/分)破碎，經溶 劑萃取和減壓濃縮獲得粗提物一竹節參皂苷粗提物及其副產物，再經過純化獲得竹節參總皂苷10%以上，竹節參多糖5%以上以及其它化合物。
權利要求
1.一種利用竹節參細胞培養和生物轉化技術生產竹節參次生代謝產物的方法，其特徵在於，包括以下步驟1)在RW培養基中，按每升培養液添加蔗糖或葡萄糖20～50g，植物生長激素0.1～5mg和植物細胞分裂素0.1～5mg，將pH值調整到5.5～7.0，再添加1.8～8g/L凝固劑，在115～120℃，0.1MPa壓力下消毒15分鐘後，經冷卻製成斜面誘導培養基；2)將竹節參的外植體經表面殺菌，在無菌條件下接種在誘導培養基中，25℃避光條件下培養1～2個月誘導形成愈傷組織；3)將竹節參愈傷組織接種在生長培養基上擴增，25℃避光條件下培養1個月獲得大量細胞；4)在RW培養基中添加組合前體40～150mg和組合誘導子80μg～60mg，製成合成培養基；5)將大量擴增的愈傷組織細胞接種到合成培養液中，在25℃避光條件下振蕩培養1周後收穫細胞；6)用溶劑萃取收穫細胞獲得竹節參皂苷粗提物及其副產物，再經過純化獲得竹節參皂苷，竹節參多糖以及其它化合物。
2. 根據權利要求1所述利用竹節參細胞培養和生物轉化技術生產竹節參次生 代謝產物的方法，其特徵在於，所述植物生長激素為6 —卞氨基嘌呤(6—BA)或激 動素(KT)。
3. 根據權利要求1所述利用竹節參細胞培養和生物轉化技術生產竹節參次生 代謝產物的方法，其特徵在於，所述植物細胞分裂素為a—萘乙酸(NAA)、 2，4-D 或噴哚乙酸(IAA)。
4. 根據權利要求1所述利用竹節參細胞培養和生物轉化技術生產竹節參次生 代謝產物的方法，其特徵在於，所述組合誘導子的組成為赤黴素2 5mg/U水楊 酸20 90mg/L、過氧化氫20 80y 1/L、酵母提取物0. 5 2g/L。
5. 根據權利要求1所述利用竹節參細胞培養和生物轉化技術生產竹節參次生代謝產物的方法，其特徵在於，所述凝固劑為瓊脂或Gellan Gum。
6. 根據權利要求1所述利用竹節參細胞培養和生物轉化技術生產竹節參次生 代謝產物的方法，其特徵在於，所述組合前體為丙酮酸鈉40 80mg/L、乙酸酐 20 40 u 1/L和番茄汁100 200ml/L。
7. 根據權利要求1所述利用竹節參細胞培養和生物轉化技術生產竹節參次生 代謝產物的方法，其特徵在於，該方法具體步驟如下(1) 在RW培養基中，添加a—萘乙酸(NAA)、 2， 4-D或吲哚乙酸(IAA)0. l 10mg/L和6 —卞氨基嘌呤(6—BA)或激動素(KT)0.廣10mg/L，蔗糖或葡萄糖20 50g/L，然後用酸或鹼將pH值調整到5.5 7.0，再添加1. 8 8g/L凝固劑，在 115 12(TC， 0. lMPa壓力下消毒15分鐘後，經冷卻製成斜面誘導培養基；(2) 將竹節參幼莖或幼芽作為外植體經70%乙醇表面殺菌30 50秒，然後 再放入5 10%次氯酸鈉或次氯酸銬溶液中殺菌10 20分鐘，用無菌水衝洗三次 後，在無菌條件下將表面殺菌後的莖尖切下來，或將其幼莖切成lmm長的莖段， 接種到上述斜面誘導培養基中，之後轉移到18 25°C， 2000 3000 Lux， 12 16 小時照光條件下進行誘導培養，1 2個月後形成愈傷組織；(3) 在RW培養基中，添加0.1 5mg/L a—萘乙酸(NAA)、 2， 4一D或吲哚 乙酸(IAA)， 0. 1 5mg/L和6 —卞氨基嘌呤(6—BA)或激動素(KT) ， 20 50g/L 蔗糖、1.8 8g/L凝固劑，經115 120。C， 0. 1 0. 15MPa壓力下消毒15分鐘後 經冷卻製成平板馴化培養基；(4) 將上述誘導形成的愈傷組織，在上述馴化培養基中進行反覆馴化繼代 培養後，可以篩選出生長速度快，質地疏鬆的高產細胞株；(5) 在RW培養基的基礎上，添加蔗糖20 40g/L， a—萘乙酸(NAA)， 2， 4 一D或吲哚乙酸(IAA) 0. l 2mg/L， 6—卞氨基嘌呤(6—BA)或激動素(KT) 0. l 2mg/L，然後用酸或鹼將pH值調整到5.5 7.0，再添加1. 8 8g/L凝固劑，在 115 12(TC， 0. lMPa壓力下消毒15分鐘後經冷卻製成大型平面擴增培養基或者 取消凝固劑做成液體培養基； (6) 將上述高產細胞株接種在擴增培養基上，在20 25。C，黑暗條件下培 養4 5周後，可以獲得大量高活力細胞，液體培養時搖床或生物反應器的轉速 為80 120轉/分；(7) 在RW培養基中，添加葡萄糖20 50g/L， a—蔡乙酸(NAA)， 2， 4一D 或吲哚乙酸(IAA) 0. 1 2mg/L，6 —卞氨基嘌呤(6—BA)或激動素(KT)0. 1 2mg/L， 再添加組合前體40 150mg和組合誘導子80 ti g 60mg，用酸或鹼將pH值調整到 5. 5 7. 0，在115 12(TC， 0. 1 0. 15MPa壓力下消毒15分鐘後製成合成培養基；(8) 將上述擴增的高活力竹節參愈傷組織細胞接種到上述合成培養基內， 在25 30。C，避光條件，80 120轉Z分的搖床或大型生物反應器中懸浮培養1 周，過濾收穫細胞，培養液經調整後可返回反應器繼續反覆利用；(9) 將收穫細胞移送到提取灌中，經過高速攪拌(300 400轉/分)破碎， 經溶劑萃取和減壓濃縮獲得粗提物，再經過分離純化獲得竹節參皂苷等化合物。
全文摘要
本發明公開了屬於植物細胞培養工程領域的一種利用竹節參細胞培養和生物轉化技術獲得竹節參次生代謝產物的方法。在改良的RW培養基中，加蔗糖、植物生長激素和植物細胞分裂素，再加入凝固劑經高溫消毒，經冷卻後製成誘導培養基；將竹節參的外植體在無菌條件下接種在誘導培養基中誘導形成愈傷組織；經擴增，獲得大量細胞；在合成培養基中將大量擴增的愈傷組織細胞接種到合成培養液中，用溶劑萃取收穫細胞獲得竹節參皂苷粗提物及其副產物，再經過純化獲得竹節參皂苷，竹節參多糖以及其它化合物。利用本發明所述方法可以生產出竹節參的次生代謝產物，生產成本低，培養周期短，不受自然環境限制，可以實現周年生產。
文檔編號C12N5/04GK101113430SQ20071011774
公開日2008年1月30日 申請日期2007年6月22日 優先權日2007年6月22日
發明者孫瑞強, 郭志剛 申請人:清華大學