小分子增強胰腺內分泌細胞中的MAFA表達的用途的製作方法
2023-05-26 02:16:21 1
本申請要求2014年5月16日提交的美國臨時專利申請序列號61/994,259的權益，該申請全部內容據此以引用方式併入本文以用於所有目的。
技術領域
本發明涉及用於多能幹細胞的分化的方法，以及由此產生的細胞和群體。具體地講，本發明涉及某些小分子生成胰腺內分泌細胞和此類細胞群的用途，所述細胞和細胞群表現出增加的MAFA表達。
背景技術：
用於Ⅰ型糖尿病的細胞替代療法的進展以及可移植胰島的缺乏已使得人們把注意力集中在開發適於移植的胰島素分泌細胞或β細胞的來源上。一種方法是由多能幹細胞諸如胚胎幹細胞生成功能性β細胞。
在脊椎動物胚胎發育中，多能細胞可在稱為原腸胚形成的過程中產生包括三個胚層(外胚層、中胚層和內胚層)的細胞群。組織(諸如甲狀腺、胸腺、胰腺、腸和肝臟)將從內胚層經由中間階段發育而來。該過程中的中間階段是定形內胚層的形成。
到原腸胚形成為止，內胚層劃分成可通過一組因子的表達來識別的前-後結構域，所述因子唯一地標記內胚層的前、中和後區。例如，HHEX和SOX2識別內胚層的前區，而CDX1、CDX2和CDX4識別內胚層的後區。
內胚層組織的遷移使內胚層與不同的中胚層組織緊密接近，這有助於腸管的分區。這通過多種分泌因子，諸如成纖維細胞生長因子(「FGF」)、WNTS、轉化生長因子β(「TGF-β」)、視黃酸、和骨形態發生蛋白質(「BMP」)配體以及它們的拮抗劑來實現。例如，FGF4和BMP促進預定後腸內胚層中的CDX2表達並阻遏前基因HHEX和SOX2的表達(2000Development,127:1563 1567)。還證明了WNT信號轉導與FGF信號轉導並存，能夠促進後腸發育並控制前腸命運(2007Development,134:2207 2217)。最後，由間充質分泌的視黃酸調控前腸-後腸邊界(2002Curr.Biol.,12:1215-1220)。
特異性轉錄因子的表達水平可用於指定組織的身份。在定形內胚層轉化成原腸管的過程中，腸管變得分區成廣泛結構域，所述廣泛結構域可通過限制性基因表達模式在分子水平上進行觀察。腸管中分區的胰腺域顯示出PDX1具有極高表達，但CDX2和SOX2的表達卻非常低。PDX1、NKX6.1/PTFlA和NKX2.2在胰腺組織中高度表達；而CDX2在腸組織中高度表達。
胰腺形成源於定形內胚層分化成胰腺內胚層。背側和腹側胰腺域產生自前腸上皮。前腸還會分化成食道、氣管、肺、甲狀腺、胃、肝和膽管系統。
胰腺內胚層細胞表達胰十二指腸同源盒基因PDX1。在不存在PDX1時，胰腺形成腹胰芽和背胰芽後不再發育。因而，PDX1表達標誌著胰腺器官發生中的一個關鍵步驟。成熟胰腺由胰腺內胚層分化產生的外分泌組織和內分泌組織構成。
D』Amour等人描述了在高濃度活化素和低血清的存在下，產生人胚胎幹細胞衍生的定形內胚層的富集培養物(Nature Biotechnology 2005,23:1534-1541；美國專利7,704,738)。將這些細胞移植在小鼠的腎包膜下導致分化成具有內胚層組織特徵的更成熟的細胞(美國專利7,704,738)。在添加FGF-10和視黃酸後，這些衍生自人胚胎幹細胞的定形內胚層細胞還可進一步分化成PDX1陽性細胞(美國專利申請公布2005/0266554)。這些胰腺前體細胞在免疫缺陷小鼠的脂肪墊中的後續移植導致在3-4個月成熟期後形成功能胰腺內分泌細胞(美國專利7,534,608和7,993,920)。
Fisk等人報導用於由人胚胎幹細胞產生胰島細胞的系統(美國專利7,033,831)。在這種情況下，分化途徑分成三個階段。人胚胎幹細胞首先使用丁酸鈉和活化素A的組合而分化成內胚層(美國專利7,326,572)。然後將這些細胞與結合有EGF或β-細胞素的BMP拮抗物(諸如頭蛋白(Noggin))一起培養，以生成PDX1陽性細胞。用煙醯胺誘導終末分化。
一直以來，還使用小分子抑制劑來誘導胰腺內分泌前體細胞。例如，已使用TGF-β受體和BMP受體的小分子抑制劑(Development 2011,138:861-871；Diabetes 2011,60:239-247)來顯著增加胰腺內分泌細胞的數量。另外，小分子活化劑也已用於生成定形內胚層細胞或胰腺前體細胞(Curr.Opin.Cell Biol.2009,21:727-732；Nature Chem.Biol.2009,5:258-265)。
HB9(也稱為HlXB9和MNX1)是一種在胰腺發育早期表達的鹼性螺旋-環-螺旋(「bHLH」)轉錄活化因子蛋白，其始於大約胚胎期第八天。在胚胎期的第十天半左右，HB9在胰腺上皮中表達PDX1和NKX6.1的細胞內瞬時表達，水平達到峰值。HB9表達在第十二天半左右開始衰退，且在後期，只局限於β細胞內。在HB9的無效突變的純合子小鼠中，胰腺的背瓣無法發育(Nat.Genet.23:67-70,1999；Nat.Genet.23:71-75,1999)。HB9-細胞/β-細胞表達低水平的葡萄糖轉運蛋白GLUT2和NKX6.1。此外，HB9-/-胰腺顯示胰島素陽性細胞數目明顯減少，但這種細胞數目減少並未顯著影響其它胰腺激素的表達水平。時序控制HB9對於β細胞正常發育並具有正常功能是至關重要的。雖然我們不太清楚有哪些因子調節HB9在β細胞中的表達，但近期用斑馬魚作的研究揭示，視黃酸可能對HB9表達有正向調節作用(Development,138,4597-4608,2011)。
在全文以引用方式併入本文的美國專利申請序列號13/998,883中，證明了三碘化鉀腺氨酸(「T3」)在朝向β細胞分化細胞中可充當HB9蛋白質表達的誘導劑。本文還公開了使用T3和T4中的一者或兩者生成對NKX6.1、PDX1和HB9呈陽性的胰腺內胚層細胞的方法。另外，並且如全文以引用方式併入本文的美國專利申請序列號13/998,884所述，證明了胰腺內分泌標誌物的表達可通過在空氣-液體界面處培養以及使用T3和活化素受體樣激酶(「ALK」)5抑制劑來顯著增強。
各種轉錄因子調節胰腺內分泌細胞向胰島素分泌β細胞的分化。在這些因數中存在v-maf禽類肌肉腱膜纖維肉瘤癌基因同源物A(「MAFA」)。事實上，據信MAFA可為葡萄糖刺激的胰島素分泌的β細胞中的主調節物。
一般來講，祖細胞分化成功能性β細胞的過程經歷多個階段，並且對從祖細胞諸如人多能幹細胞生成胰腺細胞的方案的改善已經取得了顯著進展。雖然有這些研究進展，但是祖細胞分化過程中的每一步驟均提出獨特的挑戰。因此，為了產生功能性內分泌細胞，並且具體地講，功能性β細胞的目的，仍存在對於進一步分化方案發展的需要。具體地講，希望開發其中胰腺內分泌細胞中的MAFA的表達增強的方法。
附圖說明
圖1A至圖1M為示出來自以下各項的基因表達的倍數變化的實時PCR分析的數據的圖表：PDX1、NKX6.1、PAX4、PAX6、NGN3、MAFA、ABCC8、嗜鉻粒蛋白-A、G6PC2、IAPP、胰島素、胰高血糖素的未分化ES細胞以及來自根據實施例1分化的幹細胞系H1的PTF1a。
圖2A至圖2C示出根據實施例1分化並且針對以下各項進行染色的第3階段細胞的FACS分布圖：圖2A中用Ki67(Y軸)共染色的PDX1(X軸)；圖2B中用CDX2(Y軸)共染色的PDX1(X軸)；以及圖2C中的NKX6.1。
圖3A至圖3D示出根據實施例1分化並且針對以下各項進行染色的第4階段細胞的FACS分布圖：圖3A中用NKX6.1(Y軸)共染色的嗜鉻粒蛋白(X軸)；圖3B中用Ki67(Y軸)共染色的PDX1(X軸)；圖3C中用胰島素(Y軸)共染色的NKX6.1(X軸)；以及圖3D中的NeuroD1。
圖4A至圖4E示出根據實施例1分化並且針對以下各項進行染色的第5階段細胞的FACS分布圖：圖4A中用NKX6.1(Y軸)共染色的嗜鉻粒蛋白(X軸)；圖4B中用Ki67(Y軸)共染色的PDX1(X軸)；和圖4C中用胰島素(Y軸)共染色的NKX6.1(X軸)；圖4D中的NeuroD1；以及用胰高血糖素(Y軸)共染色的胰島素(X軸)。
圖5A至圖5F示出根據實施例1分化並且針對以下各項進行染色的第6階段細胞的FACS分布圖：圖5A中用NKX6.1(Y軸)共染色的嗜鉻粒蛋白(X軸)；圖5B中用Ki67(Y軸)共染色的PDX1(X軸)；和圖5C中用胰島素(Y軸)共染色的NKX6.1(X軸)；圖5D中用Oct 3/4(Y軸)共染色的PAX6(X軸)；圖5E中用胰高血糖素(Y軸)共染色的胰島素(X軸)；以及圖5F中的FOXA2。
圖6A至圖6F示出根據實施例1分化並且針對以下各項進行染色的第7階段細胞的FACS分布圖：圖6A中用NKX6.1(Y軸)共染色的嗜鉻粒蛋白(X軸)；圖6B中用Ki67(Y軸)共染色的PDX1(X軸)；和圖6C中用胰島素(Y軸)共染色的NKX6.1(X軸)；圖6D中用Oct 3/4(Y軸)共染色的PAX6(X軸)；圖6E中用胰高血糖素(Y軸)共染色的胰島素(X軸)；以及圖6F中的FOXA2。
圖7為來自根據實施例1分化的第3階段至第7階段的細胞的多個胰腺內胚層標誌物(FOXA2、PDX1、NKX6.1)、未分化ES細胞標誌物(Oct3/4)、內分泌標誌物(PAX6、ISl-1、NKX2.2、嗜鉻粒蛋白)、和激素(胰島素、胰高血糖素)的百分比表達的圖表。
圖8A至圖8E為示出來自分化細胞與在第6-第7階段中用小分子處理之後的未分化細胞相比胰島素和MAFA表達的倍數變化的實時PCR分析的數據的圖表。
圖9為示出來自實施例4的分化細胞與未分化細胞相比AXL和GAS6表達的倍數變化的實時PCR分析的數據的圖表。
圖10A至圖10F為根據實施例6的來自分化細胞與在第7階段中用小分子處理後的未分化細胞相比MAFA、UCN3、G6PC2、NKX6.1、PDX1和胰島素表達的倍數變化的實時PCR分析的數據的圖表。
圖11A至圖11D為示出根據實施例7的來自分化細胞與在第7階段中用小分子處理後的未分化細胞相比MAFA、PDX1、NKX6.1和胰島素表達的倍數變化的實時PCR分析的數據的圖表。
具體實施方式
在結合附圖閱讀以下對本發明的詳細說明時能夠更好地進行理解。出於說明本發明的目的，附圖展示了本發明的實施方案。然而，本發明並不限於示出的精確布置方式、實施例和手段。為了清晰說明本公開內容，以非限制性方式將本發明的具體實施方式分成描述或闡明本發明的某些特徵、實施方案或應用方式的多個小節。
本發明涉及通過用某些小分子處理較不成熟的胰腺內分泌細胞來生成更成熟表型的胰腺內分泌細胞。在本發明的某些實施方案中，胰腺內分泌細胞在一個或多個階段中在小分子的存在下培養，所述小分子是蛋白質甲基轉移酶抑制劑、極光激酶抑制劑和p90核糖體S6激酶(「RSK」)抑制劑中的一種或多種。因此，本發明提供了用於將多能幹細胞分化成表現出成熟表型的胰腺內分泌細胞特徵的細胞的細胞培養物，以及引發和促進這種分化的分化培養基，和由分化產生的分化細胞和細胞群。本發明的方法提供了胰腺內分泌細胞群的形成，其中至少10％，優選地至少20％，更優選地至少30％，以及最優選地至少50％的細胞表達單激素胰島素並且是PDX1、NKX6.1和MAFA陽性的。
有利地且優選地，本發明的細胞培養物和分化培養基可與在空氣-液體界面處的分化結合使用。培養可在從多能幹細胞至成熟表型的胰腺內分泌細胞的分化途徑中所涉及的所有階段在空氣-液體界面處發生，或培養可涉及在分化的早期階段在浸沒於培養基中的平坦培養物上培養，然後在分化的後期階段的一個或多個期間在空氣-液體界面處培養。更優選地，本發明的過程涉及早期階段期間在浸沒於培養基中的支撐表面上培養多能幹細胞和隨後在分化的後期階段在空氣-液體界面處培養的組合。在此類實施方案中，可將所述細胞初始接種在固體表面上以進行浸沒培養，隨後將細胞從所述固體支承體去除並且重新接種到多孔支承體上以進行在空氣-液體界面處的培養。另選地，可將所述細胞初始接種在多孔支承體上，隨後在分化的早期階段將該支承體浸沒於培養基中，並且隨後在分化的後期階段將該支承體定位在空氣-液體界面處。
在又一個實施方案中，在一個或多個階段的分化也在T3、T4、它們的類似物中的一種或多種的存在下，並且任選但優選地用活化素受體樣激酶5(「ALK 5」)抑制劑進行。在優選的實施方案中，將胰腺內胚層/內分泌前體細胞的群體在含有T3、T4、其類似物中的一種或多種和ALK5抑制劑的培養基中培養成胰腺內分泌細胞。在更優選的實施方案中，所得胰腺內分泌細胞在含有T3、T4、其類似物中的一種或多種和ALK5抑制劑的培養基的存在下進一步分化。
本發明具體發現，用ALK5抑制劑和甲狀腺受體激動劑中的一種或多種的組合處理胰腺內胚層細胞，隨後將所得胰腺內分泌細胞與蛋白質甲基轉移酶DOT1L的抑制劑，極光激酶抑制劑和RSK抑制劑中的一種或多種組合培養顯著提高表達單激素胰島素、MAFA、PDX1和NKX6.1的群體中的細胞的數量，以及增加細胞中MAFA表達的水平。本發明在與空氣-液體界面處的分化結合使用時特別有用。
定義
幹細胞是通過其在單細胞水平上既自我更新又分化的能力來定義的未分化細胞。幹細胞可產生子代細胞，包括自我更新祖細胞、非更新祖細胞和終末分化細胞。幹細胞的特徵還在於其在體外分化成來自多個胚層(內胚層、中胚層和外胚層)的多種細胞譜系的功能細胞的能力。幹細胞還在移植後產生多種胚層的組織，並且在注射到胚泡內之後，促成基本上至大部分(如果不是所有的話)組織。
幹細胞是根據其發育潛能分類的。多能幹細胞能夠產生所有胚胎細胞類型。
分化是未特化的(「未定向的」)或特化不足的細胞獲得特化細胞(例如神經細胞或肌肉細胞)的特徵的過程。分化細胞是已在細胞譜系中佔據更特化的(「定向的」)位置的細胞。當應用於分化過程時，術語「定向的」是指已經在分化途徑中進行到一定程度的細胞，其中在正常情況下，該細胞將繼續分化成特定的細胞類型或一個亞群的細胞類型，並且在正常情況下，不能分化成不同的細胞類型或回復至分化程度更低的細胞類型。「去分化」指細胞回復到細胞的譜系當中特化(或定向)程度較低的地位的過程。如本文所用，「細胞譜系」限定細胞的遺傳，即它來自哪些細胞和它能產生什麼細胞。細胞譜系將細胞定位於發育和分化的遺傳方案內。譜系特異性標誌物指與所關注譜系的細胞的表型明確相關的特徵，並且可用來評估未定向細胞向所關注譜系的分化。
如本文所用，「標誌物」是在所關注的細胞中差異表達的核酸或多肽分子。在該上下文中，差異表達意指與未分化細胞或在分化的另一階段處的細胞相比陽性標誌物的水平升高並且陰性標誌物的水平下降。與其它細胞相比，標誌物核酸或多肽在所關注細胞中的可檢測水平充分地較高或較低，使得可使用本領域已知的多種方法中的任何一種將所關注細胞與其它細胞鑑別和區分開來。
如本文所用，當在細胞中充分地檢測到特定標誌物時，細胞「對於特定標誌物是陽性的」，「陽性的」或是「+」。相似地，當在細胞中未充分檢測到特定標誌物時，細胞「對於特定標誌物是陰性的」、「陰性的」或是「」。具體地講，通過螢光活化細胞分選細胞術(「FACS」)檢測到的陽性通常大於2％，而通過FACS檢測到的陰性閾值通常小於約1％。通過聚合酶鏈反應細胞術(「PCR」)檢測到的陽性通常小於或等於約30個循環(Cts)；而通過PCR檢測到的陰性通常大於約31個循環。
嘗試著在靜態體外細胞培養物中將多能幹細胞的分化過程複製到功能性胰腺內分泌細胞中時，通常將該分化過程視為通過多個連續階段累進。具體地，該分化過程常被視為通過多個階段循序累進。在這種分步進行的分化中，「第1階段」是指分化過程的第一步驟，多能幹細胞分化為表達定形內胚層的特徵性標誌物的細胞(「第1階段細胞」)。「第2階段」是指第二步驟，表達定形內胚層細胞的特徵性標誌物的細胞分化為表達腸管細胞的特徵性標誌物的細胞(「第2階段細胞」)。「第3階段」是指第三步驟，表達腸管細胞的特徵性標誌物的細胞分化為表達前腸內胚層細胞的特徵性標誌物的細胞(「第3階段細胞」)。「第4階段」是指第四步驟，表達前腸內胚層細胞的特徵性標誌物的細胞分化為表達胰腺前腸前體細胞的特徵性標誌物的細胞(「第4階段細胞」)。「第5階段」是指第五步驟，表達胰腺前腸前體細胞的特徵性標誌物的細胞分化為表達胰腺內胚層細胞和胰腺內分泌前體細胞中的一者或兩者的特徵性標誌物的細胞(統稱為「第5階段細胞」，或者「胰腺內胚層/內分泌前體細胞」)。「第6階段」是指第六步驟，表達胰腺內胚層/內分泌前體細胞的特徵性標誌物的細胞分化成表達胰腺內分泌細胞(為不成熟的β細胞)的特徵性標誌物的細胞(「第6階段細胞」)。第6階段細胞表達單激素胰島素並且是PDX1、NKX6.1和嗜鉻粒蛋白陽性的。在產生本發明的細胞的群體的過程中並且為了產生本發明的細胞的群體的目的，使用第七步驟，「第7階段」，並且其是指表達是未成熟β細胞的胰腺內分泌細胞的特徵性標誌物的細胞分化成表達是成熟β細胞並且與第6階段細胞相比具有更成熟表型的胰腺內分泌細胞的特徵性標誌物的細胞。所謂「第7階段細胞」或「第7階段細胞」意指是單激素胰島素+、MAFA+、NKX6.1+和PDX1+，但是也以比未成熟β細胞高的水平表達MAFA的胰腺內分泌細胞。另外，與第6階段的細胞的群體相比，從進行第7階段得到的細胞群具有更高百分比的MAFA陽性和單激素胰島素表達細胞。
應當注意在特定群體過程中並非所有細胞都以相同的速率經歷這些階段。因此，在體外細胞培養物中檢測到存在這樣的細胞，其比存在於細胞群中的大多數細胞在分化途徑中進程靠前或靠後的情況並不少見，尤其在處於後期分化階段的培養物中。例如，在細胞培養物處於第5階段期間，不時能觀察到有胰腺內分泌細胞的特徵性標誌物出現。出於舉例說明本發明的目的，本文描述了與上文定義的各階段相關聯的各種細胞類型的特徵。
如本文所用，「定形內胚層」是指具有在原腸胚形成過程中從上胚層產生的細胞的特性並形成胃腸道及其衍生物的細胞。定形內胚層細胞表達以下標誌物中的至少一種：FOXA2(也稱為肝細胞核因子3-β(「HNF3-β」))、GATA4、SOX17、CXCR4、Brachyury、Cerberus、OTX2、goosecoid、C-Kit、CD99和MIXL1。定形內胚層細胞的特徵性標誌物為CXCR4、FOXA2和SOX17。因此，定形內胚層細胞可通過其對CXCR4、FOXA2和SOX17的表達來表徵。此外，取決於細胞能保持在第1階段的時長，可能觀察到HNF4α增多。
如本文所用，「腸管細胞」是指源於定形內胚層的細胞，並且所述細胞可產生所有的內胚層器官，諸如肺、肝、胰腺、胃和腸。腸管細胞的特徵可在於其中的HNF4α表達較之定形內胚層細胞表達的HNF4α表達大幅提高。例如，在第2階段期間，可能觀察到HNF4α在mRNA中的表達增大到之前的十到四十倍。
如本文所用，「前腸內胚層細胞」是指產生食道、肺、胃、肝、胰腺、膽囊和一部分十二指腸的細胞。前腸內胚層細胞表達下列標誌物中的至少一種：PDX1、FOXA2、CDX2、SOX2和HNF4α。前腸內胚層細胞的特徵可在於與腸管細胞相比，PDX1表達提高。例如，超過百分之五十的第3階段培養物的細胞通常表達PDX1。
如本文所用，「胰腺前腸前體細胞」是指表達下列標誌物中的至少一種的細胞：PDX1、NKX6.1、HNF6、NGN3、SOX9、PAX4、PAX6、ISL1、胃泌素、FOXA2、PTF1a、PROX1和HNF4α。胰腺前腸前體細胞的特徵可在於PDX1、NKX6.1和SOX9中的至少一種的表達為陽性。
如本文所用，「胰腺內胚層細胞」是指表達下列標誌物中的至少一種的細胞：PDX1、NKX6.1、HNF1β、PTF1α、HNF6、HNF4α、SOX9、NGN3、胃泌素、HB9或PROX1。胰腺內胚層細胞的特徵可在於沒有CDX2和SOX2大量表達。
如本文所用，「胰腺內分泌前體細胞」是指能夠變成胰腺激素表達細胞的胰腺內胚層細胞。胰腺內分泌前體細胞表達以下標誌物中的至少一種：NGN3、NKX2.2、NeuroD11、ISL1、PAX4、PAX6、或ARX。胰腺內分泌前體細胞的特徵可在於其表達NKX2.2和NeuroD11。
如本文所用，「胰腺內分泌細胞」指能夠表達下列激素中的至少一種的細胞：胰島素、胰高血糖素、生長抑素、生長素釋放肽和胰多肽。除了這些激素以外，胰腺內分泌細胞的特徵性標誌物還包括以下中的一種或多種：NeuroD1、ISL1、PDX1、NKX6.1、ARX、NKX2.2、HB9和PAX6。胰腺內分泌細胞的一個亞群是「未成熟β細胞」，其是能夠表達胰島素，但不表達胰高血糖素、生長抑素、生長素釋放肽和胰多肽的細胞。此外，未成熟β細胞的特徵性標誌物還包括以下中的一種或多種：NeuroD1、ISL1、PDX1、NKX6.1、NKX2.2、HB9和PAX6。胰腺內分泌細胞的第二亞群是「成熟β細胞」，其是能夠表達胰島素，但不表達胰高血糖素、生長抑素、生長素釋放肽和胰多肽的細胞。另外，成熟β細胞的特徵性標誌物還包括以下中的一種或多種：NeuroD1、ISL1、PDX1、NKX6.1、NKX2.2、HB9、PAX6和MAFA。胰腺內分泌細胞的又一個亞群是表達成熟β細胞的特徵性標誌物的那些細胞，並且其特徵在於其表達PDX1、NKX2.2、NKX6.1、NeuroD1、ISL1、HNF3β、HB9、MAFA和PAX6連同響應於與較不成熟的β細胞相比較強且增加的葡萄糖負荷的胰島素釋放。
如本文所用，「空氣-液體界面」或「ALI」是指存在於開放培養容器或部分填充有培養基的培養容器中的空氣-液體界面。雖然為了方便起見而在本文中稱作「空氣」，但是本發明不限於在周圍環境中存在的氣體和組合物的混合物。本發明具體地設想和包括具有與周圍環境不同的組合物的氣態混合物，包括例如富含特定組分或其中特定組分已經被耗盡或消除的混合物。
「d1」、「1d」和「第一天」，「d2」、「2d」和「第二天」等在本文中可互換使用。這些數字字母組合是指在本專利申請的分步分化方案過程中的不同階段中溫育的具體天數。
「LDN-193189」是指((6-(4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯基)-3-(吡啶-4-基)吡唑並[1,5-a]嘧啶鹽酸鹽))，它是一種可得自Shanghai ChemPartner,Co.,LTD的BMP受體抑制劑。
多能幹細胞的表徵、來源、擴增和培養
A.多能幹細胞的表徵
多能幹細胞可表達指定的TRA-1-60和TRA-1-81抗體(Thomson等人，1998，Science 282:1145-1147)中的一種或多種。多能幹細胞在體外的分化導致TRA-1-60和TRA-1-81喪失表達。未分化的多能幹細胞通常具有鹼性磷酸酶活性，所述鹼性磷酸酶活性可通過用4％多聚甲醛固定細胞，然後用以商標Red出售的鹼性磷酸酶底物試劑盒顯色來檢測，如由製造商(Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,California)描述的。未分化的多能幹細胞通常也表達OCT4和TERT，這通過逆轉錄聚合酶鏈反應(「RT-PCR」)檢測。
增殖的多能幹細胞的另一期望表型具有分化成所有三個胚層(內胚層、中胚層和外胚層)的細胞的潛能。可以例如通過如下方式來確認幹細胞的多能性：將細胞注射入重症聯合免疫缺陷(「SCID」)小鼠，使用4％的多聚甲醛固定形成的畸胎瘤，然後針對來自該三個胚層的細胞類型的證據進行組織學檢測。另選地，可以通過產生胚狀體並評估胚狀體中與三個胚層相關的標誌物的存在來確定多能性。
增殖的多能幹細胞系可用標準G顯帶技術進行核型分析並與公開的相應靈長類物種的核型相比較。期望獲得具有「正常核型」(其意指細胞是整倍體的)的細胞，其中所有人染色體都存在並且無明顯的改變。
B.多能幹細胞的來源
任何多能幹細胞均可用於本發明的方法中。可使用的多能幹細胞的示例性類型包括建立的多能細胞系，包括在妊娠期間的任何時間取得的胚胎前組織(諸如胚泡)、胚胎組織或胎兒組織，所述時間通常但不一定是在約10至12周妊娠前。非限制性的示例是已確立的人胚胎幹細胞(「hESCs」)系或人胚胎生殖細胞系，諸如人胚胎幹細胞系H1(NIH代碼：WA01)，H7(NIH代碼：WA07)，H9(NIH代碼：WA09)(WiCell Research Institute,Madison,WI,USA)，以及SA002(Cellartis AB Corporation,Goteburg,Sweden)。
取自在沒有飼養細胞的情況下培養過的多能幹細胞群的細胞也是合適的選擇。還可使用誘導多能細胞(IPS)或重新編程的多能細胞，其可使用多種多能相關的轉錄因子的被迫表達而來源於成人體細胞，所述轉錄因子諸如OCT4、NANOG、SOX2、KLF4和ZFP42(Annu Rev Genomics Hum Genet 2011,12:165-185)；還參見IPS,Cell,126(4):663-676)。在本發明的方法中使用的人胚胎幹細胞也可如按Thomson等人(美國專利5,843,780；Science,1998,282:1145-1147；Curr Top Dev Biol 1998,38:133-165；Proc Natl Acad Sci U.S.A.1995,92:7844-7848)所述製備。也可使用突變的人胚胎幹細胞系，諸如BG01v(BresaGen,Athens,Georgia.)，或衍生自成人體細胞的那些細胞，諸如Takahashi等人在Cell 131:1-12(2007)公開的那些細胞。在某些實施方案中，適用於本發明的多能幹細胞可根據以下文獻中描述的方法獲得：Li等人(Cell Stem Cell 4:16-19,2009)；Maherali等人(Cell Stem Cell 1:55-70,2007)；Stadtfeld等人(Cell Stem Cell 2:230-240)；Nakagawa等人(Nature Biotechnol 26:101-106,2008)；Takahashi等人(Cell 131:861-872,2007)；以及美國專利申請公布2011/0104805。在某些實施方案中，適用於本發明的多能幹細胞可被認為是「初始的」並且根據以下文獻中描述的方法獲得：Gafni等人(Nature,504:282,2013)，以及Ware等人(PNAS,111:4484 4489,2014)。所有這些參考文獻、專利和專利申請全文以引用方式併入本文，尤其是它們與多能細胞的分離、培養、擴增和分化有關的內容。
多能幹細胞的其它來源包括誘導的多能幹細胞(IPS,Cell,126(4):663-676)。合適細胞的又一個來源包括人臍帶組織衍生的細胞、人羊水衍生的細胞、人胎盤衍生的細胞，以及人孤雌生殖體。在一個實施方案中，臍帶組織衍生的細胞可通過美國專利7,510,873的方法獲得。在另一個實施方案中，胎盤組織衍生的細胞可使用美國專利申請公布2005/0058631的方法獲得。在另一個實施方案中，羊水衍生的細胞可使用美國專利申請公布2007/0122903獲得。這些專利申請中的每個的公開內容由於涉及細胞的分離和表徵而全文以引用方式併入本文。在某些實施方案中，多能幹細胞可能是非胚胎來源的。
C.多能幹細胞的擴增和培養
通常在飼養細胞層上培養多能幹細胞，飼養細胞可以多種方式支持多能幹細胞。另選地，可在培養系統中培養多能幹細胞，所述培養系統基本上不含飼養細胞，但支持多能幹細胞的增殖而不會經歷基本的分化。通常使用通過此前用另一細胞類型培養而調理過的培養基來支持多能幹細胞在無飼養細胞的培養物中生長而不分化。另選地，可用化學限定的培養基來支持多能幹細胞在無飼養細胞的培養物中生長而不分化。
多能細胞在培養物中可使用多種飼養層或通過使用基質蛋白質塗覆的容器容易地擴增。另選地，與限定的培養基諸如以商標1出售的培養基(StemCell Technologies,Inc.,Vancouver,B.C.,Canada)組合的化學限定的表面可用於細胞的常規擴增。多能細胞可使用酶促消化、機械分離或使用多種鈣螯合劑諸如乙二胺四乙酸(「EDTA」)容易地從培養皿中取出。另選地，多能細胞可在不存在任何基質蛋白質或飼養層的情況下懸浮擴增。
在受權利要求保護的本發明中可使用多種不同的擴增和培養多能幹細胞的已知方法。例如，本發明的方法可以使用Reubinoff等人、Thompson等人、Richards等人的方法，以及美國專利申請公布2002/0072117的方法。Reubinoff等人(Nature Biotechnology 18:399-404(2000))和Thompson等人(Science 282:1145-1147(1998))公開了用小鼠胚胎成纖維細胞飼養細胞層培養來自人胚泡的多能幹細胞系。Richards等人(Stem Cells 21:546-556,2003)評估了一組十一種不同的成人、胎兒和新生兒飼養細胞層在支持人多能幹細胞培養方面的能力，指出「在成人皮膚成纖維細胞飼養細胞上培養的人胚胎幹細胞系保持人胚胎幹細胞形態並保留了多能性」。美國專利申請公布2002/0072117公開了產生支持靈長類多能幹細胞在無飼養細胞的培養物中生長的培養基的細胞系。所採用的細胞系是從胚胎組織獲得或從胚胎幹細胞分化而來的間質細胞系和成纖維細胞樣細胞系。美國專利申請公布2002/072117還公開了上述細胞系作為原代飼養細胞層的用途。
擴增和培養多能幹細胞的其它合適的已知方法公開於例如Wang等人、Stojkovic等人、Miyamoo等人和Amit等人的文獻中。Wang等人(Stem Cells 23:1221-1227,2005)公開了用於在源自人胚胎幹細胞的飼養細胞層上長期培育人多能幹細胞的方法。Stojkovic等人(Stem Cells 2005 23:306-314,2005)公開了一種源自人胚胎幹細胞的自發分化的飼養細胞系統。Miyamoto等人(Stem Cells 22:433-440,2004)公開了從人胎盤獲得的飼養細胞源。Amit等人(Biol.Reprod 68:2150-2156,2003)公開了源自人包皮的飼養細胞層。
擴增和培養多能幹細胞的其它合適方法公開於例如Inzunza等人的文獻、美國專利6,642,048、WO 2005/014799、Xu等人的文獻和美國專利申請公布2007/0010011中。Inzunza等人(Stem Cells 23:544-549,2005)公開了來自人出生後包皮成纖維細胞的飼養細胞層。美國專利6,642,048公開了可支持靈長類多能幹細胞在無飼養細胞的培養物中生長的培養基以及可用於產生這種培養基的細胞系。美國專利6,642,048報導了從胚胎組織獲得或從胚胎幹細胞分化而來的間質細胞系和成纖維細胞樣細胞系，以及用於獲得此類細胞系、處理培養基，和使用這種培養基使幹細胞生長的方法。WO 2005/014799公開了一種用於維持哺乳動物細胞，促進哺乳動物細胞增殖和分化的經調理的培養基。WO 2005/014799報導了通過鼠細胞、尤其是那些分化並永生化的轉基因肝細胞(稱為MMH(Met鼠肝細胞))的細胞分泌活性對根據本發明製備的培養基進行調理。Xu等人(Stem Cells 22:972-980,2004)公開了一種從人胚胎幹細胞衍生物獲得的經調理的培養基，這些人胚胎幹細胞衍生物已經過遺傳修飾，以過表達人端粒酶逆轉錄酶。美國專利申請公布2007/0010011公開了一種用於維持多能幹細胞的化學限定的培養基。
已知的另選培養系統採用補充有能促進胚胎幹細胞增殖的生長因子的無血清培養基。此類培養系統的示例包括但不限於Cheon等人、Levenstein等人和美國專利申請公布2005/0148070中公開的那些。Cheon等人(BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870，2005年10月19日)公開了無飼養細胞的無血清培養系統，其中胚胎幹細胞維持在補充有能引發胚胎幹細胞自我更新的不同生長因子的未經調理的血清替代培養基中。Levenstein等人(Stem Cells 24:568-574,2006)公開了使用補充有bFGF的培養基，在不存在成纖維細胞或經調理的培養基的情況下長期培養人胚胎幹細胞的方法。美國專利申請公布2005/0148070公開了在無血清且無成纖維細胞飼養細胞的限定的培養基中培養人胚胎幹細胞的方法，該方法包括：在含有白蛋白、胺基酸、維生素、礦物質、至少一種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白替代品、至少一種胰島素或胰島素替代品的培養基中培養幹細胞，該培養基基本上無哺乳動物胎血清且含有至少約100ng/ml的能夠對成纖維細胞生長因子信號轉導受體進行活化的成纖維細胞生長因子，其中該生長因子的供給來源不是僅為成纖維細胞飼養層，該培養基支持幹細胞在無飼養細胞或經調理的培養基的情況下以未分化狀態增殖。
培養並擴增多能幹細胞的另外已知的合適方法在美國專利申請公布2005/0233446、美國專利6,800,480、美國專利申請公布2005/0244962和WO 2005/065354中有所公開美國專利申請公布2005/0233446公開了一種可用於培養幹細胞的限定的培養基，所述幹細胞包括未分化的靈長類原始幹細胞。在溶液中，此培養基與培養的幹細胞相比基本上是等滲的。在給定的培養物中，特定的培養基為基礎培養基以及一定量的bFGF、胰島素和抗壞血酸中的每一種，所述一定量的bFGF、胰島素和抗壞血酸中的每一種為支持原始幹細胞基本上以未分化狀態生長所必需的。美國專利6,800,480報導稱，提供了一種以大體上未分化狀態培養靈長類來源的原始幹細胞的細胞培養基，這種培養基包括滲透壓低且內毒素含量小的基礎培養基，該基礎培養基可有效支持靈長類來源的原始幹細胞生長。專利6,800,480的公開內容還報導，該基礎培養基混合了能有效支持靈長類來源的原始幹細胞生長的營養血清，和選自飼養細胞和衍生自飼養細胞的胞外基質組分的基質。還應注意，該基礎培養基還包含非必需胺基酸、抗氧化劑，和選自核苷和丙酮酸鹽的第一生長因子。美國專利申請公布2005/0244962報導，其公開內容的一個方面提供了一種培養靈長類胚胎幹細胞的方法；這種幹細胞在基本上不含哺乳動物胎兒血清(優選也基本上不含任何動物血清)的培養物中，且在存在由不只是成纖維細胞飼養層的來源提供的成纖維細胞生長因子的情況下培養。
WO 2005/065354公開了限定的等滲培養基，該培養基基本上不含飼養細胞且不含血清，其為基礎培養基、bFGF、胰島素和抗壞血酸，所述基礎培養基、bFGF、胰島素和抗壞血酸的量足以支持基本上未分化的哺乳動物幹細胞的生長。此外，WO 2005/086845公開了一種用於維持未分化的幹細胞的方法，所述方法包括使幹細胞暴露於轉化生長因子-β(「TGF-β」)蛋白家族的成員、成纖維細胞生長因子(「FGF」)蛋白家族的成員或煙醯胺，所述成員或煙醯胺的量足以維持所述細胞處於未分化狀態達足以實現所需結果的一段時間。
可將多能幹細胞接種到合適的培養基質上。在一個實施方案中，合適的培養基質是細胞外基質組分，諸如衍生自基底膜或可形成粘附分子受體-配體偶聯物的一部分的那些。一種合適的培養基質是以商標MATRIGELTM(Corning Incorporated,Corning,New York)出售的重構基底膜。MATRIGELTM是來自Engelbreth-Holm Swarm腫瘤細胞的可溶性製劑，其在室溫下膠凝形成重構的基底膜。
在本領域中已知的其它細胞外基質組分和組分混合物適合作為替代物。取決於所擴增的細胞類型，這些替代物可包括單獨的層粘連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸肝素等，或者這些物質的各種組合。
可在存在促進細胞存活、增殖和保持期望特性的培養基的情況下，以合適的分布將多能幹細胞接種於所述基質上。所有這些特性可得益於對接種分布的認真考慮並可由本領域技術人員輕鬆確定。合適的培養基可用以下組分製備：杜爾貝科改良伊格爾培養基(「DMEM」)，由Life Technologies Corporation,Grand Island New York以商標(目錄號11965-092)出售；敲除的杜爾貝科改良伊格爾培養基(「KO DMEM」)，由Life Technologies Corporation以商標(目錄號10829-018)出售；Ham的F12/50％DMEM基礎培養基；200mM的L-穀氨醯胺，由Life Technologies以商標(目錄號25030-081)出售；非必需胺基酸溶液，由Life Technologies以商標(目錄號11140-050)出售；β-巰基乙醇，Sigma-Aldrich Company,LLC Saint Louis,MO，(目錄號M7522)；人重組鹼性成纖維細胞生長因子(「bFGF」)，由Life Technologies以商標(目錄號13256-029)出售。
人胚胎幹細胞的大規模擴增和受控分化過程也可使用懸浮生物反應器來實現。這樣的系統能夠在受控培養系統中生成具有更大功效的臨床相關的細胞數。已知使用允許多能的鼠和hES細胞的擴增的已建立生物反應器培養系統，例如如Journal of Biotechnology，2014年5月，第178卷，第54-64頁；Stem Cell Reports，2014年4月，第3卷，第6期，第1132頁；以及Tissue Engineering Part C:Methods，2013年2月，第19卷，第2期，第166-180頁中所公開。
多能幹細胞的分化
當多能細胞向β細胞分化時，它們經多個階段分化，每一階段的特徵可在於其中有無特定標誌物存在。細胞分化至這些階段是通過特定培養條件實現的，所述培養條件包括存在和缺乏添加至培養基中的某些因子。一般來講，這種分化可涉及多能幹細胞分化成定形內胚層譜系和定形內胚層細胞。這些細胞隨後可進一步分化成腸管細胞，這些腸管細胞可繼而分化成前腸內胚層細胞。前腸內胚層細胞可分化成胰腺前腸前體細胞，該胰腺前腸前體細胞然後可進一步分化成胰腺內胚層細胞、胰腺內分泌前體細胞，或胰腺內胚層細胞和胰腺內分泌前體細胞兩者。這些細胞可分化成產生或分泌胰腺激素的細胞。本申請通過以下步驟提供多能幹細胞向胰腺內分泌細胞的分階段分化：優選地在部分填充有培養基的培養容器中存在的空氣-液體界面處培養細胞，具體地在第5階段至第7階段中的一個或多個中在空氣-液體界面處培養細胞。
單獨或與ALK 5抑制劑進一步組合的甲狀腺激素三碘甲腺原氨酸(「T3」)和甲狀腺素(「T4」)及其類似物中的一種或多種可用於在分化的第1階段至第7階段中的一個或多個處，並且優選地在第5階段至第7階段中的每個處的細胞培養。另選地，ALK 5抑制劑可在分化的一個或多個階段中，但是優選地在第5階段至第7階段中的每個階段處單獨使用。更優選地，甲狀腺激素或其類似物和ALK 5抑制劑中的一種或多種用於一個或多個分化階段中，優選地在第5階段至第7階段中的每個階段處。合適的甲狀腺激素類似物可包括但不限於：GC-1(Sobertirome)(可得自R&D Systems,Inc.Minneapolis,Minnesota)；3,5-二碘丙酸(「DIPTA」)；J.Steroid Biochem.Mol.Biol.,2008,111:262-267和Proc.Natl.Acad.Sci.US 2003,100:10067-10072中討論的KB-141；Proc.Natl.Acad.Sci.US 2007,104:15490-15495中討論的MB07344；J.Lipid Res.，2009年5月，第50卷，第938頁和Endocr.Pract.2012,18(6):954-964中討論的T0681，所述文獻的公開內容全文以引用方式併入本文中。可用的ALK5抑制劑包括：ALK5抑制劑II(Enzo Life Sciences,Inc.,Farmingdale,New York)，其也為優選的ALK5抑制劑；ALK5i(Axxora,Inc.,San Diego,California)，SD208(R&D Systems)；TGF-β抑制劑SB431542(Xcess Biosciences,Inc.,San Diego,California)；ITD-1(Xcess Biosciences)；LY2109761(Xcess Biosciences)；A83-01(Xcess Biosciences)；LY2157299(Xcess Biosciences)；TGF-β受體抑制劑V(EMD Millipore Chemical,Gibstown,New Jersey)；TGF-β受體抑制劑I(EMD Millipore)；TGF-β受體抑制劑IV(EMD Millipore)；TGF-β受體抑制劑VII(EMD Millipore)；TGF-β受體抑制劑VIII(EMD Millipore)；TGF-β受體抑制劑II(EMD Millipore)；TGF-β受體抑制劑VI(EMD Millipore)；以及TGF-β受體抑制劑VI(EMD Millipore)。
此外，在本發明的優選實施方案中，該方法包括在一個或多個階段處理細胞，但優選在第7階段期間用分化培養基處理細胞，所述分化培養基包含抗氧化劑諸如維生素E、乙醯半胱氨酸、維生素C、抗氧化劑補充劑(目錄號A1345，Sigma-Aldrich Company,LLC Saint Louis,Missouri)、穀胱甘肽、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等及其組合中的一者或兩者。在另外更優選的實施方案中，在進行第6階段中，使用γ分泌酶抑制劑，其可為γ分泌酶抑制劑XX(EMD Millipore)，γ分泌酶抑制劑XXI(EMD Millipore)，γ分泌酶抑制劑XVI(EMD Millipore)，N-[(3,5-二氟苯基)乙醯基]-L-丙氨醯基-2-苯基]甘氨酸-1,1-二甲基乙酯(「DAPT」)(目錄號2634，Tocris Bioscience,Bristol,United Kingdom)等，以及它們的組合。γ分泌酶抑制劑的可用量可為約50nM至5000nM，優選地為約50nM至500nM。抗氧化劑的量可為約0.1μM至100μM，或者約0.1μM至20μM，並且優選地為約1μM至10μM。另選地，抗氧化劑的可用量可為約100nM至5mM，約1000nM至2mM，並且優選地為約0.1mM至1mM。
在本發明的最優選實施方案中，某些小分子用於分化的一個或多個階段的培養基中，優選地在第6階段和第7階段中的一個或兩個處。感興趣的小分子是能夠抑制極光激酶、p90核糖體S6激酶或甲基轉移酶DOT1L的那些，並且優選地連同減小培養細胞的氧化應激的抗氧化劑一起使用。可用的此類抑制劑包括極光激酶抑制劑II(4-(4'-苯甲醯氨基苯胺基)-6,7-二甲氧基喹唑啉)、SNS 314甲磺酸鹽(N-(3-氯苯基)-N'-[5-[2-(噻吩並[3,2-d]嘧啶-4-基氨基)乙基]-2-噻唑基]脲甲磺酸鹽)、GSK1070916(3-(4-(4-(2-(3-((二甲基氨基)甲基)苯基)-1H-吡咯並[2,3-b]吡啶-4-基)-1-乙基-1H-吡唑-3-基)苯基)-1,1-二甲基脲)、TAK-901(5-(3-(乙基磺醯基)苯基)-3,8-二甲基-N-(1-甲基哌啶-4-基)-9H-吡啶並[2,3-b]吲哚-7-甲醯胺)、RSK抑制劑II(二氫蝶啶酮2-(3,5-二氟-4-羥基-苯胺基)-8-異戊基-5,7-二甲基-7H-蝶啶-6-酮的外消旋混合物)、和EPZ-5676(9H-嘌呤-6-胺,9-[5-脫氧-5-[[順式-3-[2-[6-(1,1-二甲基乙基)-1H-苯並咪唑-2-基]乙基]環丁基](1-甲基乙基)氨基]-β-D-呋喃核糖基]-)，以及它們的組合。特別要關注的是極光激酶抑制劑II和RSK抑制劑II，以及DOT1L的抑制劑，特別是EPZ-5676。在本發明的優選實施方案中，小分子用於第6階段和第7階段中的一個和多個的培養基中，並且更優選地用於第7階段中。可通過選擇顯示成熟標誌物的最佳表達的量來確定可用的小分子的量，並且該量不產生毒性效應。通常，可用的量將為約500nM至10μM，或者約500nM至5μM，並且優選地為約500nM至2μM。
多能細胞向表達具有成熟表型的胰腺內分泌細胞的特徵性標誌物的細胞的分化
多能幹細胞的特徵是本領域技術人員熟知的，並且多能幹細胞的其它特徵有待繼續鑑定。多能幹細胞標誌物包括(例如)下列標誌物中的一種或多種的表達：ABCG2、cripto、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、SOX2、NANOG、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81。這些可通過RT-PCR檢測。
示例性的多能幹細胞包括人胚胎幹細胞系H9(NIH代碼：WA09)、人胚胎幹細胞系H1(NIH代碼：WA01)、人胚胎幹細胞系H7(NIH代碼：WA07)，以及人胚胎幹細胞系SA002。表達多能細胞的下列特徵性標誌物中的至少一種的細胞也是合適的：ABCG2、cripto、CD9、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、SOX2、NANOG、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81。
適用於本發明的是表達定形內胚層譜系的特徵性標誌物中的至少一種的細胞。在本發明的一個方面，表達定形內胚層譜系的特徵性標誌物的細胞為原條前體細胞。在另一方面，表達定形內胚層譜系的特徵性標誌物的細胞是中內胚層細胞。在另一方面，表達定形內胚層譜系的特徵性標計物的細胞是定形內胚層細胞。
表達胰腺內胚層譜系的特徵性標誌物中的至少一種的細胞也適用於本發明。在本發明的一個方面，表達胰腺內胚層譜系的特徵性標誌物的細胞是胰腺內胚層細胞，其中PDX1和NKX6.1的表達基本上高於CDX2和SOX2的表達。在某些實施方案中，大於30％的細胞表達PDX1和NKX6.1，並且小於30％的細胞表達CDX2或SOX2，如用FACS所測量的。其中PDX1和NKX6.1的表達是CDX2或SOX2的表達的至少兩倍的細胞特別有用。
還適用於本發明的是表達胰腺內分泌譜系的特徵性標誌物中的至少一種的細胞。在本發明的一個方面，表達胰腺內分泌譜系的特徵性標誌物的細胞為胰腺內分泌細胞。胰腺內分泌細胞可為表達胰腺激素的細胞，意指能夠表達以下激素中的至少一種的細胞：胰島素、胰高血糖素、生長抑素、生長素釋放肽或胰多肽。在優選的實施方案中，所述胰腺內分泌細胞是產生胰島素的β細胞。
在本發明的某些實施方案中，為了得到表達成熟表型的胰腺內分泌β細胞的特徵性標誌物的細胞，採用以多能幹細胞開始的方案。該方案包括：
第1階段：將從細胞培養系獲得的多能幹細胞，諸如胚胎幹細胞，用合適的因子處理以誘導定形內胚層細胞的形成。
第2階段：用合適的因子處理從第1階段得到的細胞，以誘導細胞形成為表達腸管細胞的特徵的標誌物。
第3階段：用合適的因子處理從第2階段細胞得到的細胞，以誘導其進一步分化成表達前腸內胚層細胞的特徵性標誌物的細胞。
第4階段：用合適的因子處理從第3階段得到的細胞，以誘導其進一步分化成表達胰腺前腸前體細胞的特徵性標誌物的細胞。將所述細胞任選地在第4階段後期時在空氣-液體界面處培養。
第5階段：用合適的因子(在某些實施方案中包括：(i)T3、T4或其類似物中的一種或多種；(ii)ALK5抑制劑；或(iii)(i)和(ii)兩者)處理從第4階段得到的細胞，並且任選且優選地在空氣-液體界面處培養，以誘導其分化成表達胰腺內胚層/內分泌前體細胞的特徵性標誌物的細胞。
第6階段：用合適的因子(在某些實施方案中包括：(i)T3、T4或其類似物中的一種或多種；(ii)ALK5抑制劑；(iii)極光激酶抑制劑、RSK抑制劑和蛋白質甲基轉移酶DOT1L的抑制劑中的一種或多種；(iv)(i)和(ii)兩者；(v)(i)、(ii)和(iii)；(vi)(i)和(iii)；或(vii)(ii)和(iii))處理從第5階段細胞得到的細胞，並且任選且優選地在空氣-液體界面處培養，以誘導其分化成表達胰腺內分泌細胞的特徵性標誌物的細胞。
第7階段：用合適的因子(在某些實施方案中包括：(i)T3、T4或其類似物中的一種或多種；(ii)ALK5抑制劑；(iii)抗氧化劑；(iv)極光激酶抑制劑、RSK抑制劑和蛋白質甲基轉移酶DOT1L的抑制劑中的一種或多種；(v)(i)和(ii)；(vi)(i)和(iii)；(vii)(i)和(iv)；(viii)(ii)和(iii)；(ix)(ii)和(iv)；(x)(i)、(ii)和(iii)；(xi)(i)、(iii)和(iv)；(xii)(ii)、(iii)和(iv)；(xiii)(i)、(ii)和(iv)；(xiv)(iii)和(iv)；或(xv)(i)、(ii)、(iii)和(iv)處理從第6階段細胞得到的細胞，並且任選且優選地在空氣-液體界面處培養，以誘導形成胰腺內分泌細胞，該胰腺內分泌細胞表達單激素胰島素並且是PDX1、NKX6.1和MAFA陽性的而且具有比第6階段細胞更高的MAFA表達水平，並且所得細胞群具有比第6階段細胞更高百分比的MAFA陽性和單激素胰島素表達細胞。雖然在某些實施方案中本發明涵蓋使多能幹細胞(例如，第1階段之前的細胞)分化成第7階段細胞，但是本發明也涵蓋使其它階段的細胞向第7階段分化。具體地，本發明涵蓋第4階段細胞至第7階段細胞的分化。此外，雖然上文將分化過程描述為獨立的階段，但處理和經歷分化過程的細胞的進程可能是依次或連續的。此外，多能幹細胞向第6階段細胞或第7階段細胞的分化可在懸浮培養物中進行。
可通過將處理過的細胞群暴露於可特異性識別由感興趣的分化細胞表達的蛋白質標誌物的試劑，諸如抗體來確定分化效率。用於評估培養的或分離的細胞中蛋白質標誌物和核酸標誌物的表達的方法是本領域的標準方法。這些方法包括RT-PCR、Northern印跡、原位雜交(參見例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人編輯，2001增刊)，以及免疫測定(諸如切片材料的免疫組織化學分析)、Western印跡和針對在完整細胞中可接近的標誌物的流式細胞術分析(FACS)(參見，例如，Harlow和Lane，Using Antibodies:A Laboratory Manual,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。
還可將已分化細胞進一步純化。例如，在用本發明方法處理多能幹細胞後，可通過使處理過的細胞群暴露於特異性識別由經純化的分化細胞特徵性表達的蛋白質標誌物的試劑(諸如抗體)來純化已分化的細胞。
含有足夠量的細胞分化所需的維生素、礦物質、鹽、葡萄糖、胺基酸和載體蛋白的任何合適的生長培養基可用於第1階段至第7階段中的各個階段。然而，優選地，使用以下各項：第1階段-MCDB-131(可得自Life Technologies Corporation,Grand Island,NY)或RPMI(可得自available from Sigma-Aldrich)；第2階段-MCDB-131或杜爾貝科改良伊格爾培養基F12(「DMEM F12」)；第3階段至第5階段-MCDB-131，BLAR(表1)或DMEM；以及第6階段和第7階段-BLAR或CMRL(Life Technologies)。優選地，對於第1階段至第4階段，培養基的葡萄糖濃度保持在或更優選地低於約10mM；並且對於第5階段至第7階段，培養基的葡萄糖濃度保持在大於約10mM。
第1階段：多能細胞分化成表達定形內胚層細胞的特徵性標誌物的細胞。
可採用本領域已知的任何方法或本發明提出的任何方法，使多能幹細胞分化成表達定形內胚層細胞的特徵性標誌物的細胞。據報導可用於使多能幹細胞分化成表達定形內胚層譜系的特徵性標誌物的細胞的方法公開於：D』Amour等人，Nature Biotechnology 23,1534-1541(2005)；Shinozaki等人，Development 131,1651-1662(2004)；McLean等人，Stem Cells 25,29-38(2007)；D』Amour等人，Nature Biotechnology 24,1392-1401(2006)。另外的合適的分化方法公開於：美國專利申請公布2007/0254359，美國專利申請公布2009/0170198；美國專利申請公布2011/0091971；美國專利申請公布2010/0015711；美國專利申請公布2012/0190111；美國專利申請公布2012/0190112；以及美國專利申請公布2012/0196365。這些公開內容全文以引用方式併入本文中，因為它們涉及多能幹細胞分化成定形內胚層細胞。
在一個實施方案中，用合適的生長培養基處理多能細胞，優選地為MCDB-131或RPMI。該培養基優選地補充有生長分化因子(諸如生長分化因子8(「GDF8」))和糖原合成酶激酶-3β(「GSK3β」)抑制劑(諸如在美國專利申請公布2010/0015711中公開的環苯胺-吡啶三嗪化合物(該專利全文以引用方式併入本文)，以誘導其分化成表達定形內胚層細胞的特徵性標誌物的細胞。優選的GSK3β抑制劑是14-丙-2-烯-1-基-3,5,7,14,17,23,27-七氮雜四環[19.3.1.1～2,6～.1～8,12～]二十七-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-壬-16-酮(「MCX化合物」)。處理可涉及使多能幹細胞與補充有約50ng/ml至約150ng/ml、或者約75ng/ml至約125ng/ml、優選地約100ng/ml的GDF8的培養基接觸。處理還可涉及使細胞與約0.1μM至約5μM、或者約0.5μM至約2.5μM，優選地約1μM的MCX化合物接觸。可將多能細胞培養約二至五天，優選地約二至三天，以促進其分化成表達定形內胚層細胞的特徵性標誌物的細胞。
在優選的實施方案中，在GDF8和MCX化合物的存在下培養細胞一天，接著在GDF8和較低濃度的MCX化合物的存在下培養細胞一天，接著在存在GDF8並且缺乏MCX化合物的情況下培養細胞一天。具體地，將細胞在GDF8和約1μM的MCX化合物的存在下培養一天，接著在GDF8和約0.1μM的MCX化合物的存在下培養一天，接著在存在GDF8並且缺乏MCX化合物的情況下培養一天。另選地，可將細胞在GDF8和約1μM MCX化合物的存在下培養一天，然後在GDF8和約0.1μM MCX化合物的存在下培養一天。
另選地，可將多能幹細胞在含有活化素A的培養基中在不存在血清的情況下培養，然後將所述細胞與活化素A和血清一起培養，然後將所述細胞與活化素A和另一濃度的血清一起培養，如D』Amour等人，Nature Biotechnology 23,1534-1541(2005)中所公開。作為另一替代方式，可通過將多能幹細胞在含有活化素A的培養基中在不存在血清的情況下培養，然後將所述細胞與活化素A和血清一起培養，使多能幹細胞分化成表達定形內胚層細胞的特徵性標誌物的細胞，如D』Amour等人，Nature Biotechnology,2005中所公開。另外，可通過將多能幹細胞在含有活化素A和WNT配體的培養基中在不存在血清的情況下培養，然後去除WNT配體並將所述細胞與活化素A和血清一起培養，使多能幹細胞分化成表達定形內胚層譜系的特徵性標誌物的細胞，如D』Amour等人，Nature Biotechnology 24,1392-1401(2006)中所公開。
在本發明的一個實施方案中，用活化素A和WNT3A處理多能幹細胞，以導致形成表達定形內胚層細胞的特徵性標誌物的細胞。處理可涉及使多能幹細胞與約50ng/ml至約150ng/ml、或者約75ng/ml至約125ng/ml、或者約100ng/ml的活化素A接觸。處理還可涉及使所述細胞與約10ng/ml至約50ng/ml、或者約15ng/ml至約30ng/ml、或者約20ng/ml的WNT3A接觸。可將多能細胞培養三天左右以獲得定形內胚層細胞。在一個實施方案中，在活化素A和WNT3A的存在下培養細胞一天，接著在活化素A(不存在WNT3A)的存在下培養細胞剩餘的時間。
可通過在執行特定方案前後分別檢測是否存在定形內胚層細胞的特徵性標誌物，來確定是否形成了表達這些特徵性標誌物的細胞。多能幹細胞通常不表達此類標誌物。因此，在細胞開始表達定形內胚層的特徵性標誌物後，就能夠檢測到多能細胞的分化。
第2階段：使表達定形內胚層細胞的特徵性標誌物的細胞分化成表達腸管細胞的特徵性標誌物的細胞。
可使表達定形內胚層細胞的特徵性標誌物的細胞進一步在生長培養基(諸如MCDB-131或DMEM F12)中分化成表達腸管細胞的特徵性標誌物的細胞。在一個實施方案中，表達腸管細胞的特徵性標誌物的細胞的形成包括：用包含成纖維細胞生長因子(「FGF」)，優選FGF7或FGF10的培養基來培養表達定形內胚層細胞的特徵性標誌物的細胞，從而分化細胞。例如，細胞培養物可包含約10ng/ml至約75ng/ml，或者約25ng/ml至約75ng/ml，又或者約30ng/ml至約60ng/ml，或者約50ng/ml的成纖維細胞生長因子，優選地為FGF7或FGF10，更優選地為FGF7，並且最優選地為約25ng/ml FGF7。可在這些條件下培養所述細胞約二至三天，優選地約兩天。
在另一個實施方案中，表達腸管細胞的特徵性標誌物的細胞的形成包括：用成纖維細胞生長因子，優選地FGF7或FGF10，和抗壞血酸(維生素C)來培養表達定形內胚層譜系的特徵性標誌物的細胞。該培養基可包含約0.1mM至約0.5mM的抗壞血酸、或者約0.2mM至約0.4mM抗壞血酸、或者約0.25mM的抗壞血酸。細胞培養物還可包含約10ng/ml至約35ng/ml、或者約15ng/ml至約30ng/ml、或者約25ng/ml的成纖維細胞生長因子，優選地FGF7或FGF10，更優選地FGF7。例如，該細胞培養物可包含約0.25mM的抗壞血酸和約25ng/ml的FGF7。在一個實施方案中，用FGF7和抗壞血酸處理第1階段細胞2天。
第3階段：表達腸管細胞的特徵性標誌物的細胞分化成表達表達前腸內胚層細胞的特徵性標誌物的細胞。
通過在生長培養基(諸如MCDB-131、DMEM)或定製培養基(諸如BLAR)中培養這些細胞，可以將從進行第2階段得到的腸管細胞進一步分化成第3階段細胞或表達前腸內胚層特徵性標誌物的細胞(表I)。培養基可補充有：(i)成纖維細胞生長因子，優選地FGF7或FGF10，並且更優選地FGF7；(ii)視黃酸(「RA」)；(iii)音蝟因子(「SHH」)信號轉導途徑拮抗劑(諸如Smoothened拮抗劑1(「SANT-1」)，其為1-哌嗪胺、N-[(3,5-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-基)亞甲基]-4-(苯基甲基)-或((E)-4-苄基-N-((3,5-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-基),亞乙基-哌嗪-1-胺)，HPI-1，其為2-甲氧基乙基1,4,5,6,7,8-六氫-4-(3羥基苯基)-7-(2-甲氧基苯基)-2-甲基-5-氧代-3-喹啉羧酸鹽，並且優選地SANT-1；(iv)蛋白激酶C(「PKC」)活化劑，諸如((2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(三氟甲基)苯基)-2,4-戊二烯醯氨基)苯並內醯胺)(「TPB」)，佛波醇-12,13-二丁酸酯(「PDBu」)，佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(「PMA」)或吲哚內醯胺V(「ILV」)並且優選地TPB；(v)骨形態發生蛋白質(「BMP」)抑制劑，諸如LDN-193189，頭蛋白或脊索發生素並且優選地LDN-193189；以及(vi)抗壞血酸。另選地，Smoothened(「SMO」)受體抑制劑(諸如MRT10(N[[[3-苯甲醯基氨基)苯基]氨基]硫代甲基]-3,4,5-三甲氧基苯甲醯胺))或環巴胺也可使用。例如，細胞培養物可包含約100nM至約500nM，或者約100nM至約400nM，或者約200nM的PKC活化劑。可在存在這些生長因子、小分子激動劑和拮抗劑的情況下培養細胞約二至四天，優選地約二至三天，更優選地約兩天。
另選地，第2階段細胞可通過以下步驟分化成第3階段細胞：在補充有SMO受體抑制劑、SANT-1、視黃酸、以及頭蛋白的培養基中培養這些細胞。可將第2階段細胞培養約二至四天，優選地約兩天。
在一個實施方案中，培養基補充有：約10ng/ml至約35ng/ml，或者約15ng/ml至約30ng/ml，或者約25ng/ml的成纖維細胞生長因子，優選地FGF7或FGF10，更優選地FGF7；約0.1mM至約0.5mM抗壞血酸，或者約0.2mM至約0.4mM，或者約0.25mM的抗壞血酸；約0.1μM至約0.4μM的SANT-1；約100nM至約300nM的TPB；以及約50nM至約200nM，和約100nM的LDN-193189。在另一個實施方案中，該培養基補充有約25ng/ml FGF-7、約1μM視黃酸、約0.25μM SANT-1、約200nM TPB、約100nM LDN-193189和約0.25mM抗壞血酸。
在一個實施方案中，該培養基補充有約0.1μM至約0.3μM SANT-1、約0.5μM至約3μM視黃酸，和約75ng/ml至約125ng/ml頭蛋白。
第4階段至第7階段：通過以下方式使表達前腸內胚層細胞特徵性標誌物的細胞分化成表達成熟表型胰腺內分泌細胞特徵性標誌物的細胞：用補充有甲狀腺激素和ALK抑制劑中的一種或兩種連同極光激酶抑制劑、RSK抑制劑和蛋白質甲基轉移酶DOT1L的抑制劑中的一種或多種的培養基處理，優選地在空氣-液體界面處培養。
雖然在一個實施方案中，本發明設想在從多能細胞至胰腺內分泌細胞的途徑中的所有階段中在空氣-液體界面處培養，但是本發明優選地提供在平面或浸沒的培養物中形成第1階段至第4階段細胞，以及通過在空氣-液體界面處培養細胞形成第5、第6和第7階段的細胞。在其它實施方案中，本發明涉及分化多能細胞的分步方法，包括在空氣-液體界面處培養第4、第5和第6階段的細胞。在某些實施方案中，在第4階段至第7階段期間培養的細胞可在空氣-液體界面處培養。在其它實施方案中，僅有第4階段後期至第6階段的細胞、或第5階段和第6階段的細胞在空氣-液體界面處培養。在又一個另選的實施方案中，第1階段至第4階段通過在浸沒的平面培養物中培養細胞來進行，並且第5階段至第7階段通過在浸沒的懸浮培養物中培養來進行。
另外，在T3、T4及其類似物中的一種或多種，ALK5抑制劑，或者T3，T4及其類似物中的一種或多種和ALK5抑制劑兩者的存在下在第5、第6和第7階段中的一個或多個，以及優選地所有階段期間進行培養。在優選的實施方案中，在T3和ALK5抑制劑的存在下並且更新優選地在T3和ALK5抑制劑II的存在下，在第5、第6和第7階段中的一個或多個，以及優選地所有階段期間進行培養。甲狀腺激素或其類似物的合適量為約0nM至約1000nM，或者約10nM至約900nM，或者約100nM至約800nM，或者約200nM至約700nM，或者約300nM至約600nM，或者約400nM至約500nM，或者約1nM至約500nM，或者約1nM至約100nM，或者約100nM至約1000nM，或者約500nM至約1000nM，或者約100nM至約500nM，或者約1μM，並且優選地約0.1μM至1μM。ALK5抑制劑的量為約250nM至2μM，或者約300nM至約2000nM，或者約400nM至約2000nM，或者約500nM至約2000nM，或者約600nM至約2000nM，或者約700nM至約2000nM，或者約800nM至約2000nM，或者約1000nM至約2000nM，或者約1500nM至約2000nM，或者約250nM至約1000nM，或者約250nM至約500nM，或者約300nM至約1000nM，或者約400nM至約1000nM，或者約500nM至約1000nM，或者約600nM至約1000nM，或者約700nM至約1000nM，或者約800nM至約1000nM，或者約500nM，或者約10μM，並且優選地約10μM。
當在空氣-液體界面(「ALI」)處培養細胞時，可在多孔基質上培養細胞，使得所述細胞在頂側上與空氣接觸，並且在底側處與細胞培養基接觸。例如，可將足夠體積的培養基添加至包含所述多孔基質(例如，過濾器芯子(filter insert))的培養容器的底部，使得培養基接觸存在於基質上的細胞的底表面但是不包封或浸沒它們。合適的多孔基質可由將不會對細胞的生長和分化產生不利影響的任意材料形成。示例性多孔基質是由聚合物製成的，諸如聚對苯二甲酸乙二酯(「PET」)、聚酯或聚碳酸酯。合適的多孔基質可經塗覆或未經塗覆。在一個實施方案中，塗層可為MATRIGELTM。在本發明的一個實施方案中，多孔基質是可塗覆有MATRIGELTM的多孔過濾器芯子。在本發明的一個實施方案中，多孔基質是未塗覆的過濾器芯子。基質的孔隙率應當足以維持細胞活力並且促進細胞的分化。合適的基質包括具有以下孔尺寸的過濾器芯子：約0.3μm至約3.0μm，約0.3μm至約2.0μm，約0.3μm至約1.0μm，約0.3μm至約0.8μm，約0.3μm至約0.6μm，約0.3μm至約0.5μm，約0.3μm至約3.0μm，約0.6μm至約3.0μm，約0.8μm至約3.0μm，約1.0μm至約3.0μm，約2.0μm至約3.0μm，優選地約0.4μm；以及以下孔密度：約50至約120百萬個孔/cm2，約60至約110百萬個孔/cm2，約70至約100百萬個孔/cm2，優選地約80至約100百萬個孔/cm2，約90至約100百萬個孔/cm2，並且更優選地約100百萬個孔/cm2。
培養基可以每隔一天或優選地每天更換或更新。在多孔基質的頂部上生長的細胞一般不是單個細胞，而相反它們呈片形式或以聚集細胞簇形式存在的。相較於浸沒在培養基中的細胞，在ALI處培養的細胞可經歷更高的氧張力。
本發明涵蓋在空氣-液體界面處形成第4至第7階段的細胞，優選地第5至第7階段的細胞。細胞可通過使多能幹細胞分化形成，或通過進一步分化第3、第4、第5或第6階段的細胞而形成。可完全在空氣-液體界面處培養第4階段細胞，或可在第4階段的早期部分期間在浸沒的平面培養物中培養細胞，意味著約一至兩天，並且隨後在第4階段的後期部分期間在空氣-液體界面處培養細胞，意味著約第二天至第三天。優選地，第4階段不在ALI處進行，而是在浸沒的培養物中進行。
在一個實施方案中，本發明提供了一種用於從多能幹細胞產生表達胰腺內分泌細胞特徵性標誌物的細胞的方法，所述方法包括培養多能幹細胞，使所述多能幹細胞分化成表達前腸內胚層特徵性標誌物的細胞；通過任選地在空氣-液體界面處培養來使表達前腸內胚層的特徵性標誌物的細胞分化成表達胰腺內分泌細胞特徵性標誌物的細胞。該方法可包括用補充有(i)T3、T4或其類似物中的一種或兩種、(ii)ALK5抑制劑，或者(i)和(ii)兩者的培養基進行處理。該方法可包括通過用補充有(i)T3、T4或其類似物中的一種或兩種、(ii)ALK5抑制劑或(i)和(ii)兩者的培養基處理以及在平面培養物中培養來將表達前腸內胚層細胞(第3階段細胞)特徵性標誌物的細胞分化成表達胰腺前腸前體細胞(第4階段細胞)特徵性標誌物的細胞。該方法還可包括通過用補充有(i)T3、T4或其類似物中的一種或兩種、(ii)ALK5抑制劑或(i)和(ii)兩者的培養基處理以及在平面培養物中培養並且優選地在空氣-液體界面處培養來將表達胰腺前腸前體細胞(第4階段細胞)特徵性標誌物的細胞分化成表達胰腺內分泌細胞(第6階段細胞)特徵性標誌物的細胞。該方法還包括通過用補充有(i)T3、T4或其類似物中的一種或兩種、(ii)ALK5抑制劑或(i)和(ii)兩者連同極光激酶抑制劑、RSK抑制劑和蛋白質甲基轉移酶DOT1L的抑制劑中的一種或多種，以及任選但優選抗氧化劑諸如維生素E，或優選乙醯基半胱氨酸的培養基處理來將第6階段細胞分化成表達胰腺內分泌細胞特徵性標誌物並且與第6階段相比具有更成熟表型的細胞(第7階段細胞)。可用的乙醯基半胱氨酸的量為約0.1mM至約2mM。維生素E的量為約0.1μM至約10μM。在又一個實施方案中，所述方法還包括通過用補充有(i)T3、T4或其類似物中的一種或兩種、(ii)ALK5抑制劑或(i)和(ii)兩者連同極光激酶抑制劑、RSK抑制劑和蛋白質甲基轉移酶DOT1L的抑制劑中的一種或多種的培養基處理第5階段細胞來進行第6階段。在另外的實施方案中，通過用補充有(i)T3、T4或其類似物中的一種或兩種、(ii)ALK5抑制劑或(i)和(ii)兩者連同極光激酶抑制劑、RSK抑制劑和蛋白質甲基轉移酶DOT1L的抑制劑中的一種或多種的培養基處理第5階段細胞來進行第6階段，然後通過用補充有(i)T3、T4或其類似物中的一種或兩種、(ii)ALK5抑制劑或(i)和(ii)兩者連同極光激酶抑制劑、RSK抑制劑和蛋白質甲基轉移酶DOT1L的抑制劑中的一種或多種，以及任選但優選抗氧化劑諸如維生素E，或優選乙醯基半胱氨酸的培養基處理來進行第7階段。
本發明的一個實施方案是形成表達成熟β細胞(第7階段細胞)的特徵性標誌物的胰腺內分泌細胞的方法，所述方法包括通過優選地在空氣-液體界面處培養來將表達胰腺前腸前體細胞(第4階段細胞)的特徵性標誌物的細胞分化成表達第7階段細胞的特徵性標誌物的細胞。在另一個實施方案中，本發明的方法導致形成第6階段細胞，或是未成熟β細胞的細胞。優選地至少在第5至第7階段期間，該方法包括用補充有T3、T4或其類似物、ALK5抑制劑、或兩者的培養基進行處理。
在空氣-液體界面處培養細胞包括將細胞接種到多孔基質諸如多孔過濾器芯子上。在某些實施方案中，基質的孔尺寸範圍可為約0.3微米至約3微米。接種可通過以下方式實現：將細胞作為單細胞從單層培養物釋放或作為細胞簇從單層培養物釋放到懸浮液中，隨後將單細胞懸浮液或懸浮的細胞培養物等分到在ALI處的多孔基質上。細胞可從懸浮液接種到多孔基質上，該懸浮液具有約1000個細胞/μl至約100,000個細胞/μl，約1000個細胞/μl至約90,000個細胞/μl，約1000個細胞/μl至約80,000個細胞/μl，約1000個細胞/μl至約70,000個細胞/μl，約1000個細胞/μl至約60,000個細胞/μl，約1000個細胞/μl至約50,000個細胞/μl，約1000個細胞/μl至約40,000個細胞/μl，約1000個細胞/μl至約30,000個細胞/μl，約1000個細胞/μl至約20,000個細胞/μl，約1000個細胞/μl至約10,000個細胞/μl，約1000個細胞/μl至約5000個細胞/μl，約5000個細胞/μl至約100,000個細胞/μl，約10,000個細胞/μl至約100,000個細胞/μl，約20,000個細胞/μl至約100,000個細胞/μl，約30,000個細胞/μl至約100,000個細胞/μl，約40,000個細胞/μl至約100,000個細胞/μl，約50,000個細胞/μl至約100,000個細胞/μl，約60,000個細胞/μl至約100,000個細胞/μl，約20,000個細胞/μl至約80,000個細胞/μl，約30,000個細胞/μl至約70,000個細胞/μl，約40,000個細胞/μl至約60,000個細胞/μl，並且優選地約50,000個細胞/μl。細胞可作為包含單個細胞或細胞聚集體或細胞簇的細胞懸浮液的液滴而接種。所得細胞沉積物可包含約5×106至約5×107個細胞/cm2，約6×106至約5×107個細胞/cm2，約7×106至約5×107個細胞/cm2，約8×106至約5×107個細胞/cm2，約9×106至約5×107個細胞/cm2，約1×107至約5×107個細胞/cm2，約2×107至約5×107個細胞/cm2，約3×107至約5×107個細胞/cm2，約4×107至約5×107個細胞/cm2，約5×106至約4×107個細胞/cm2，約5×106至約3×107個細胞/cm2，約5×106至約2×107個細胞/cm2，約5×106至約1×107個細胞/cm2，約5×106至約9×106個細胞/cm2，約5×106至約8×106個細胞/cm2，約5×106至約7×106個細胞/cm2，約5×106至約6×106個細胞/cm2，約7×106至約4×107個細胞/cm2，約8×106至約3×107個細胞/cm2，約9×106至約2×107個細胞/cm2，並且優選地約1×107個細胞/cm2的量級。
在另一個實施方案中，本發明涉及通過在優選地空氣-液體界面處培養和分化PDX1和NKX6.1共表達細胞的群體來增加單激素陽性細胞(例如，共表達NKX6.1和胰島素的細胞，或共表達NKX6.1和嗜鉻粒蛋白的細胞)的數目的方法。在另一個實施方案中，在空氣-液體界面處培養的胰腺內胚層細胞通過用選自以下的化合物處理而進一步分化成胰腺內分泌細胞：ALK5抑制劑、BMP抑制劑、γ-分泌酶抑制劑、Ephrin配體、EphB抑制劑、PKC抑制劑、EGFr抑制劑、視黃酸、維生素C、T3/T4、葡萄糖、細胞周期調節因子、WNT調節因子、SHH抑制劑、極光抑制劑、抗氧化劑、維生素E、乙醯基半胱氨酸、或它們的組合。
在另外的實施方案中，本發明涉及分化多能細胞的分步方法，該方法包括在含有足夠量的(i)T3、T4及其類似物中的一種或多種、(ii)ALK5抑制劑或(i)和(ii)兩者的培養基中培養第4階段至第6階段細胞，以及在任選且優選地含有極光激酶抑制劑、RSK抑制劑、蛋白質甲基轉移酶DOT1L的抑制劑和抗氧化劑中的一種或多種的培養基中進一步培養第6階段細胞以生成表達胰島素、PDX1、NKX6.1和MAFA的胰腺內分泌細胞和胰腺內分泌細胞群。
在一些實施方案中，所得細胞群的至少10％的細胞表達胰島素、PDX1、NKX6.1和MAFA。在其它實施方案中，該群體的至少20％的細胞表達胰島素、PDX1、NKX6.1和MAFA。在其它實施方案中，該群體的至少30％的細胞表達胰島素、PDX1、NKX6.1和MAFA。在另外的實施方案中，該群體的至少40％的細胞表達胰島素、PDX1、NKX6.1和MAFA。在其它實施方案中，該群體的至少50％的細胞表達胰島素、PDX1、NKX6.1和MAFA。在另選的實施方案中，至少60％的細胞表達胰島素、PDX1、NKX6.1和MAFA。在另外的另選的實施方案中，該群體的至少70％的細胞表達胰島素、PDX1、NKX6.1和MAFA。在其它實施方案中，該群體的至少80％的細胞表達胰島素、PDX1、NKX6.1和MAFA。在其它實施方案中，該群體的至少90％的細胞表達胰島素、PDX1、NKX6.1和MAFA。在另選的實施方案中，該群體的至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的細胞表達胰島素、PDX1、NKX6.1和MAFA。
第4階段：使表達前腸內胚層細胞的特徵性標誌物的細胞分化成表達胰腺前腸前體細胞的特徵性標誌物的細胞。
在一個實施方案中，本發明的方法包括用分化培養基處理第3階段細胞，該分化培養基可為任何合適的生長培養基並且優選地為MCDB-131、DMEM或定製培養基諸如BLAR(表I)。該培養基可補充有以下中的一者或多者：(a)ALK5抑制劑，選自：TGF-β受體抑制劑V、TGF-β受體抑制劑I、TGF-β受體抑制劑IV、TGF-β受體抑制劑VII、TGF-β受體抑制劑VIII、TGF-β受體抑制劑II、TGF-β受體抑制劑VI、TGF-β受體抑制劑III、TGF-β抑制劑SB431542、SD-208、ITD-1、LY2109761、A83-01、LY2157299、ALK5i和ALK5抑制劑II；(b)甲狀腺激素，選自T3、T4、T3的類似物、T4的類似物以及它們的混合物；(c)SHH信號轉導途徑拮抗劑，選自SANT-1或HIP-1；(d)BMP受體抑制劑，選自LDN-193189、頭蛋白或脊索發生素；(e)PKC活化劑，選自TPB、PPBu、PMA和ILV；(f)成纖維細胞生長因子，選自FGF-7或FGF-10；(g)視黃酸；以及(h)抗壞血酸。例如，生長培養基，諸如MCDB131或優選地BLAR，可補充有SHH信號轉導途徑拮抗劑(諸如SANT-1或HPI-1)、BMP抑制劑(諸如LDN-193189、頭蛋白或脊索發生素)、抗壞血酸，以及PKC活化劑(諸如TPB、PDBu、PMA或ILV)，以提供可用的分化培養基。在此類培養基中培養第3階段細胞約二至四天，優選地約二至三天，更優選地約三天通常足以使第3階段細胞分化成第4階段細胞。在另一個實施方案中，培養基可補充有SMO抑制劑和SHH信號轉導途徑拮抗劑。在優選的實施方案中，可用補充有約0.25μM的SANT-1；約100nM的RA；約2ng/ml的FGF7；約100nM的LDN-193189；和約0.25mM的抗壞血酸；以及約200nM的培養基處理第3階段細胞三天。
在第4階段中，在整個階段期間，並且優選地，在平面培養約2至3天後，細胞可以在空氣-液體界面處培養。具體地講，本發明提供了用於使衍生自多能幹細胞的細胞在空氣-液體界面處分化的體外細胞培養物，所述體外細胞培養物包括：(a)培養容器；(b)所述容器內一定體積的生長培養基，該體積足以填充容器的體積的僅一部分；(c)容器內的空氣，該空氣填充鄰接培養基的容器的一部分；(d)位於培養基和空氣之間的界面處的多孔基質；以及(e)衍生自設置在基質表面上以使得培養基接觸細胞表面的僅一部分的多能幹細胞的細胞。另選地，第4階段可完全在平面培養物中進行。
在另外的實施方案中，在第4階段完成時可用Rho相關激酶(「ROCK」)抑制劑處理細胞，所述抑制劑諸如Y27632((1R,4r)-4-((R)-1-氨基乙基)-N-(吡啶-4-基)環己甲醯胺)、GSK269962(N-[3-[[2-(4-氨基-1,2,5-噁二唑-3？-基)-1-乙基-1H-咪唑並[4,5-c]吡啶-6-基]氧]苯基]-4-[2-(4-嗎啉基)乙氧基]苯甲醯胺)、H1152((S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-異喹啉基)磺醯]高哌嗪二鹽酸鹽)和SR3677(N-[2-[2-(二甲氨基)乙氧基]-4-(1H-吡唑-4-基)苯基-2,3-二氫-1,4-苯並二氧雜苯-2-甲醯胺二鹽酸鹽)。在某些實施方案中，可使用約1μM至20μM，或者約1μM至15μM，或者約1μM至10μM，優選地約10μM的ROCK抑制劑。
在某些實施方案中，僅在第4階段後期的細胞，意指已在平面培養物中培養1至2天的細胞，可隨後在空氣-液體界面處培養以便完成第4階段。在一個實施方案中，僅在第4階段的後期在空氣-液體界面處培養用ROCK抑制劑處理過的細胞。在其它實施方案中，0.5至約0.75×105個細胞/微升被接種為在空氣-液體界面處培養，或者，約2至6×106個細胞被接種為在空氣-液體界面處培養。在某些實施方案中，在空氣-液體界面處培養之前，可用細胞脫附溶液處理細胞，所述細胞脫附溶液為諸如包含蛋白水解酶和膠原蛋白酶(諸如TrypLETM、AccutaseTM或DispaseTM)的溶液。
在另選的實施方案中，可用包含補充有ALK5抑制劑、頭蛋白和PKC活化劑(諸如TPB)的生長培養基的分化培養基處理第3階段細胞。在某些實施方案中，培養基可補充有約0.1μM的ALK5抑制劑、約100ng/ml的頭蛋白、以及約500nM的TPB。細胞培養物可為單層形式。處理可持續總共約三天。在某些實施方案中，可處理細胞兩天，隨後在最後一天可用蛋白水解酶、膠原蛋白酶，或蛋白水解酶和膠原蛋白酶兩者，諸如DispaseTM處理細胞，使細胞分散成直徑小於約100微米的細胞簇，接著在ALK5抑制劑和LDN-193189的存在下培養。在某些實施方案中，可在補充有約200nM的ALK5抑制劑和約100nM的LDN-193189的培養基中培養直徑小於約100微米的細胞簇。在另選的實施方案中，在空氣-液體界面處培養第4階段細胞可顯著增加胰腺內胚層標誌物連同內分泌相關標誌物。因此，本發明提供通過在空氣-液體界面處培養第4階段細胞來增加胰腺內胚層標誌物和內分泌相關標誌物的方法。
第5階段：使表達胰腺前腸前體細胞的特徵性標誌物的細胞分化成表達胰腺內胚層/內分泌前體細胞的特徵性標誌物的細胞。
在一個實施方案中，本發明的方法包括用分化培養基處理第4階段細胞，該分化培養基可為任何合適的生長培養基並且優選地為MCDB-131、DMEM或優選地定製培養基諸如BLAR(表I)。該培養基可補充有以下中的一者或多者：(a)ALK5抑制劑，選自：TGF-β受體抑制劑V、TGF-β受體抑制劑I、TGF-β受體抑制劑IV、TGF-β受體抑制劑VII、TGF-β受體抑制劑VIII、TGF-β受體抑制劑II、TGF-β受體抑制劑VI、TGF-β受體抑制劑III、TGF-β抑制劑SB431542、SD-208、ITD-1、LY2109761、A83-01、LY2157299、ALK5i和ALK5抑制劑II；(b)甲狀腺激素，選自T3、T4、T3的類似物、T4的類似物、以及它們的混合物；(c)SHH信號轉導途徑拮抗劑，選自SANT-1或HIP-1；(d)BMP受體抑制劑，選自LDN-193189、頭蛋白或脊索發生素；(e)視黃酸；(f)抗壞血酸；(g)肝素；以及(h)硫酸鋅；並且優選地在空氣-液體界面處培養細胞約二至四天，優選地約三天，以使所述細胞分化成第5階段細胞。在另一個實施方案中，生長培養基還補充有SMO抑制劑(諸如MRT10或環巴胺)和優選地選自FGF-7或FGF-10的成纖維細胞生長因子中的一者或兩者。對第4階段細胞的處理進行約二至四天，優選地約3天以將細胞分化成第5階段細胞。
在優選的實施方案中，第4階段細胞通過用補充有以下物質的培養基處理細胞來分化成第5階段細胞：約0.1μM至約0.4μM的SANT-1並且優選約0.25μM的SANT-1，約50nM的RA，約0.1mM至約0.5mM的抗壞血酸、或者約0.2mM至約0.4mM並且優選地約0.25mM的抗壞血酸，約50nM至約200nM並且優選地約100nM的LDN-193189，約1μM的T3，以及約10000nM的ALK5抑制劑、更優選地ALK 5抑制劑II。在另外的實施方案中，細胞還任選且優選地用以下物質處理：約1μM至15μM、或者約1μM至10μM的ZnSO4、或者約5μM至10μM、優選地約10μM的硫酸鋅以及約1μg/ml至100μg/ml，優選地約10μg/ml的肝素。對第4階段細胞的處理進行約二至四天，優選地約3天以將細胞分化成第5階段細胞。
在又一個實施方案中，本發明的方法包括：用補充有肝素、SMO抑制劑或SHH信號轉導途徑拮抗劑、RA、BMP受體抑制劑和ALK5抑制劑的培養基處理第4階段細胞，以及在空氣-液體界面處培養細胞約3天，以使所述細胞分化成第5階段細胞。在另選的實施方案中，培養基可補充有SMO抑制劑和SHH信號轉導途徑拮抗劑兩者，連同RA、BMP受體抑制劑和ALK5抑制劑。因此，在一個實施方案中，可通過用補充有肝素、ZnSO4、SMO抑制劑或SHH信號轉導途徑拮抗劑、RA、LDN-193189和ALK5抑制劑II的培養基處理第4階段細胞，來使第4階段細胞分化成第5階段細胞。在另選的實施方案中，培養基可補充有SMO抑制劑和SHH信號轉導途徑拮抗劑兩者。在一個實施方案中，通過用補充有約10μg/ml的肝素、約0.25μM的SANT-1、約50nM的RA、約50nM的LDN-193189、約10nM的T3和約1000nM的ALK5抑制劑的培養基處理細胞，來使第4階段細胞分化成第5階段細胞。合適的ALK5抑制劑包括但不限於SD-208、ALK5抑制劑II、TGF-β受體抑制劑V、TGF-β受體抑制劑I、TGF-β受體抑制劑IV、TGF-β受體抑制劑VII、TGF-β受體抑制劑VIII、TGF-β受體抑制劑II、TGF-β受體抑制劑VI、TGF-β受體抑制劑III，以及它們的組合。對第4階段細胞的處理進行約二至四天，優選地約3天以將細胞分化成第5階段細胞。
在優選的實施方案中，ALK5抑制劑為ALK5抑制劑II。在另一個優選實施方案中，使用約10000nM的ALK5抑制劑II。在另選的優選實施方案中，用補充有約10μg/ml的肝素、約0.25μM的SANT-1、約50nM的RA、約100nM的LDN-193189，以及約10000nM的ALK5抑制劑II的培養基處理第4階段細胞。在又一個另選的實施方案中，本發明的方法包括：用補充有SMO抑制劑或SHH信號轉導途徑拮抗劑、RA以及ALK5抑制劑的培養基處理第4階段細胞，以及優選地在空氣-液體界面處培養細胞約兩天至四天，優選地約3天，以使所述細胞分化成第5階段細胞。在另選的實施方案中，培養基可補充有SMO抑制劑和SHH信號轉導途徑拮抗劑兩者。在一個實施方案中，通過用補充有約0.25μM的SANT-1、約50nM的RA、約50nM的LDN-193189、約1μM的T3和約1000nM的ALK5抑制劑的培養基處理細胞，來使第4階段細胞分化成第5階段細胞。
用於在空氣-液體界面處培養的接種細胞量可變化。例如，為了在空氣-液體界面處培養細胞，可將含有約0.5至6×105個細胞/μl的細胞懸浮液的液滴接種在多孔基質(例如，過濾器)上。懸浮液可含有約2×105個細胞/μl至約6×105個細胞/μl，約4×105個細胞/μl至約6×105個細胞/μl，約5×105個細胞/μl至約6×105個細胞/μl，約5×105個細胞/μl至約6×105個細胞/μl，約2×105個細胞/μl至約5×105個細胞/μl，約2×105個細胞/μl至約4×105個細胞/μl，或約3×105個細胞/μl，其可被接種到多孔基質諸如位於空氣-液體界面處的過濾器上。在一些實施方案中，將含有約0.5×105個細胞/μl至約0.75×105個細胞/μl，約0.6×105個細胞/μl至約0.75×105個細胞/μl，或約0.5×105個細胞/μl至約0.6×105個細胞/μl的細胞懸浮液的液滴接種到多孔支承體上以在ALI處培養。
在另一個實施方案中，本發明的方法包括：用補充有BMP受體抑制劑(例如，LDN-193189、頭蛋白或脊索發生素)和ALK5抑制劑的培養基處理第4階段細胞約1天，以使第4階段細胞分化成第5階段細胞。例如，培養基可補充有約100nM的LDN-193189和約100nM的ALK5抑制劑以及約1μM的T3。所述細胞可為細胞簇形式。在某些實施方案中，在空氣-液體界面處培養之前，可用細胞脫附溶液處理細胞，所述細胞脫附溶液為諸如包含蛋白水解酶和膠原蛋白酶的溶液。
根據前述方法，本發明還提供了用於使表達胰腺前腸前體的特徵性標誌物的細胞分化成表達胰腺內胚層/胰腺內分泌前體細胞的特徵性標誌物的細胞的細胞培養物，所述細胞培養物包括：(a)培養容器；(b)所述容器內一定體積的生長培養基，該體積足以填充所述容器的體積的僅一部分；(c)所述容器內的空氣，該空氣填充鄰接所述培養基的所述容器的一部分；(d)位於所述培養基和所述空氣之間的界面處的多孔基質；以及(e)表達衍生自設置在所述基質表面上以使得所述培養基接觸所述細胞表面的僅一部分的多能幹細胞的胰腺前腸前體細胞的特徵性標誌物的細胞。
第6階段：使表達胰腺內胚層/內分泌前體細胞的特徵性標誌物的細胞分化成表達胰腺內分泌細胞的特徵性標誌物的細胞。
在一個實施方案中，本發明的方法包括用分化培養基處理第5階段細胞，該分化培養基可為任何合適的生長培養基，優選地諸如MCDB-131或CMRL，並且更優選定製培養基諸如BLAR(表I)。該培養基可補充有以下中的一者或多者：(a)ALK5抑制劑，選自：TGF-β受體抑制劑V、TGF-β受體抑制劑I、TGF-β受體抑制劑IV、TGF-β受體抑制劑VII、TGF-β受體抑制劑VIII、TGF-β受體抑制劑II、TGF-β受體抑制劑VI、TGF-β受體抑制劑III、TGF-β抑制劑SB431542、SD-208、ITD-1、LY2109761、A83-01、LY2157299、ALK5i和ALK5抑制劑II；(b)甲狀腺激素，選自T3、T4、它們的類似物和它們的混合物；(c)BMP受體抑制劑，優選地選自LDN-193189、頭蛋白或脊索發生素；(d)γ分泌酶抑制劑，諸如γ分泌酶抑制劑XX、γ分泌酶抑制劑XXI、γ分泌酶抑制劑XVI或DAPT；(e)抗壞血酸；(f)肝素；以及(g)硫酸鋅，並且優選地在空氣-液體界面處培養約二至四天，優選地約三天，以使第5階段細胞分化成第6階段細胞。任選地，培養基可另外地補充有SHH信號轉導途徑拮抗劑、smoothened受體抑制劑、成纖維細胞生長因子和視黃酸中的一種或多種。
在優選的實施方案中，可通過用補充有約50nM的RA、約0.25mM的抗壞血酸、約100nM的LDN-193189、約10000nM的ALK5抑制劑並且優選地ALK 5抑制劑II、1μM的T3、約100nM的γ分泌酶抑制劑的培養基處理約七天來使第5階段細胞分化成第6階段細胞。另選地，可通過用補充有約0.25μM的SANT-1、約50nM的RA、約0.25mM的抗壞血酸、約1000nM的ALK5抑制劑和1μM的T3的培養基處理第5階段細胞約三天，使其分化成第6階段細胞。可根據需要，將細胞在此類培養基中再培養兩天或以上。
另選地，可通過用補充有肝素、SMO抑制劑或SHH信號轉導途徑拮抗劑、BMP抑制劑、T3、T4、其類似物及其混合物，以及ALK5抑制劑的培養基處理並且優選地在空氣-液體界面處培養約一至七天，或者約六天，或者約七天來使第5階段細胞分化成第6階段細胞。在另選的實施方案中，培養基可補充有SMO抑制劑和SHH信號轉導途徑拮抗劑兩者。例如，細胞可在補充有約10μg/ml的肝素、約0.25μM的SANT-1、約100nM的LDN-193189、約1000nM的T3、以及約500nM至約10,000nM，或者約500nM，或者約1000mM，並且或者約10,000nM的ALK5抑制劑的培養基中培養。合適的ALK5抑制劑包括但不限於SD-208、ALK5抑制劑II、TGF-β受體抑制劑V、TGF-β受體抑制劑I、TGF-β受體抑制劑IV、TGF-β受體抑制劑VII、TGF-β受體抑制劑VIII、TGF-β受體抑制劑II、TGF-β受體抑制劑VI、TGF-β受體抑制劑III，以及它們的組合。
在優選的實施方案中，ALK5抑制劑為ALK5抑制劑II。在更優選的實施方案中，使用約10000nM的ALK5抑制劑II。因此，在一個實施方案中，可通過用補充有肝素、SMO抑制劑或SHH信號轉導途徑拮抗劑、BMP抑制劑、T3、T4、其類似物及其混合物，以及ALK5抑制劑的培養基處理並且優選地在空氣-液體界面處優選地培養約七天來使第5階段細胞分化成第6階段細胞。在另選的實施方案中，培養基可補充有SMO抑制劑和SHH信號轉導途徑拮抗劑兩者。在某些實施方案中，在空氣-液體界面處培養之前，可用細胞脫附溶液處理細胞，所述細胞脫附溶液為諸如包含蛋白水解酶和膠原蛋白酶的溶液。
在另一個實施方案中，可通過用補充有肝素、SMO抑制劑或SHH信號轉導途徑拮抗劑、BMP抑制劑、T3和ALK5抑制劑II的培養基處理並且在空氣-液體界面處培養約5天至約7天，或者約5天，或者約6天，或者約7天來使第5階段細胞分化成第6階段細胞。在這些實施方案中，培養基可補充有約10μg/ml的肝素、約0.25μM的SANT-1、約100nM的LDN-193189、約1000nM的T3以及約10,000nM的ALK5抑制劑II。在某些實施方案中，培養基還可補充有硫酸鋅(ZnSO4)。例如，培養基可進一步補充有約10mM的ZnSO4。在另選的實施方案中，培養基可補充有SMO抑制劑和SHH信號轉導途徑拮抗劑兩者。
在本發明的特別優選的實施方案中，將極光激酶抑制劑優選地極光激酶抑制劑II、RSK抑制劑優選地RSK抑制劑II、以及蛋白質甲基轉移酶DOT1L的抑制劑優選地EPZ 5676中的一者或多者添加到培養基中。對於極光激酶和RSK抑制劑，所添加的量可為約100nM至5000nM，或者約1000nM至5000nM，或者約2000nM至5000nM，或者約3000nM至5000nM，並且優選地約1000nM至2000nM，並且對於DOT1L抑制劑，所添加的量為約100nM至1000nM，並且更優選地1μM至約10nM。
根據前述方法，本發明還提供了一種用於使表達胰腺內胚層/內分泌前體細胞的特徵性標誌物的細胞分化成表達胰腺內分泌細胞的特徵性標誌物的細胞的細胞培養物，所述細胞培養物包括：(a)培養容器；(b)所述容器內一定體積的生長培養基，該體積足以填充所述容器的體積的僅一部分；(c)所述容器內的空氣，該空氣填充鄰接所述培養基的所述容器的一部分；(d)位於所述培養基和所述空氣之間的界面處的多孔基質；以及(d)表達衍生自設置在所述基質表面上以使得所述培養基接觸所述細胞表面的僅一部分的多能幹細胞的胰腺內胚層/內分泌前體細胞的特徵性標誌物的細胞。
在一個實施方案中，利用根據本發明的實施方案培養的第5階段細胞並且使所述細胞分化成第6階段細胞，而在其它實施方案中可利用根據其它方案培養的第5階段細胞。
在另一個實施方案中，本發明的方法導致第6階段細胞的形成，所述第6階段細胞是單激素陽性的。因此，在一個實施方案中，本發明的方法產生共表達NKX6.1、胰島素、嗜鉻粒蛋白和PDX1的第6階段細胞。在另一個實施方案中，本發明的方法產生共表達NKX6.1和胰島素的第6階段細胞。在本發明的某些實施方案中，該方法在第4至第6階段或第4節段後期至第6階段，或第5和第6階段採用BLAR定製培養基(參見表I)。培養基可以並且優選地每天更換或另選地每隔一天更換。
在另一個實施方案中，本發明涉及形成共表達NKX6.1和嗜鉻粒蛋白的第6階段細胞的方法，所述方法包括在空氣-液體界面處培養第4階段，優選地第4階段後期細胞到第6階段細胞。在又一個實施方案中，本發明涉及通過在空氣-液體界面處培養第4階段，優選地第4階段後期細胞到第6階段細胞來形成表達NKX6.1的第6階段細胞的單激素胰島素陽性的細胞的方法。
第7階段：使表達胰腺內分泌細胞的特徵性標誌物的細胞分化成表達具有更成熟表型的胰腺內分泌細胞的特徵性標誌物的細胞。
在一個實施方案中，本發明的方法包括用分化培養基處理第6階段細胞，該分化培養基可為任何合適的生長培養基，優選地諸如MCDB-131或CMRL，並且更優選地定製培養基諸如BLAR(表I)。該培養基補充有以下物質中的一者或多者：(a)ALK5抑制劑，選自：TGF-β受體抑制劑V、TGF-β受體抑制劑I、TGF-β受體抑制劑IV、TGF-β受體抑制劑VII、TGF-β受體抑制劑VIII、TGF-β受體抑制劑II、TGF-β受體抑制劑VI、TGF-β受體抑制劑III、TGF-β抑制劑SB431542、SD-208、ITD-1、LY2109761、A83-01、LY2157299、ALK5i和ALK5抑制劑II；(b)甲狀腺激素，選自T3、T4、它們的類似物和它們的混合物；(c)肝素；(d)硫酸鋅；(e)抗氧化劑，選自維生素E、維生素C、乙醯基半胱氨酸、抗氧化劑補充劑A1345、穀胱甘肽、過氧化物歧化酶、過氧化氫酶以及它們的組合；(f)優選地為極光激酶抑制劑II的極光激酶抑制劑、優選地為RSK抑制劑II的RSK抑制劑、以及優選地為EPZ 5676的蛋白質甲基轉移酶DOT1L抑制劑中的一種或多種，並且優選地在空氣-液體界面處培養約七至二十一天，優選地約七至十天，更優選地約七天以使第6階段細胞分化成第7階段細胞。在一個實施方案中，生長培養基補充有T3、T4、其類似物及其混合物，ALK5抑制劑，抗氧化劑和極光激酶抑制劑優選極光激酶抑制劑II，或RSK抑制劑優選RSK抑制劑II。可通過用補充有約10000nM的ALK5抑制劑II、約1000nM的T3、約10μM的6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯並二氫吡喃-2-羧酸(「Trolox」)，以及約1μM至約1μM的極光激酶抑制劑II或RSK抑制劑II的培養基處理約七天，來使第6階段細胞分化成第7階段細胞。
在一個實施方案中，可通過用補充有約10000nM的ALK5抑制劑、約1μM的T3、約2μM的極光激酶抑制劑II、RSK抑制劑II和EPZ 5676中的一種或多種，以及約1mM的N-乙醯基半胱氨酸的培養基處理，來使第6階段細胞分化成第7階段細胞。另選地，還可添加約0.25μM的SANT-1、約50nM的RA、約0.25mM的抗壞血酸、以及約100nM的LDN-193189中的一種或多種。
另選地，可通過用補充有肝素、T3、T4、其類似物或其混合物、ALK5抑制劑、抗氧化劑、和極光激酶抑制劑、RSK抑制劑、DOT1L的蛋白甲基轉移酶抑制劑或它們的混合物的培養基處理，並且優選地在空氣-液體界面處培養約七至二十一天、或者約七至十天、優選地約七天，來使第6階段細胞分化成第7階段細胞。在另選的實施方案中，培養基可補充有視黃酸、SMO抑制劑、SHH信號轉導途徑拮抗劑、BMP受體抑制劑和N-乙醯基半胱氨酸中的一種或多種。
在優選的實施方案中，ALK5抑制劑為ALK5抑制劑II。在更優選的實施方案中，使用約10000nM的ALK5抑制劑II。因此，在一個實施方案中，可通過用補充有肝素、T3、T4、其類似物及其混合物、和ALK5抑制劑、抗氧化劑、以及極光激酶抑制劑、RSK抑制劑、或蛋白甲基轉移酶DOT1L的抑制劑的培養基處理，並且優選地在空氣-液體界面處培養約七天，來使第6階段細胞分化成第7階段細胞。在某些實施方案中，在空氣-液體界面處培養之前，可用細胞脫附溶液處理細胞，所述細胞脫附溶液為諸如包含蛋白水解酶和膠原蛋白酶的溶液。在本發明的特別優選的實施方案中，將極光激酶抑制劑優選極光激酶抑制劑II、RSK抑制劑優選RSK抑制劑II、以及蛋白質甲基轉移酶DOT1L的抑制劑優選EPZ 5676中的一種或多種添加到培養基中。所添加的量可為約100nM至5000nM，或者約1000nM至5000nM，或者約2000nM至5000nM，或者約3000nM至5000nM，並且優選地約1000nM至2000nM的極光激酶抑制劑，更優選地約2000nM的極光激酶或RSK抑制劑，或約100nM至500nM的DOT1L抑制劑，並且更優選地約1μM至約10nM的DOT1L抑制劑。
根據前述方法，本發明還提供了一種用於使表達胰腺內胚層/內分泌前體細胞的特徵性標誌物的細胞分化成表達成熟胰腺內分泌細胞的特徵性標誌物的細胞的細胞培養物，所述細胞培養物包括：(a)培養容器；(b)所述容器內一定體積的生長培養基，該體積足以填充所述容器的體積的僅一部分；(c)所述容器內的空氣，該空氣填充鄰接所述培養基的所述容器的一部分；(d)位於所述培養基和所述空氣之間的界面處的多孔基質；以及(d)表達衍生自設置在所述基質表面上以使得所述培養基接觸所述細胞表面的僅一部分的多能幹細胞的胰腺內胚層/內分泌前體細胞的特徵性標誌物的細胞。
在一個實施方案中，利用根據本發明的實施方案培養的第6階段細胞並且使所述細胞分化成第7階段細胞，而在其它實施方案中可利用根據其它方案培養的第6階段細胞。
在另一個實施方案中，本發明的方法導致第7階段細胞的形成，所述第7階段細胞是單激素陽性的。因此，在一個實施方案中，本發明的方法產生共表達NKX6.1、胰島素、PDX1和MAFA的第7階段細胞。在另一個實施方案中，本發明的方法產生共表達NKX6.1、PDX1、胰島素和MAFA的第7階段細胞。在另外的實施方案中，產生細胞群，其中至少約10％，或者至少約20％，或者至少約30％，或者至少約40％，或者至少約50％，或者至少約60％，或者至少約70％，或者至少約80％，或者至少約90％的細胞群的細胞中的每個表達胰島素、PDX1、NKX6.1和MAFA。
在本發明的某些優選實施方案和優選實施方案中，該方法在第4至第7階段或第4階段後期至第7階段，或第5、第6和第7階段採用BLAR定製培養基(表I)。培養基可優選地每天更換或另選地每隔一天更換。在另一個實施方案中，本發明涉及形成共表達NKX6.1、PDX1、MAFA和胰島素的第7階段細胞的方法，該方法包括在空氣-液體界面處培養第4階段細胞，優選地第4階段後期細胞至第7階段細胞。在又一個實施方案中，本發明涉及通過在空氣-液體界面處培養第4階段細胞，優選地第4階段後期細胞至第7階段細胞來形成表達NKX6.1、PDX1和MAFA的第7階段細胞的單激素胰島素陽性的細胞的方法。
根據本文所述的方法生成的第6階段細胞和第7階段細胞還適用於根據化合物對胰腺激素和內分泌標誌物的分泌的影響來篩選化合物。具體地講，在ALI處培養的第4階段細胞至第7階段細胞可以來自384至6孔形式的不同培養形式進行測試。這樣的形式允許在隨後表達的胰腺內胚層、胰腺內分泌前體、胰腺內分泌和胰腺β細胞標誌物上以各種劑量和時間間隔來評估各種小分子或生物製劑。此類評估可通過以下方式實現：用PCR測量基因表達，用FACS、或免疫染色測量蛋白質表達，或用ELISA來測量受到小分子/生物製劑的添加影響的細胞的細胞因子分泌。
可通過本發明的方法獲得的細胞
本發明提供可通過本發明的方法獲得的細胞或細胞群。本發明還提供優選地表達成熟表型的胰腺內分泌細胞的特徵性標誌物的細胞或細胞群。本發明還提供了胰島素陽性細胞或胰島素陽性細胞群，其優選地表達由NKX6.1表達(優選地大於約30％)、PDX1表達(優選地大於約30％)和MAFA表達(優選地大於約10％)表徵的成熟表型的胰腺內分泌細胞特徵性標誌物。
治療方法
本發明提供了治療方法，特別是用於治療患有糖尿病或具有發展糖尿病風險的患者。本發明還提供可通過本發明的方法獲得或已通過本發明的方法獲得以用於治療方法的細胞群。具體地講，本發明提供可通過本發明的方法獲得或已通過本發明的方法獲得以用於治療患有糖尿病，或具有發展糖尿病風險的人的方法的細胞或細胞群。糖尿病可為1型糖尿病或2型糖尿病。
在一個實施方案中，治療方法包括將已通過本發明的方法獲得或可通過本發明的方法獲得的細胞植入患者體內。在一個實施方案中，治療方法包括使多能細胞在體外分化成第1階段、第2階段、第3階段、第4階段、第5階段、第6階段或第7階段細胞，例如如本文所述，以及將分化的細胞植入患者體內。在另一個實施方案中，該方法還包括在使多能幹細胞分化的步驟之前，例如如本文所述的培養多能幹細胞的步驟。在又一個實施方案中，該方法還包括植入步驟之後的在體內分化細胞的步驟。在一個實施方案中，通過任意方法治療的患者是哺乳動物，並且優選地是人。
在一個實施方案中，可將這些細胞作為分散的細胞植入，或可使這些細胞形成簇，可將這些細胞簇輸注到血管系統，例如肝門靜脈內。另選地，可將細胞設置在生物相容性的可降解聚合物型支持物中、多孔的非可降解性裝置中或可進行封裝以保護其免受宿主的免疫系統的破壞。在一個實施方案中，治療方法還包括在移植前將所述細胞結合到三維支承體中。這些細胞在被移植到病患體內前，在體外時可一直維持在該支承體上。另選地，無需另外的體外培養，包含這些細胞的支承體能夠直接植入病患體內。可任選地將至少一種有利於移植細胞存活並發揮功能的藥劑摻入該支承體。細胞可植入到接收者的適當部位中，包括例如肝臟、天然的胰腺、腎包膜下空間、網膜、腹膜、漿膜下空間、腸、胃或皮下袋。
為了促進植入細胞在體內進一步分化，並保證其體內存活率或活性，可在施加細胞前、施加細胞的同時或在施加細胞後向受體施加另外的因子，諸如生長因子、抗氧化劑或抗炎劑。這些因子可由內源性細胞分泌，並原位暴露於施加的細胞。可通過本領域已知的內源施加生長因子和外源施加生長因子的任意組合誘導植入細胞分化。
用於植入的細胞量取決於多種因素(包括植入受檢者的狀況和對植入療法的響應度)，並可由本領域技術人員確定。
本發明將通過以下非限制性實施例進一步闡明。
實施例
實施例1
在空氣-液體界面處培養的胰腺內胚層細胞-從第5階段到第7階段MAFA的表達逐漸增加
該實施例示出在第5至第7階段期間在空氣-液體界面(「ALI」)處培養並且從第5階段至第7階段用T3和ALK5抑制劑II處理的胰腺內胚層細胞中MAFA表達的動力學。將第42代的人胚胎幹細胞系H1的細胞(WA01細胞，WiCell Research Institute,Madison,Wisconsin)在以下所述的培養基中作為單細胞以1×105個細胞/cm2接種在以1:30稀釋的MATRIGELTM(Corning Incorporated,Corning New York，目錄號354230)塗覆的培養皿上：杜爾貝科改良伊格爾培養基；營養混合物F-12(「DMEM-F12」)(Life Technologies Corporation,Carlsbad,California，目錄號11330-032)，以1:100稀釋的GlutaMAXTM(Life Technologies，目錄號35050-079)(「1X濃度」)，0.25mM抗壞血酸(Sigma Aldrich Co.LLC,St.Louis Missouri，目錄號A4544)，100ng/ml的成纖維細胞生長因子2(「FGF2」)(R&D Systems,Minneapolis,Minnesota，目錄號233-FB-025)，1ng/ml的轉化生長因子β(「TGF-β」)(R&D Systems Inc.，目錄號240-B-002)，以1:100稀釋的胰島素-轉鐵蛋白-硒-乙醇胺(「ITS-X」)(Life Technologies，目錄號51500056)，2％不含脂肪酸的牛血清白蛋白(「FAF-BSA」)(Proliant,Inc.,Boone,Idaho，目錄號68700)，以及20ng/ml的胰島素樣生長因子-1(「IGF-1」)(R&D Systems，目錄號291-G1-200)，該培養基補充有10μM的Rock抑制劑Y-27632(目錄號Y0503，Sigma-Aldrich)。接種後四十八小時，將培養物在不完全PBS(不含鎂或鈣的磷酸鹽緩衝鹽水)中洗滌，然後用1x的TrypLETMExpress Enzyme(Life Science，目錄號14190)在37℃下溫育3至5分鐘。釋放的細胞用DMEM-F12衝洗並以1000rpm旋轉5分鐘。將所得細胞沉澱物重懸於補充有以下物質的DMEM-F12中：10μM的Y-27632、以1:100稀釋的GlutaMAXTM(「1X濃度」)、0.25mM抗壞血酸、100ng/ml的FGF2、1ng/ml的TGF-β、以1:100稀釋的ITS-X、2％的FAF-BSA和20ng/ml的IGF-1，並且將單細胞懸浮液以大約1.3至1.5×105個細胞/cm2接種。每天用培養基向培養物進料，並且根據以下方案，分化在接種後48小時引發，從而導致約90％的起始匯合度。在所使用的分化方案的第1至第4階段期間，培養物在平面貼壁培養物上並且在空氣-液體界面處維持第5至第7階段。
第1階段(3天)：
將細胞鋪在MATRIGELTM(1:30稀釋)塗覆的培養皿上，首先用1X不完全DPBS衝洗所述細胞，然後在該階段和所使用以下階段中在以下第1階段培養基中培養一天：MCDB-131培養基(Life Technologies，目錄號10372-019)，其補充有0.5％的FAF-BSA、1.2g/1000ml的碳酸氫鈉(Sigma-Aldrich，目錄號S3187)、濃度為1X的GlutaMAXTM、4.5mM的D-葡萄糖(Sigma-Aldrich，目錄號G8769)，以獲得濃度為10mM的葡萄糖(Sigma-Aldrich，目錄號G8769)、100ng/ml生長/分化因子8(「GDF8」)(Peprotech,Rocky Hill,New Jersey，目錄號120-00)，以及1μM的14-丙-2-烯-1-基-3,5,7,14,17,23,27-七氮雜四環[19.3.1.1～2,6～.1～8,12～]二十七烷酸甲酯-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-壬烷-16-酮(「MCX化合物」)。細胞隨後在補充有以下物質的MCDB-131培養基中再培養一天：0.5％的FAF-BSA、0.0012g/ml的碳酸氫鈉、1X濃度的GlutaMAXTM、4.5mM的D--葡萄糖、100ng/ml的GDF8和0.1μM的MCX化合物。細胞隨後在補充有以下物質的MCDB-131培養基中再培養一天：0.5％的無脂肪酸BSA、1.2g/1000ml的碳酸氫鈉、1X的GlutaMAXTM、4.5mM的D--葡萄糖和100ng/ml的GDF8。
第2階段(2天)：
首先用1X的不完全DPBS衝洗細胞，然後用補充有以下物質的MCDB-131培養基處理兩天：0.5％的FAF-BSA、1.2g/1000ml的碳酸氫鈉、1X的GlutaMAXTM、4.5mM的D-葡萄糖、0.25mM的抗壞血酸和25ng/ml的FGF7(R&D Systems,Inc.，目錄號251-KG.)。
第3階段(2天)：
用補充有以下物質的BLAR定製培養基(由Life Technologies製造，表I上列出的組分)將細胞處理兩天：1:200稀釋的ITS-X，4.5mM的葡萄糖，1X的GlutaMAXTM，2.5g/1000ml的碳酸氫鈉，2％的FAF-BSA，0.25μM的SANT-1(N-[(3,5-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-基)亞甲基]-4-(苯基甲基)-1-哌嗪胺)(Sigma Aldrich，目錄號S4572)，1μM的視黃酸(「RA」)(Sigma Aldrich，目錄號R2625)，25ng/ml的FGF7，0.25mM的抗壞血酸，200nM的PKC活化劑((2S,5S-(E,E)-8-(5-(4-三氟甲基)苯基-2,4,-戊二烯基氨基)苯並內醯胺(「TPB」)(EMD Millipore Corporation,Gibbstown,New Jersey，目錄號565740)，以及100nM的骨形態發生蛋白質(「BMP」)受體抑制劑LDN-193189(Shanghai ChemPartners Co Ltd.,Shanghai,China)。
第4階段(3天)：
將細胞用補充有以下物質的BLAR培養基處理三天：1:200稀釋的ITS-X、4.5mM的葡萄糖、1X濃度的GlutaMAXTM、2.5g/1000ml的碳酸氫鈉、2％的FAF-BSA、0.25μM的SANT-1、100nM的RA、2ng/ml的FGF7、100nM的LDN-193189、0.25mM的抗壞血酸、以及200nM的TPB。在第4階段(3天)結束時，在平皿上培養的細胞用10μM的Y27632處理4小時，用PBS衝洗，然後在室溫下用1X濃度的酶TrypLETMExpress Enzyme(LifeTechnologies Corporation，目錄號12604-013)處理5分鐘，之後去除所述酶，用BLAR培養基衝洗，然後用細胞刮棒刮擦所述細胞。將所得的細胞懸浮液以0.5-0.75×106個細胞的密度(在5-10l的等分試樣中)接種到6孔板中的0.4微米多孔細胞培養物過濾器芯子(Corning，目錄號353493)上。將1.5ml的培養基添加至每一濾芯的底部，並且不另外添加培養基至過濾器的頂上側或頂側。在第5、第6和第7階段的持續時間每天更換培養基。
第5階段(3天)：
將在空氣-液體界面處培養的細胞用補充有以下物質的BLAR培養基處理三天：1:200稀釋的ITS-X、用以實現最終濃度為20mM的葡萄糖的葡萄糖，1X的GlutaMAXTM，1.5g/1000ml的碳酸氫鈉，2％的FAF-BSA，0.25mM的抗壞血酸，10μg/ml的肝素(Sigma Aldrich，目錄號H3149)，10μM的ZnSO4(Sigma Aldrich，目錄號Z0251)，0.25μM的SANT-1，50nM的RA，100nM的LDN-193189，1μM的呈3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸鈉鹽形式的T3(Sigma Aldrich，目錄號T6397)，10000nM的2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶(「ALK5抑制劑II」)(Enzo Life Sciences,Inc.,Farmingdale,New York，目錄號ALX-270-445)。
第6階段(7天)：
將第5階段細胞用補充有以下物質的BLAR培養基處理7天：1:200稀釋的ITS-X，用以實現最終濃度為20mM的葡萄糖的葡萄糖，1X濃度的GlutaMAXTM，1.5g/ml的碳酸氫鈉，2％的FAF-BSA，0.25mM的抗壞血酸，10μg/ml的肝素，10μM的ZnSO4，100nM的LDN-193189，1μM的T3，100nM的(S,S)-2-[2-(3,5-二氟苯基)乙醯基氨基]-N-(5-甲基-6-氧代-6,7-二氫-5H-二苯並[b,d]氮雜卓-7-基)丙醯胺(「γ分泌酶抑制劑XX」)(EMD Millipore，目錄號565789)，以及10000nM的ALK5抑制劑II。
第7階段(7天)：
將第6階段細胞用補充有以下物質的BLAR培養基處理7-15天：1:200稀釋的ITS-X，用以實現最終濃度為20mM的葡萄糖的葡萄糖，1X的GlutaMAXTM，1.5g/1000ml的碳酸氫鈉，2％的FAF-BSA，10μg/ml的肝素，10μM的ZnSO4，1μM的T3，10000nM的ALK5抑制劑II，10μM的維生素E類似物Trolox(EMD Millipore，目錄號648471)。
圖1A至圖1M示出了來自如實施例1中所概述分化的人胚胎幹細胞系H1的細胞中下列基因的實時PCR分析的數據：PDX1(圖1A)，NKX6.1(圖1B)，PAX4(圖1C)，PAX6(圖1D)，NGN3(圖1E)，MAFA(圖1F)，ABCC8(圖1G)，嗜鉻粒蛋白-A(圖1H)，G6PC2(圖1I)，IAPP(圖1J)，胰島素(圖1K)，胰高血糖素(圖1L)，以及PTF1a(圖1M)。如圖1F所示，將第4階段和第5階段與第6階段和第7階段比較，在MAFA中存在明顯增加或上調，這表明細胞朝向β細胞譜系提高的成熟。然而，在第6階段和第7階段處，對於MAFA的mRNA表達低於成人胰島。
對於各個階段的另外表徵，在第3、第4、第5、第6和第7階段處收穫細胞，並通過螢光激活流式細胞術(「FACS」)分析。如Diabetes,61,2016,2012中所述並且使用表III中列出的抗體進行FACS染色。簡言之，將細胞在37℃下在TrypLETMExpress(Life Technologies，目錄號12604)中溫育3-5分鐘，並釋放到單細胞懸浮液中，此後用含有0.2％的BSA的PBS的染色緩衝液(BD Sciences，目錄號554657)將所述細胞洗滌兩次。將細胞(1×105至1×106)重懸於用於表面標記的染色緩衝液中以1:4稀釋的0.5％人γ球蛋白的100μl封閉緩衝液中。以1:20的最終稀釋度向細胞中加入直接綴合的一抗，然後在4℃下溫育30分鐘。將染色的細胞在染色緩衝液中洗滌兩次，隨後在200μl染色緩衝液中再懸浮，然後在15μl的7AAD中溫育以進行活/死鑑別，之後在BD Canto II上進行FACS分析。通過首先在4℃下用綠色螢光LIVE/DEAD細胞染料(Life Technologies，目錄號L23101)溫育20分鐘，隨後在冷PBS中單次洗滌來完成細胞內抗體染色。細胞的固定在250μl的Cytofix/Cytoperm緩衝液(BD目錄號554723)中，隨後將細胞重懸於具有2％正常山羊血清的100μl的Perm洗滌緩衝液染色/封閉溶液中。細胞在4℃下與以憑經驗預先確定的稀釋度的一抗一起溫育30分鐘，隨後在Perm/洗滌緩衝液中洗滌兩次。然後將細胞與合適的抗體在4℃下一起溫育30分鐘，隨後洗滌兩次，之後在BD FACS Canto II上進行分析。所用的抗體的濃度示於表III。使用人胰島或未分化的H1細胞作為陽性對照測試胰腺標誌物的抗體的特異性。對於二抗，加入以下物質並在4℃下溫育30分鐘：1:500的抗小鼠647(Life Technologies)，1:200(體積)的山羊抗兔PE或1:800的驢抗山羊Alexa 647Alexa(Life Technologies)，隨後在Perm/洗滌緩衝液中最後洗滌，並且使用BD FACS Diva軟體在BD FACS Canto II上進行分析，獲得至少30,000個事件。
圖2至圖6分別描繪了在第3、第4、第5、第6和第7階段收集的細胞的FACS分布圖。如圖4所示，在第5階段，大約15％的細胞共表達胰島素和NKX6.1，並且大約21％的PDX1陽性細胞在活躍細胞周期中，如通過PDX1和KI-67的共表達所測量的(約23％；KI-67指示細胞處於活躍細胞周期中)。然而，到第6階段和第7階段(圖5和圖6)，存在顯著的PDX1+細胞增殖下降(1-2％)，同時存在共表達胰島素的NKX6.1+細胞的數目的顯著增長(在第6階段約39％，並且在第7階段約50％)。此外，存在表達內分泌前體標誌物ISL-1、NeuroD1和NKX2.2的細胞的顯著增多。這些結果表明第6階段和第7階段的培養物允許細胞從增殖祖細胞命運脫離而快速成熟為早熟內分泌細胞。此外，通過從第6階段延長到第7階段，觀察到共表達胰島素和NXK6.1的細胞的百分比的增長(33％)(圖5相比於圖6)。圖7總結了來自第3階段至第7階段的多個胰腺內胚層(FOXA2、PDX-1、NKX6.1)、未分化的ES細胞(Oct3/4)、內分泌物(Pax6、ISl-1、NKX2.2、嗜鉻粒蛋白)、和激素(胰島素、胰高血糖素)的百分比表達。
實施例2
用以識別可顯著上調MAFA和胰島素表達中的一者或兩者的小分子的篩選
該實施例涉及識別可以顯著增強細胞朝向胰腺β細胞的成熟的小分子。將第42代人胚胎幹細胞系H1的細胞(WA01)作為單細胞以1×105個細胞/cm2接種在MATRIGELTM(1:30稀釋)塗覆的培養皿上的培養基中，所述培養基包含DMEM-F12、GlutaMaxTM(1:100稀釋)、0.25mM的抗壞血酸、100ng/ml的FGF2(R&D systems,MN)、1ng/ml的TGF-β、ITS-X(1:100稀釋)、2％的FAF-BSA，以及20ng/ml的IGF-1，所述培養基補充有10μM的Y-27632。接種後四十八小時，將培養物在不完全PBS(不含Mg或Ca的磷酸鹽緩衝鹽水)中洗滌，然後用1x的TrypLETMExpress Enzyme(Life Science，目錄號14190)在37℃下溫育3至5分鐘。釋放的細胞用DMEM-F12衝洗並以1000rpm旋轉5分鐘。將所得細胞沉澱物重懸於補充有以下物質的DMEM-F12中：10μM的Y-27632、1X的GlutaMAXTM、0.25mM的抗壞血酸、100ng/ml的FGF2、1ng/ml的TGF-β、以1:100稀釋的ITS-X、2％的FAF-BSA和20ng/ml的IGF-1，並且將單細胞懸浮液以大約1.3至1.5×105個細胞/cm2接種。每天用培養基向培養物進料，並且根據以下方案，分化在接種後48小時引發，從而導致約90％的起始匯合度。除非另有說明，否則該實施例中使用的培養基、試劑、分子等的來源如實施例1中所述。
第1階段(3天)：
將細胞鋪在MATRIGELTM(1:30稀釋)塗覆的培養皿上，首先用1X不完全DPBS衝洗所述細胞，然後在第1階段培養基中培養一天：補充有0.5％的FAF-BSA、0.0012g/ml的碳酸氫鈉、1X濃度的GlutaMAXTM、4.5mM的D--葡萄糖、100ng/ml的GDF8和1μM的MCX化合物的MCDB-131培養基。細胞隨後在補充有以下物質的MCDB-131培養基中再培養一天：0.5％的FAF-BSA、0.0012g/ml的碳酸氫鈉、1X濃度的GlutaMAXTM、4.5mM的D--葡萄糖、100ng/ml的GDF8和0.1μM的MCX化合物。細胞隨後在補充有以下物質的MCDB-131培養基中再培養一天：0.5％的FAF-BSA、0.0012g/ml的碳酸氫鈉、1X濃度的GlutaMAXTM、4.5mM的D--葡萄糖、以及100ng/ml的GDF8。
第2階段(2天)：
首先用1X的不完全DPBS衝洗細胞，然後用補充有以下物質的MCDB-131培養基處理兩天：0.5％的FAF-BSA、0.0012g/ml的碳酸氫鈉、1X濃度的GlutaMAXTM、4.5mM的D-葡萄糖、0.25mM的抗壞血酸和25ng/ml的FGF7。
第3階段(2天)：
將細胞用補充有以下物質的BLAR定製培養基處理兩天：1:200稀釋的ITS-X、4.5mM的葡萄糖、1X濃度的GlutaMAXTM、0.0025g/ml的碳酸氫鈉、2％的FAF-BSA、0.25μM的SANT-1、1μM的RA、25ng/ml的FGF7、0.25mM的抗壞血酸、200nM的TPB，以及100nM的LDN-193189。
第4階段(3天)：
將細胞用補充有以下物質的BLAR培養基處理三天：1:200稀釋的ITS-X、4.5mM的葡萄糖、1X濃度的GlutaMAXTM、0.0025g/ml的碳酸氫鈉、2％的FAF-BSA、0.25μM的SANT-1、100nM的RA、2ng/ml的FGF7、100nM的LDN-193189、0.25mM的抗壞血酸、以及200nM的TPB，隨後在第4階段結束時，在平皿上培養的細胞用10μM的Y-27632處理4小時，用PBS衝洗，然後在室溫下用1X濃度的TrypLETM處理5分鐘，之後去除所述酶，用BLAR基礎培養基衝洗，然後用細胞刮棒刮擦所述細胞。將所得的細胞懸浮液以0.5-0.75×106個細胞的密度(在5-10l的等分試樣中)接種到6孔板中的0.4微米多孔細胞培養物過濾器芯子上。將1.5ml的培養基添加至每一濾芯的底部，並且不另外添加培養基至過濾器的頂上側。在第5、第6和第7階段的持續時間每天更換培養基。
第5階段(3天)：
將在空氣-液體界面處培養的細胞用補充有以下物質的BLAR培養基處理三天：1:200稀釋的ITS-X、20mM的葡萄糖、1X的GlutaMAXTM、0.0015g/ml的碳酸氫鈉、2％的FAF-BSA、0.25mM的抗壞血酸、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO4、0.25μM的SANT-1、50nM的RA、100nM的LDN-193189、1μM為3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸鈉鹽的T3，以及10000nM的ALK5抑制劑II。
第6階段(7天)：
將在空氣-液體界面處培養的第5階段細胞用補充有以下物質的BLAR培養基處理7天：1:200稀釋的ITS-X、20mM的葡萄糖、1X濃度的GlutaMAXTM、0.0015g/ml的碳酸氫鈉、2％的FAF-BSA、0.25mM的抗壞血酸、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO4、100nM的LDN-193189、1μM為3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸鈉鹽的T3、100nM的γ分泌酶抑制劑XX，以及10000nM的ALK5抑制劑II。
第7階段(7天)：
在空氣-液體界面處培養第6階段細胞並且用補充有以下物質的BLAR培養基處理7天：1:200稀釋的ITS-X、20mM的葡萄糖、1X濃度的GlutaMAXTM、0.0015g/ml的碳酸氫鈉、2％的FAF-BSA、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO4、1000nM為3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸鈉鹽的T3、10000nM的ALK5抑制劑II、10μM的Trolox。
在第6階段或第7階段，添加各種小分子，並通過實時PCR評估它們的效果。表III列出所評估的小分子及其添加時間。
如圖8A至圖8E所示，其為示出來自分別與在第6階段和第7階段的未處理培養物相比在用小分子處理，添加EPZ-5676(蛋白質甲基轉移酶DOT1L的抑制劑)和AXL抑制劑(R428)之後，顯著上調MAFA的表達的胰島素和MAFA表達的實時PCR分析的數據的圖表。
實施例3(假想例)
在懸浮培養物中共表達胰島素、PDX-1、NKX6.1和MAFA的內分泌細胞的生成
將人胚胎幹細胞系H1的細胞(WA01)作為單細胞以1×105個細胞/cm2接種在MATRIGELTM(1:30稀釋)塗覆的培養皿上的培養基中，所述培養基包含DMEM-F12、GlutaMaxTM(1:100稀釋)、0.25mM的抗壞血酸、100ng/ml的FGF2(R&D systems,MN)、1ng/ml的TGF-β、ITS-X(1:100稀釋)、2％的FAF-BSA，以及20ng/ml的IGF-1，所述培養基補充有10μM的Y-27632。接種後四十八小時，將培養物在不完全PBS(不含Mg或Ca的磷酸鹽緩衝鹽水)中洗滌，然後用1x的TrypLETMExpress Enzyme在37℃下溫育3至5分鐘。釋放的細胞用DMEM-F12衝洗並以1000rpm旋轉5分鐘。將所得細胞沉澱物重懸於補充有以下物質的DMEM-F12中：10μM的Y-27632、1X的GlutaMAXTM、0.25mM的抗壞血酸、100ng/ml的FGF2、1ng/ml的TGF-β、以:100稀釋的ITS-X、2％的FAF-BSA和20ng/ml的IGF-1，並且將單細胞懸浮液以大約1.3至1.5×105個細胞/cm2接種。每天用培養基向培養物進料，並且根據以下方案，分化在接種後48小時引發，從而導致約90％的起始匯合度。第1階段至第4階段維持在平面貼壁培養物上，而第5階段至第7階段維持在懸浮培養物中。
第1階段(3天)：
將細胞鋪在MATRIGELTM(1:30稀釋)塗覆的培養皿上，首先用1X不完全DPBS衝洗所述細胞，然後在第1階段培養基中培養一天：補充有0.5％的FAF-BSA、1.2g/1000ml的碳酸氫鈉、1X濃度的GlutaMAXTM、4.5mM的D--葡萄糖、100ng/ml的GDF8和1μM的MCX化合物的MCDB-131培養基。細胞隨後在補充有以下物質的MCDB-131培養基中再培養一天：0.5％的FAF-BSA、1.2g/1000ml的碳酸氫鈉、1X濃度的GlutaMAXTM、4.5mM的D--葡萄糖、100ng/ml的GDF8和0.1μM的MCX化合物。細胞隨後在補充有以下物質的MCDB-131培養基中再培養一天：0.5％的FAF-BSA、1.2g/1000ml的碳酸氫鈉、1X濃度的GlutaMAXTM、4.5mM的D--葡萄糖、以及100ng/ml的GDF8。
第2階段(2天)：
首先用1X的不完全DPBS衝洗細胞，然後用補充有以下物質的MCDB-131培養基處理兩天：0.5％的FAF-BSA、1.2g/1000ml的碳酸氫鈉、1X濃度的GlutaMAXTM、4.5mM的D-葡萄糖、0.25mM的抗壞血酸和25ng/ml的FGF7。
第3階段(2天)：
將細胞用補充有以下物質的BLAR定製培養基處理兩天：1:200稀釋的ITS-X、4.5mM的葡萄糖、1X濃度的GlutaMAXTM、2.5g/1000ml的碳酸氫鈉、2％的FAF-BSA、0.25μM的SANT-1、1μM的RA、25ng/ml的FGF7、0.25mM的抗壞血酸、200nM的TPB，以及100nM的LDN-193189。
第4階段(3天)：
將細胞用補充有以下物質的BLAR培養基處理三天：1:200稀釋的ITS-X、4.5mM的葡萄糖、1X濃度的GlutaMAXTM、2.5g/1000ml的碳酸氫鈉、2％的FAF-BSA、0.25μM的SANT-1、100nM的RA、2ng/ml的FGF7、100nM的LDN-193189、0.25mM的抗壞血酸、以及200nM的TPB，隨後在第4階段結束時，在平皿上培養的細胞用10μM的Y-27632處理4小時，用PBS衝洗，然後在室溫下用1X濃度的酶(Life Technologies，#A11105-01)處理5分鐘，之後去除所述酶，並且用BLAR基礎培養基衝洗，然後使用細胞刮棒刮擦所述細胞並且使其破碎成細胞簇(<100微米)。將細胞簇轉移到125ml的一次性聚苯乙烯轉瓶(Corning)中，並且在具有下文指定的第5階段培養基的懸浮液中以80至100rpm旋轉。
第5階段(3天)：
將製備為簇的第4階段細胞在補充有以下物質的BLAR培養基中的懸浮液中培養三天：1:200稀釋的ITS-X、20mM的葡萄糖(最終)、1X的GlutaMAXTM、1.5g/1000ml的碳酸氫鈉、2％的FAF-BSA、0.25mM的抗壞血酸、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO4、0.25μM的SANT-1、50nM的RA、100nM的LDN-193189、1μM為3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸鈉鹽的T3，以及10000nM的ALK5抑制劑II。
第6階段(7天)：
第5階段細胞在懸浮液中培養並且用補充有以下物質的BLAR培養基處理7天：1:200稀釋的ITS-X、20mM的葡萄糖(最終)、1X濃度的GlutaMAXTM、1.5g/1000ml的碳酸氫鈉、2％的FAF-BSA、0.25mM的抗壞血酸、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO4、100nM的LDN-193189、1μM為3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸鈉鹽的T3、100nM的γ分泌酶抑制劑XX，以及10000nM的ALK5抑制劑II。
第7階段(15天)：
第6階段細胞在懸浮液中培養並且用補充有以下物質的BLAR培養基處理至多15天：1:200稀釋的ITS-X、20mM的葡萄糖(最終)、1X濃度的GlutaMAXTM、0.0015g/ml的碳酸氫鈉、2％的FAF-BSA、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO4、1μM為3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸鈉鹽的T3、10000nM的ALK5抑制劑II、10μM的Trolox、1mM的N-乙醯基半胱氨酸，以及2μM的AXL抑制劑(R428)。
在第5-第7階段，去除細胞簇的等分試樣，並通過PCR、FACS和免疫組織化學表徵胰島素、NKX6.1、PDX-1和MAFA的共表達。預期這樣的測試的結果將顯示在相同細胞和細胞群中的胰島素、PDX1、NKX6.1和MAFA的共表達，其中至少約10％的細胞群顯示這樣的表達。
實施例4
AXL和共配體GAS6的mRNA表達對於第7階段或人胰島細胞非常低。
將人胚胎幹細胞系H1的細胞(WA01)作為單細胞以1×105個細胞/cm2接種在MATRIGELTM(1:30稀釋)塗覆的培養皿上的培養基中，所述培養基包含Essential 8TM(「E8」)(BD Biosciences，目錄號356231)。接種後48小時，將培養物在1x的不完全PBS中洗滌，然後用1x TrypLETMExpress Enzyme(Life Science，目錄號14190)在37℃下溫育3至5分鐘。釋放的細胞用E8衝洗並以1000rpm旋轉5分鐘。將所得細胞沉澱物重懸於補充有10μM的Y-27632的E8中，並且將單細胞懸浮液以大約1.3至1.5×105個細胞/cm2接種。每天用E8培養基向培養物進料，並且根據以下方案，分化在接種後48小時引發，從而導致約90％的起始匯合度。
第1階段(3天)：
將細胞鋪在MATRIGELTM(1:30稀釋)塗覆的培養皿上，首先用1X不完全DPBS衝洗所述細胞，然後在第1階段培養基中培養一天：補充有0.5％的FAF-BSA、1.5g/1000ml的碳酸氫鈉、1X濃度的GlutamaxTM、4.5mM的D--葡萄糖、100ng/ml的GDF8和1.5μM的MCX化合物的MCDB-131培養基。細胞隨後在補充有以下物質的MCDB-131培養基中再培養一天：0.5％的FAF-BSA、1.5g/1000ml的碳酸氫鈉、1X濃度的GlutamaxTM、4.5mM的D--葡萄糖、100ng/ml的GDF8和0.1μM的MCX化合物。細胞隨後在補充有以下物質的MCDB-131培養基中再培養一天：0.5％的FAF-BSA、1.5g/1000ml的碳酸氫鈉、1X濃度的GlutamaxTM、4.5mM的D--葡萄糖、以及100ng/ml的GDF8。
第2階段(2天)：
首先用1X的不完全DPBS衝洗細胞，然後用補充有以下物質的MCDB-131培養基培養兩天：0.5％的FAF-BSA、1.5g/1000ml的碳酸氫鈉、1X濃度的GlutamaxTM、4.5mM的D-葡萄糖、0.25mM的抗壞血酸和50ng/ml的FGF7。
第3階段(2天)：
將細胞在補充有以下物質的BLAR定製培養基中培養兩天：1:100稀釋的ITS-X、1X濃度的GlutamaxTM、4.5mM的D-葡萄糖、2.5g/1000ml的碳酸氫鈉、2％的FAF-BSA、0.25μM的SANT-1、1μM的RA、25ng/ml的FGF7、0.25mM的抗壞血酸、300nM的TPB，以及100nM的LDN-193189。
第4階段(3天)：
將細胞在補充有以下物質的BLAR培養基中培養三天：1:100稀釋的ITS-X、1X濃度的GlutamaxTM、4.5mM的D-葡萄糖、2.5g/1000ml的碳酸氫鈉、2％的FAF-BSA、0.25μM的SANT-1、0.1μM的RA、2ng/ml的FGF7、100nM的LDN-193189、0.25mM的抗壞血酸、以及200nM的TPB，隨後在第4階段結束時，在平皿上培養的細胞用10μM的Y-27632處理4小時，用1X的不完全PBS衝洗，然後在室溫下用1X的TrypLETM處理3至5分鐘。將酶去除，釋放細胞並用BLAR培養基衝洗，並且將所述細胞轉移到125ml的一次性聚苯乙烯轉瓶中，並以1000rpm旋轉3分鐘。將所得細胞沉澱物作為單細胞以大約0.5×105個細胞/cm2的密度重懸在過濾器芯子(BD Biosciences，目錄號3420)上，(每個斑點5至10μL，總計0.25至0.5百萬個細胞/斑點)。每個斑點區域的直徑被測量為大約1mm至2mm，這取決於添加的細胞的體積。對於6孔芯子，將1.5mL/孔添加到每一濾芯的底部，而對於10cm過濾器芯子添加8mL。通常，6孔芯子的每個孔使用20至15個斑點，而對於10cm芯子使用80至90個斑點。
第5階段(3天)：
將第4階段細胞在補充有以下物質的BLAR培養基中培養三天：1:100稀釋的ITS-X、20mM的葡萄糖(最終)、1.5g/1000ml的碳酸氫鈉、2％的FAF-BSA、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO4、0.25μM的SANT-1、0.05μM的RA、100nM的LDN-193189、1μM為3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸鈉鹽的T3，以及10μM的ALK5抑制劑II。
第6階段(7天)：
將第5階段細胞在補充有以下物質的BLAR培養基中培養7天：1:100稀釋的ITS-X、20mM的葡萄糖(最終)、1.5g/1000ml的碳酸氫鈉、2％的FAF-BSA、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO4、100nM的LDN-193189、1μM為3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸鈉鹽的T3、100nM的γ分泌酶抑制劑XX，以及10μM的ALK5抑制劑II。
第7階段(7天)：
將第6階段細胞在補充有以下物質的BLAR培養基中培養7天：1:100稀釋的ITS-X、20mM的葡萄糖(最終)、1.5g/L的碳酸氫鈉、2％的FAF-BSA、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO4、1μM為3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸鈉鹽的T3、10μM的ALK5抑制劑II、1mM的N-乙醯基半胱氨酸、以及2μM的AXL抑制劑(R428)。
在第4階段第3天、第5階段第3天、第6階段第3天和第7階段第7天，收集mRNA，並且與未分化的人幹細胞和人屍體胰島相比，評估AXL和GAS 6的表達(Prodo Labs,California)。如圖9所示，AXL的表達在未分化幹細胞中以高水平存在。然而，幹細胞向胰腺內胚層、胰腺內分泌和未成熟β細胞的分化導致AXL表達急劇下降。此外，在第4至第7階段維持了低水平的GAS6表達。與未分化的幹細胞相比，AXL的表達在人胰島中也顯著降低。結果顯示，第6階段和第7階段的細胞具有非常低的AXL表達。
實施例5
R428抑制AXL和許多另外的激酶
通過激酶簡檔服務(Kinase Profiling Services)使用100μM ATP濃度(EMD Millipore)評估AXL抑制劑R428靶向不同激酶的效率。在1μM和10μM下測試R428。表IV列出了激酶，所述激酶連同靶向具有較低數量的激酶的效率一起簡檔化，表明對特定激酶的更強抑制。
表IV-R428的激酶簡檔
激酶簡檔結果指示R428如預期地抑制AXL。然而，R428另外以1μM和10μM高效地抑制RSK3、Ret、Flt、FGFr1、AuroraA和AuroraB激酶。這表示R428在MAFA誘導中的作用機制可能不是通過AXL受體抑制。事實上，本文的實施例顯示，在第7階段AXL的mRNA表達非常低，從而突出顯示R428在誘導MAFA表達中的作用機制不是通過抑制AXL，而是通過抑制其它激酶，諸如RSK3和極光激酶。
實施例6
在不存在R428的情況下在第7階段抑制極光激酶表達增強的MAFA表達
將人胚胎幹細胞系H1的細胞(WA01)作為單細胞以1×105個細胞/cm2接種在MATRIGELTM(1:30稀釋)塗覆的培養皿上的E8培養基中。在約70％至80％的匯合度下，將培養物在1x的不完全DPBS中洗滌，然後用1x的TrypLETMExpress Enzyme在37℃下溫育3至5分鐘。釋放的細胞用E8衝洗並以1000rpm旋轉5分鐘。將所得細胞沉澱物重懸於補充有10μM的Y-27632的E8中，並且將單細胞懸浮液以大約1.3至1.5×105個細胞/cm2接種。每天用E8培養基向培養物進料，並且根據以下方案，分化在接種後48小時引發，從而導致約90％的起始匯合度。
第1階段(3天)：
將細胞鋪在MATRIGELTM(1:30稀釋)塗覆的培養皿上，首先用1X不完全DPBS衝洗所述細胞，然後在第1階段培養基中培養一天：補充有0.5％的FAF-BSA、1.5g/1000ml的碳酸氫鈉、10mM最終濃度的葡萄糖、100ng/ml的GDF8、以及1.5μM的MCX化合物的MCDB-131培養基。細胞隨後在補充有以下物質的MCDB-131培養基中再培養一天：0.5％的FAF-BSA、1.5g/1000ml的碳酸氫鈉、10mM最終濃度的葡萄糖、100ng/ml的GDF8和0.1μM的MCX化合物。細胞隨後在補充有以下物質的MCDB-131培養基中再培養一天：0.5％的FAF-BSA、1.5g/1000ml的碳酸氫鈉、10mM最終濃度的葡萄糖和100ng/ml的GDF8。
第2階段(2天)：
用1X的不完全DPBS衝洗細胞，然後用補充有以下物質的MCDB-131培養基培養兩天：0.5％的FAF-BSA、1.5g/1000ml的碳酸氫鈉、10mM最終濃度的葡萄糖、0.25mM的抗壞血酸和50ng/ml的FGF7。
第3階段(2天)：
將細胞在補充有以下物質的BLAR定製培養基中培養兩天：1:100稀釋的ITS-X、10mM最終濃度的葡萄糖、2.5g/1000ml的碳酸氫鈉、2％的FAF-BSA、0.25μM的SANT-1、1μM的RA、25ng/ml的FGF7、0.25mM的抗壞血酸、300nM的TPB，以及100nM的LDN-193189。
第4階段(3天)：
將細胞在補充有以下物質的BLAR培養基中培養三天：1:100稀釋的ITS-X、10mM最終濃度的葡萄糖、2.5g/1000ml的碳酸氫鈉、2％的FAF-BSA、0.25μM的SANT-1、0.1μM的RA、2ng/ml的FGF7、100nM的LDN-193189、0.25mM的抗壞血酸、以及200nM的TPB，隨後在第4階段結束時，在平皿上培養的細胞用10μM的Y-27632處理4小時，用1X的不完全PBS衝洗，然後在室溫下用1X的TrypLETM處理3至5分鐘。將酶去除，釋放細胞並用BLAR培養基衝洗，並且將所述細胞轉移到125ml的一次性聚苯乙烯轉瓶中，並以1000rpm旋轉3分鐘。將所得細胞沉澱物作為單細胞以大約0.5×105個細胞/cm2的密度重懸在過濾器芯子上，(每個斑點5至10μl，總計0.25至0.5百萬個細胞/斑點)。每個斑點區域的直徑被測量為大約1mm至2mm，這取決於添加的細胞的體積。對於6孔芯子，將1.5mL/孔添加到每一濾芯的底部，而對於10cm過濾器芯子添加8mL。通常，6孔芯子的每個孔使用20至15個斑點，而對於10cm芯子使用80至90個斑點。
第5階段(3天)：
將第4階段細胞在補充有以下物質的BLAR培養基中培養三天：1:100稀釋的ITS-X、20mM的葡萄糖(最終)、1.5g/1000ml的碳酸氫鈉、2％的FAF-BSA、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO4、0.25μM的SANT-1、0.05μM的RA、100nM的LDN-193189、1μM為3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸鈉鹽的T3，以及10μM的ALK5抑制劑II。
第6階段(7天)：
將第5階段細胞在補充有以下物質的BLAR培養基中培養7天：1:100稀釋的ITS-X、20mM的葡萄糖(最終)、1.5g/1000ml的碳酸氫鈉、2％的FAF-BSA、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO4、100nM的LDN-193189、1μM為3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸鈉鹽的T3、100nM的γ分泌酶抑制劑XX，以及10μM的ALK5抑制劑II。
第7階段(7天)：
將第6階段細胞在補充有以下物質的BLAR培養基中培養七天：1:100稀釋的ITS-X、20mM的葡萄糖(最終)、1.5g/L的碳酸氫鈉、2％的FAF-BSA、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO4、1μM為3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸鈉鹽的T3、10μM的ALK5抑制劑II、1mM的N-乙醯基半胱氨酸。一些培養物還包含以下物質中的一者：2μM的R428、2μM的極光激酶抑制劑VI(4-(4-(N-苯甲醯基氨基)苯胺基)-6-甲氧基-7-(3-(1-嗎啉基)丙氧基)喹唑啉)(EMD Millipore，目錄號18941)、或2μM的極光激酶抑制劑II(4-(4'-苯甲醯氨基苯胺基)-6,7-二甲氧基喹唑啉)(EMD Millipore，目錄號189404)。
在第7階段第7天，收集mRNA，並且與未分化的人幹細胞相比，評估MAFA、UCN3、PDX1、NKX6.1、胰島素和G6PC2的表達。如圖10所示，去除R428導致MAFA表達的顯著降低。注意到未用R428處理的培養物的UCN3和G6PC2(這兩種標誌物是成熟β細胞)表達顯著升高，這表明雖然R428增加MAFA表達，但是該化合物降低了其它β細胞成熟標誌物。極光激酶抑制劑對R428的取代恢復MAFA表達而不降低G6PC2水平。因此，在第7階段通過R428誘導MAFA表達可能不是通過AXL抑制，而是通過極光激酶的抑制。極光激酶抑制劑II的使用導致MAFA表達的增加以及UCN3和G6PC2表達的維持。
實施例7
在不存在R428的情況下在第7階段抑制極光激酶或RSK增強MAFA表達
將人胚胎幹細胞系H1(WA01)的細胞作為單細胞以1×105個細胞/cm2接種在MATRIGELTM(1:30稀釋)塗覆的培養皿上的E8培養基中。在約70％至80％的匯合度下，將培養物在1x的不完全DPBS中洗滌，然後用1x的TrypLETMExpress Enzyme在37℃下溫育3至5分鐘。釋放的細胞用E8衝洗並以1000rpm旋轉5分鐘。將所得細胞沉澱物重懸於補充有10μM的Y-27632的E8中，並且將單細胞懸浮液以大約1.3至1.5×105個細胞/cm2接種。每天用E8培養基向培養物進料，並且根據以下方案，分化在接種後48小時引發，從而導致約90％的起始匯合度。
第1階段(3天)：
將細胞鋪在MATRIGELTM(1:30稀釋)塗覆的培養皿上，首先用1X不完全DPBS衝洗所述細胞，然後在第1階段培養基中培養一天：補充有0.5％的FAF-BSA、1.5g/1000ml的碳酸氫鈉、10mM最終濃度的葡萄糖、100ng/ml的GDF8、以及1.5μM的MCX化合物的MCDB-131培養基。細胞隨後在補充有以下物質的MCDB-131培養基中再培養一天：0.5％的FAF-BSA、1.5g/1000ml的碳酸氫鈉、10mM最終濃度的葡萄糖、100ng/ml的GDF8和0.1μM的MCX化合物。細胞隨後在補充有以下物質的MCDB-131培養基中再培養一天：0.5％的FAF-BSA、1.5g/1000ml的碳酸氫鈉、10mM最終濃度的葡萄糖和100ng/ml的GDF8。
第2階段(2天)：
用1X的不完全DPBS衝洗細胞，然後用補充有以下物質的MCDB-131培養基培養兩天：0.5％的FAF-BSA、1.5g/1000ml的碳酸氫鈉、10mM最終濃度的葡萄糖、0.25mM的抗壞血酸和50ng/ml的FGF7。
第3階段(2天)：
將細胞在補充有以下物質的BLAR定製培養基中培養兩天：1:100稀釋的ITS-X、10mM最終濃度的葡萄糖、2.5g/1000ml的碳酸氫鈉、2％的FAF-BSA、0.25μM的SANT-1、1μM的RA、25ng/ml的FGF7、0.25mM的抗壞血酸、300nM的TPB，以及100nM的LDN-193189。
第4階段(3天)：
將細胞在補充有以下物質的BLAR培養基中培養三天：1:100稀釋的ITS-X、10mM最終濃度的葡萄糖、2.5g/1000ml的碳酸氫鈉、2％的FAF-BSA、0.25μM的SANT-1、0.1μM的RA、2ng/ml的FGF7、100nM的LDN-193189、0.25mM的抗壞血酸、以及200nM的TPB，隨後在第4階段結束時，在平皿上培養的細胞用10μM的Y-27632處理4小時，用1X的不完全PBS衝洗，然後在室溫下用1X的TrypLETM處理3至5分鐘。將酶去除，釋放細胞並用BLAR培養基衝洗，並且將所述細胞轉移到125ml的一次性聚苯乙烯轉瓶中，並以1000rpm旋轉3分鐘。將所得細胞沉澱物作為單細胞以大約0.5×105個細胞/cm2的密度重懸在過濾器芯子上，(每個斑點5至10μl，總計0.25至0.5百萬個細胞/斑點)。每個斑點區域的直徑被測量為大約1mm至2mm，這取決於添加的細胞的體積。對於6孔芯子，將1.5mL/孔添加到每一濾芯的底部，而對於10cm過濾器芯子添加8mL。通常，6孔芯子的每個孔使用20至15個斑點，而對於10cm芯子使用80至90個斑點。
第5階段(3天)：
將第4階段細胞在補充有以下物質的BLAR培養基中培養三天：1:100稀釋的ITS-X、20mM的葡萄糖(最終)、1.5g/1000ml的碳酸氫鈉、2％的FAF-BSA、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO4、0.25μM的SANT-1、0.05μM的RA、100nM的LDN-193189、1μM為3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸鈉鹽的T3，以及10μM的ALK5抑制劑II。
第6階段(7天)：
將第5階段細胞在補充有以下物質的BLAR培養基中培養7天：1:100稀釋的ITS-X、20mM的葡萄糖(最終)、1.5g/1000ml的碳酸氫鈉、2％的FAF-BSA、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO4、100nM的LDN-193189、1μM為3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸鈉鹽的T3、100nM的γ分泌酶抑制劑XX，以及10μM的ALK5抑制劑II。
第7階段(7天)：
將第6階段細胞在補充有以下物質的BLAR培養基中培養十四天：1:100稀釋的ITS-X、20mM的葡萄糖(最終)、1.5g/L的碳酸氫鈉、2％的FAF-BSA、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO4、1μM為3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸鈉鹽的T3、10μM的ALK5抑制劑II、1mM的N-乙醯基半胱氨酸。一些培養物還包含以下物質中的一者：2μM的R428、2-5μM的RSK抑制劑II(2-(3,5-二氟-4-羥基-苯胺基)-8-異戊基-5,7-二甲基-7H-蝶啶-6-酮)(EMD Millipore，目錄號559286-5MG)，2-5μM的極光激酶抑制劑II(EMD Millipore)，或2-5μM的RSK抑制劑II和2-5μM的極光激酶II抑制劑的組合。
在第7階段，第14天，收集mRNA並且與未分化的人幹細胞相比。如圖11所示，去除R428導致MAFA表達的顯著降低。用極光激酶抑制劑II取代R428恢復MAFA表達。類似地，用RSK抑制劑取代R428恢復MAFA表達。用極光激酶抑制劑II和RSK抑制劑取代R428進一步增強MAFA表達。該數據表明，R428對MAFA表達的誘導可能不是通過AXL抑制，而是通過極光激酶、RSK或其組合的抑制。