利用縮微光圖案對細胞進行流式計數分選的方法

2023-05-26 19:01:56 2

專利名稱：利用縮微光圖案對細胞進行流式計數分選的方法
技術領域：
本發明是一種運用光電微流控器件實現對生物細胞進行流式計數分選的方法，涉
及微流控領域，特別是微流控生物醫學分析晶片領域。 傳統的流式細胞分析儀已經廣泛應用於醫療行業和生物醫學研究機構，它主要是
將細胞會聚成單細胞隊列，並使細胞按順序逐個通過一個流通檢測器，此時，細胞處於一束
狹窄的聚焦光路中，每個細胞穿過時就會阻斷一次光束，一定數量的細胞不斷地打斷光束，
使檢測器檢出單位時間內光線阻斷的次數，從而計算出細胞的數量。檢測中常用的光散射
法還可依據每個細胞通過時所產生的散射角度來判斷每個細胞的體積和形態等特徵。從而
進行細胞分類。但這種儀器體積較大，需要熟練的專業操作人員，難以實現家庭化的即時檢
測的需求。此種儀器所需的被測樣品量比較大，而且此類儀器成本高，價格貴。 近年來，儘管出現了一些微型化的流式細胞計數器(或分析器)，例如通過鞘流法
將細胞會聚到採樣通道以形成單細胞隊列，或者通過動電學方法將細胞會聚到採樣通道，
但鞘流法需要額外的泵和閥，動電學方法需要高電場強度且需要製作複雜的電極結構。上
述方法中所有的微結構都是剛性的，難以根據具體的應用需求發生改變，而且由於需要外
部的泵和閥或者需要製作複雜的微電極結構，成本依然很高。 因此，提出一種無需外部流體驅動裝置，在晶片上實現柔性的低成本流式細胞計數分選方法是解決上述問題的關鍵。 技術問題本發明的目的是提供一種利用縮微光圖案對細胞進行流式計數分選的方法，以解決常規流式分析儀成本高，以及常規的生物細胞流式連續型微分析晶片微電極結構複雜或晶片構造複雜、製作成本高的缺陷。 技術方案本發明提供的利用縮微光圖案對細胞進行流式計數分選的方法，根據細胞受到光誘導介電泳力驅動的特性，分別依次構造由縮微光圖案形成的細胞會聚通道、單細胞採樣識別通道、細胞分離通道，進而實現連續的細胞會聚、識別、分選，在對細胞的識別過程中，同時完成各種細胞的分類計數，由以上三個通道順序構成的微系統最終實現微量生物樣品中多種細胞的連續計數分選。
生物細胞樣本中多種細胞的計數分選的具體步驟為 步驟1 :將微量生物細胞樣品溶液通過進樣口注射到分離晶片的微流體腔中，並記錄注射溶液的體積； 步驟2 :將正弦激勵電壓信號加於上層銦錫氧化物薄膜透明導電層，並設定頻率；
步驟3 :在微流體腔中投射光圖案構成由靜態的斜線陣列虛擬電極、動態柵欄型虛擬電極組成的細胞會聚通道，在細胞會聚通道右側投射光圖案構成由矩形虛擬電極擋板、動態柵欄型虛擬電極、生物細胞識別模塊、圓形虛擬電極組成的單細胞採樣識別通道，
背景技術：
發明內容在單細胞採樣識別通道右側投射光圖案構成由折線虛擬電極擋板、動態柵欄型虛擬電極組 成的細胞分離通道； 步驟4 :細胞會聚通道中的動態柵欄型虛擬電極運動方向水平，速度恆定，循環運 動，將待分選生物細胞順序會聚在一條直線上； 步驟5 :單細胞採樣識別通道中的動態柵欄型虛擬電極速度恆定，將已經會聚在 直線上的生物細胞逐個輸送至生物細胞識別模塊，該模塊採用圖像處理技術實時獲取圖像 數據，並分析出細胞大小、位置，根據識別結果以該細胞為中心生成相應的圓形虛擬電極， 由圓形虛擬電極將不同大小的細胞輸送至相應的分離通道入口，同時該類細胞計數器加 1 ; 步驟6 :在圓形虛擬電極將已識別細胞輸送到相應細胞分離通道入口時，細胞分 離通道中的動態柵欄型虛擬電極將已識別的生物細胞輸送至相應分離通道出口，隔離虛擬 電極用以隔離已分選的不同細胞，防止交叉； 步驟7 :重複步驟4到步驟6的流程，直至樣品中的細胞全部被分離後，各通道停 止運行，輸出各類細胞分類數目，完成細胞的計數分選。 本發明提供的細胞流式計數分選方法中，隨著細胞會聚通道中的柵欄型虛擬電極 的往復運動，雜亂無序的細胞將被順序會聚在一條直線上，在此基礎上，由單細胞採樣識別 通道實現單細胞的識別和計數，即動態柵欄型虛擬電極將會聚的細胞逐個輸運至圖像識別 模塊區域，實時獲取該區域圖像數據，再運用圖像處理技術分析出細胞大小、位置後，對該 類細胞進行計數，同時在該細胞位置處生成相應的圓形虛擬電極並將該細胞捕獲，然後由 圓形虛擬電極將細胞進一步輸送至細胞分離通道，進而完成細胞的分離。上述三個通道按 順序依次放置，並行運行，構成虛擬流式細胞計數分選微系統。 有益效果本發明利用可實時重構的縮微光圖案形成各個虛擬操作模塊，通過機 器視覺技術自動識別細胞種類，並由此對細胞進行分選，實現不同樣本細胞的快速分離，避 免了在連續型細胞計數分選晶片上製作複雜的物理實體電極陣列，而且此方法僅需要微量 的待測樣品，故此方法大大降低了生物細胞計數分選的成本，同時也大大提高了進行細胞 分析處理的效率。本發明針對待分類樣本中生物細胞大小的不同，動態地增加相應的細胞 分離通道，可以靈活高效實現微納米生物細胞的分離。因此，本發明在成本、功能、性能方面 均優於當前的生物細胞的計數分選方法，為生物醫學檢測領域的跨越式發展提供了十分必 要的手段，在疾病診斷和治療、公共衛生檢疫、司法鑑定、食品衛生監督等領域有廣泛應用 前景。


圖1為本發明實施例所使用的細胞計數分選晶片的材料結構示意圖； 圖2為本發明實施例中利用縮微光圖案對生物細胞進行計數分選光圖案示意圖
(晶片被揭去上基板後的俯視圖)。 以上的圖中有 上基板1、進樣口 11、透明絕緣蓋片12、上層透明的銦錫氧化物薄膜13 ;間隔層2 ; 微流體腔21 ;下基板3、絕緣層31、光電導層32、透明導電薄膜33、下部透明基底34;由靜態 的呈45度傾斜的斜線陣列虛擬電極41、動態柵欄型虛擬電極42構成的細胞會聚通道；由
4矩形虛擬電極擋板51、動態柵欄型虛擬電極52、生物細胞識別模塊53、圓形虛擬電極54構成單細胞採樣識別通道；由折線虛擬電極擋板61、動態柵欄型虛擬電極62構成的細胞分離通道；隔離虛擬電極63。
具體實施例方式
本發明提供的利用縮微光圖案對細胞進行流式計數分選的方法的實施例參見圖1和圖2。本方法所能夠使用的晶片結構、材料以及光圖案的樣式並不局限於本實施例。本實施例中所使用的細胞計數分選晶片包括進樣口 ll，透明絕緣蓋片12，上層透明的銦錫氧化物薄膜13，中間間隔層2，微流體腔21，透明絕緣基片34，由氮化矽層31、光電導層32和透明導電層33組成的光圖案虛擬電極形成層。氮化矽層31可以防止水解，光電導層32具有光電導的特性，即當被光照亮時其內部載流子數量劇增，而沒有被光照亮時其內部載流子數很少，其明電導與暗電導之比可達1000以上；光電導層32的材料可以選擇氫化非晶矽或者摻雜的硫化鎘(CdS)或者參雜的硒化鎘(CdSe)或者是硫化鎘和硒化鎘的組合。
本實施例中，利用縮微光圖案對生物細胞進行計數分選的方法的具體步驟如下
步驟1 :將含有兩種大小的微量生物細胞樣品溶液(比如幾微升)通過進樣口 11注射到分選晶片的微流體腔21中，並記錄注射溶液的體積； 步驟2 :將正弦激勵信號的電壓加於上層銦錫氧化物薄膜13透明導電層33，並設定頻率； 步驟3 :如圖2所示，在微流體腔21中投射光圖案構成細胞會聚通道，細胞會聚通道由靜態的呈45度傾斜的斜線陣列虛擬電極41、動態柵欄型虛擬電極42組成；在細胞會聚通道右側投射光圖案構成單細胞採樣識別通道，單細胞採樣識別通道由矩形虛擬電極擋板51、動態柵欄型虛擬電極52、生物細胞識別模塊53、圓形虛擬電極54組成；在單細胞採樣識別通道右側投射光圖案構成細胞分離通道，細胞分離通道由折線虛擬電極擋板61、動態柵欄型虛擬電極62組成； 步驟4 :動態柵欄型虛擬電極42按圖示箭頭方向運動，速度恆定，循環往復，與斜線陣列虛擬電極41共同作用，將待分選的生物細胞順序會聚在一條直線上；
步驟5 :動態柵欄型虛擬電極52運動方向如箭頭所示，運動速度恆定，將已經會聚在直線上的生物細胞逐個輸送至生物細胞識別模塊53，該模塊採用圖像處理技術實時獲取
圖像數據，分析出細胞大小、位置，根據識別結果以該細胞為中心生成相應的圓形虛擬電極54，由圓形虛擬電極54將不同大小細胞輸送至相應的分離通道入口，同時該類細胞計數器
加1 ; 步驟6 :在圓形虛擬電極54將細胞輸送到細胞分離通道入口時，動態柵欄型虛擬電極62按圖示箭頭方向運動，將已識別的生物細胞輸送至分離通道出口 ，隔離虛擬電極63用以隔離已分選的不同細胞，防止交叉； 步驟7 :重複步驟4到步驟6的流程，直至樣品中的細胞全部被分離後，各通道停止運行，輸出各類細胞分類數目，完成細胞的計數分選。
權利要求
一種利用縮微光圖案對細胞進行流式計數分選的方法，其特徵在於通過順序構造由縮微光圖案形成的細胞會聚通道、單細胞採樣識別通道、細胞分離通道，完成生物細胞連續地會聚、採樣識別和分離，從而最終實現生物細胞樣本中多種細胞的計數分選。
2. 如權利要求1所述的利用縮微光圖案對細胞進行流式計數分選的方法，其特徵在於 生物細胞樣本中多種細胞的計數分選的具體步驟為步驟1 :將微量生物細胞樣品溶液通過進樣口 (11)注射到分離晶片的微流體腔(21) 中，並記錄注射溶液的體積；步驟2 :將正弦激勵電壓信號加於上層銦錫氧化物薄膜(13)透明導電層(33)，並設定頻率-步驟3 :在微流體腔(21)中投射光圖案構成由靜態的斜線陣列虛擬電極(41)、動態柵 欄型虛擬電極(42)組成的細胞會聚通道，在細胞會聚通道右側投射光圖案構成由矩形虛 擬電極擋板(51)、運動方向與動態柵欄型虛擬電極(42)相同的動態柵欄型虛擬電極(52)、 生物細胞識別模塊(53)、圓形虛擬電極(54)組成的單細胞採樣識別通道，在單細胞採樣識 別通道右側投射光圖案構成由折線虛擬電極擋板(61)、動態柵欄型虛擬電極(62)組成的 數量與識別的生物細胞種類相同的細胞分離通道；步驟4:動態柵欄型虛擬電極(42)運動方向水平，速度恆定，循環運動，將待分選生物 細胞順序會聚在一條直線上；步驟5 :動態柵欄型虛擬電極(52)速度恆定，將已經會聚在直線上的生物細胞逐個輸 送至生物細胞識別模塊(53)，該模塊採用圖像處理技術實時獲取圖像數據，分析出細胞大 小、位置，根據識別結果以該細胞為中心生成相應的圓形虛擬電極(54)，由圓形虛擬電極 (54)將不同大小的細胞輸送至相應的分離通道入口，同時該類細胞計數器加1 ;步驟6 :在圓形虛擬電極(54)將已識別細胞輸送到相應細胞分離通道入口時，運動方 向與動態柵欄型虛擬電極(42)相同的動態柵欄型虛擬電極(62)，將已識別的生物細胞輸 送至相應分離通道出口，隔離虛擬電極(63)用以隔離已分選的不同細胞，防止交叉；步驟7 :重複步驟4到步驟6的流程，直至樣品中的細胞全部被分離後，各通道停止運 行，輸出各類細胞分類數目，完成細胞的計數分選。
全文摘要
利用縮微光圖案對細胞進行流式計數分選的方法是通過順序構造光圖案形成細胞會聚通道、單細胞採樣識別通道、細胞分離通道，進而實現連續的細胞會聚、識別、分離，在對細胞的識別過程中，同時完成各種細胞的分類計數，由以上三個通道依次構成的分選微系統最終實現生物樣品中多種細胞的計數分選。本發明提供的這種生物細胞計數分離方法充分利用了縮微光圖案的靈活性優勢，同時避免了在晶片上製作複雜的物理實體電極陣列，在成本、功能、性能方面均優於目前的生物細胞的計數分選方法。
文檔編號G01N1/14GK101745438SQ20101001821
公開日2010年6月23日 申請日期2010年1月19日 優先權日2010年1月19日
發明者倪中華, 常嚴, 易紅, 朱曉璐 申請人:東南大學