適用於高密度發酵的畢赤酵母新菌株的製作方法
2023-05-26 11:17:21 2
專利名稱：適用於高密度發酵的畢赤酵母新菌株的製作方法
技術領域：
本發明提供了一種利用基因重組技術構建的適用於高密度發酵的畢赤酵母新菌株，屬生物技術領域。
背景技術：
畢赤酵母表達系統是目前應用最廣泛的表達系統，已成功的表達了多種有應用價值的外源蛋白。但畢赤酵母非常好氧，因此在高密度發酵中發酵後期供氧不足問題尤為突出，成為制約進一步提高外源蛋白在畢酵母中表達的瓶頸因素。傳統的解決辦法有(1)增加設備的供氧能力，如加大攪拌、通風等(2)加助溶劑，提高溶氧。但上述辦法不但受設備、能耗限制，還使發酵成本大幅度增加。
透明顫菌血紅蛋白具有在貧氧條件下促進細胞生長、提高蛋白合成能力的功能，VHb這一特性在耗氧量大，溶氧易成為限制性因素的抗生素工業，基因工程菌高密度發酵和供氧受限制的動、植物細胞培養的過程中具有良好的應用前景。透明顫菌血紅蛋白基因已在大腸桿菌、假單胞桿菌、鏈黴菌、黴菌和釀酒酵母等多種微生物中成功表達，並已應用於工業生產中提高α-澱粉酶、青黴素醯化酶、放線紫紅菌素等的產量。但至今未見透明顫菌血紅蛋白基因在畢赤酵母中應用的報導。
本發明的目的將透明顫菌血紅蛋白基因應用於畢赤酵母表達系統，通過構建新型畢赤酵母受體菌，解決畢赤酵母高密度發酵中的氧氣供求矛盾，為更多外源蛋白在畢赤酵母中的高效表達提供優良宿主。
發明內容
本發明將透明顫菌血紅蛋白基因導入目前廣泛應用的畢赤酵母表達系統受體菌，獲得了一種適用於高密度發酵的新型畢赤酵母。
本發明的完成包括以下幾個步驟1.人工設計合成透明顫菌血紅蛋白基因根據透明顫菌血紅蛋白的胺基酸序列，採用畢赤酵母偏愛密碼子並結合其他一些新基因設計原理設計合成了透明顫菌血紅蛋白基因，編碼序列Sequence No.1。
2.構建胞內表達載體以酵母胞內載體pPIC3.5K為基礎，構建了透明顫菌血紅蛋白基因的重組胞內表達載體pPIC3.5KV。
3.轉化酵母，篩選適量表達透明顫菌血紅蛋白的重組酵母線性化處理表達載體pPIC3.5KV，轉化畢赤酵母GS115，經篩選獲得在胞內適量表達透明顫菌血紅蛋白的重組酵母GS115/pPIC3.5KV，在貧氧條件下，GS115/pPIC3.5KV與GS115相比有明顯的生長優勢，因此更適於用作外源蛋白在畢赤酵母中表達的受體菌。
本發明所涉及的重組酵母由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期為2003年12月12日，分類命名為巴氏畢赤酵母，編號為CGMCC No.1074。
透明顫菌血紅蛋白在本發明構建的重組畢赤酵母中的表達，提高了該菌株利用氧的能力，促進其在貧氧條件下的細胞生長和產物合成，可提高外源蛋白的產率。同時，可以降低氧氣和能量的消耗，還不許附加的設備投資，因此可大幅度降低高密度發酵成本。因此，本發明所構建的畢赤酵母新菌株具有廣闊的應用前景。
具體實施例方式
實施例一 透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)的設計合成與克隆根據透明顫菌血紅蛋白(VHb)的胺基酸序列，採用畢赤酵母偏愛密碼子設計了vgb基因。為了克隆方便，在序列5』端和3』端分別引入BamHI和EcoRI位點，並在兩個酶切位點的外側分別加上了3個保護鹼基。為了保證vgb基因能在畢赤酵母中高效起始轉錄，在起始密碼子ATG前加上了AAACG，與ATG構成Kozak序列。
按照上述設計好的序列人工合成了6條寡核苷酸片段，然後用多聚核苷酸激酶使寡核苷酸片段磷酸化，再進行退火和連接反應獲得透明顫菌血紅蛋白基因。
用BamHI和EcoRI雙酶切透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)，與同樣雙酶切處理的pUC19連接，獲得重組質粒pUC19V，轉化大腸桿菌DH5a。經測序驗證，序列與設計完全相符。
實施例二 畢赤酵母胞內表達載體的構建用BamHI和EcoRI從pUC19V上切下vgb基因，與同樣雙酶切處理的pPIC3.5K連接，獲得重組載體pPIC3.5KV。連接產物轉化大腸桿菌，提取質粒DNA，用BamHI和NotI雙酶切鑑定，證明vgb基因已定向克隆到pPIC3.5K的BamHI和EcoRI位點之間。
實施例三 酵母轉化及重組酵母的篩選用SacI酶切5-10μg重組質粒pPIC3.5KV使之線性化，通過電擊法轉化宿主菌畢赤酵母GS115(His-，Mut+)，再經組氨酸營養缺陷型篩選、分子檢測(PCR、Southern雜交、Northern雜交)和蛋白表達檢測(SDS-PAGE)和CO-差示光譜檢測獲得在胞內適量表達透明顫菌血紅蛋白的重組酵母GS115/pPIC3.5KV。
實施例四 vgb基因表達對畢赤酵母生長的影響將重組酵母GS115/pPIC3.5KV和對照菌GS115分別在正常和貧氧條件下誘導培養，定時取樣測定菌體密度OD600，繪製生長曲線，分析不同溶氧條件下vgb基因表達對畢赤酵母生長的影響。在氧貧乏條件下，GS115/pPIC3.5KV明顯比對照菌GS115長勢要好；在正常培養條件下，誘導72小時之前，GS115/pPIC3.5KV與對照菌GS115生長差別甚微，但隨著誘導時間的延長，菌體密度增大，GS115/pPIC3.5KV的生長優勢逐漸明顯。以上結果可以說明，vgb基因的表達在氧充足條件下，對畢赤酵母的生長沒有明顯的作用；但在貧氧條件下，卻能夠明顯促進畢赤酵母的生長，提高菌體的生長速度。
序列表SEQUENCE LISTING110中國農業科學院生物技術研究所120適用於高密度發酵的畢赤酵母新菌株130適用於高密度發酵的畢赤酵母新菌株1601170PatentIn version 3.12101211435212DNA213人工序列4001cttgatcaac agactatcaa catcatcaag gctactgttc cagtgttgaa ggagcatgga 60gttactatca ctactacttt ctacaagaac ttgttcgcta agcatccaga ggtgagacca120ttgttcgata tgggaagaca agagtctctt gagcaaccaa aggctcttgc tatgactgtt180cttgctgctg ctcagaacat cgagaacctt ccagctatcc ttccagctgt gaagaagatc240gctgtgaagc attgccaagc tggagttgct gctgctcact acccaatcgt tggacaagag300ttgcttggag ctatcaagga ggtgcttgga gatgctgcta ctgatgatat ccttgatgct360tggggaaagg cttacggagt gatcgctgat gtgttcatcc aagttgaggc tgacttgtac420gctcaagctg ttgag 43權利要求
1.透明顫菌血紅蛋白DNA序列Sequence No.1，其特徵在於該序列由畢赤酵母偏愛密碼子組成。
2.包含根據權利要求1中DNA序列的重組表達載體。
3.根據權利要求2的重組表達載體轉化的重組畢赤酵母，其特徵在於可表達權力要求1中所述的DNA序列，在貧氧條件下有明顯的生長優勢，適用於高密度發酵。
4.根據權利要求4的重組畢赤酵母，保藏登記號為CGMCC NO.1074。
5.用畢赤酵母表達外源蛋白的方法，其特徵在於受體菌為權力要求3中所述的重組酵母。
6.根據權利要求5的方法，其中所說重組酵母為重組畢赤酵母。
7.根據權利要求6的方法，其中所說的重組畢赤酵母是畢赤酵母CGMCC NO.1074。
全文摘要
本發明涉及一種適用於高密度發酵的畢赤酵母新菌株。將人工合成的透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)轉入畢赤酵母，構建出透明顫菌血紅蛋白基因重組畢赤酵母。因透明顫菌血紅蛋白能從分子水平上提高重組菌對氧氣的利用能力，貧氧條件下促進細胞生長和產物合成，該重組酵母在貧氧條件具有明顯的生長優勢，更適用於高密度發酵，是用畢赤酵母表達外源蛋白的理想宿主。
文檔編號C12N15/81GK1546646SQ20031012136
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月15日 優先權日2003年12月15日
發明者李敏, 郭三堆, 李 敏 申請人:中國農業科學院生物技術研究所