一種過表達ZEB2基因質粒及其構建方法和應用與流程

2023-05-30 12:44:41 2

本發明涉及生物工程技術領域，尤其涉及一種過表達zeb2基因質粒及其構建方法和應用。

背景技術：

急性腎損傷(acutekidneyinjury，aki)是臨床各科室最常見的急危重症之一，可由多種原因引起，有關aki的發生機制一直是腎臟病領域關注的重要科學問題。目前認為，aki也是一種炎症反應介導的疾病，但缺血再灌注啟動腎組織炎症反應的機制尚不完全清楚。從輕微血肌酐升高到嚴重無尿性aki，aki程度和臨床表現不一而足，aki與患者病死率、慢性腎臟病(ckd)的發生以及維持性透析率密切相關。流行病調查數據顯示，aki發病率逐年增高，已由1988年的610例(每百萬人)增加至2009年的2888例(每百萬人)，在普通住院患者中aki發病率為3％-5％，而在icu中更高達30％-50％；同時對於aki的預後及轉歸較以往有了更加深入的認識。因此，如何防治aki的發生、發展以及尋找有效的治療aki的手段和藥物顯得尤為重要。

基因工程，又稱為基因重組技術，是二十世紀七十年代發展起來的在體外對dna進行操作的一門技術，廣泛用於疾病基礎研究、基因治療、基因免疫、基因疫苗等。其三要素分別為：酶、目的基因、載體。而真核表達載體是基因工程中用於構建真核基因表達系統的一種載體，近幾十年來，各國學者圍繞真核表達載體進行了各種疾病、基因等相關研究，在基因工程方面做了大量工作，為醫學科學研究開闢了嶄新途徑。

zeb2又叫zfhx1b、sip1等，屬於鋅指結構轉錄因子中的e盒結合鋅指蛋白(zincfingere-boxbindinghomeobox)家族的成員，是胚胎發育中必需的轉錄因子，首次關於zeb2的報導是在非洲爪蟾的胚胎中發現了zeb2的mrna。zeb2基因定位於染色體2q22.3上，由zfhx1b基因所編碼，包含9個外顯子和8個內含子，cds區為3645bp。zeb2由1215個胺基酸殘基組成，其分子量大約為136kd，包含2個鋅指簇(zincfingercluster)和連接這兩個鋅指簇的可變序列。n端和c端中的每一個鋅指結構都能夠獨立結合目的基因的受調節區域中的5』-cacct序列。zeb2屬於轉錄因子，最初的研究認為定位於核內，最近的研究表明，在胞漿及胞核中均有表達。它參與細胞生長、分化、凋亡、胚胎發育及炎症反應等多種生命活動的調控。

人源zeb2基因已在genbank註冊，註冊號bc-127102.1，定位於2q22.3，全長3912bp，其中cds序列3645bp，編碼1215個胺基酸。人源zeb2基因的組織表達譜分析顯示：該基因在人的許多腫瘤(胃癌、乳腺癌、鼻咽癌等)細胞以及肥大細胞中均有表達，研究發現，zeb2基因在大鼠腹腔巨噬細胞，人單核細胞thp-1中也有表達。

因此，為了進一步研究zeb2基因功能，目前急需一種有助於zeb2基因功能研究，並且為其對炎症在aki病程中的作用提供研究基礎的有用分子生物學工具。

技術實現要素：

本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供了一種有助於zeb2基因功能研究，並且為其對炎症在aki病程中的作用提供研究基礎的過表達zeb2基因質粒及其構建方法和應用。

本發明是通過以下技術方案實現的：一種過表達zeb2基因質粒，由zeb2基因cds序列與pegfp-c2真核表達載體的重組構建而成；其核苷酸如序列表seqidno:1，位於zeb2基因的第134-3778位；胺基酸序列如序列表seqidno:2所示。

一種構建上述過表達zeb2基因質粒的方法，包括如下步驟：

(1)裂解hk-2細胞，提取rna進行逆轉錄得到zeb2cdna；

(2)pcr擴增出人工zeb2基因的cds序列片段；

(3)zeb2基因的cds序列片段的純化；

(4)對所獲得的基因片段和pegfp-c2真核表達載體進行bamhi和xbai雙酶切，並進行連接；

(5)將連接產物轉化至大腸桿菌tg1中，並挑去陽性克隆進行培養，然後抽提質粒。

作為本發明的優選方式之一，所述步驟(1)中提取rna後，對其進行變性處理，具體步驟為：將rna在65℃中放置5-10min後，轉移至冰水中放置。

作為本發明的優選方式之一，所述步驟(1)中逆轉錄反應依照rtmastermix逆轉錄試劑盒的產品說明書進行，逆轉錄的反應體系包括：5×rtmastermix、rna、nuclease-freewater；具體步驟如下：

(1)配製反應體系：5×rtmastermix2μl+rna2μl+nuclease-freewater6μl；

(2)將上述反應體系放置37℃，並作用15min；

(3)將上述反應體系轉移至50℃，並作用5min；

(4)將上述反應體系轉移至98℃，並作用5min；

(5)將上述反應體系轉移至4℃，冷卻後凍存，即得到cdna。

作為本發明的優選方式之一，所述步驟(2)中pcr擴增cds序列片段時所需的上、下遊引物序列如下：

上遊引物：zeb2-f:5』-ggggtaccccatgaagcagccgatcat-3』

下遊引物：zeb2-r:5』-gctctagagctcacatgccatcttcc-3』。

作為本發明的優選方式之一，所述步驟(2)中pcr擴增反應根據primestarmax擴增酶產品說明書進行，pcr的反應體系包括：2×primestarmax、cdna樣品、上下遊引物、高純水；具體步驟如下：

(1)配製反應體系：2×primestarmax25μl+cdna1μl+引物各1μl+高純水22μl；

(2)將上述反應體系輕輕混勻後放入pcr儀器，設置如下程序運行；

(3)將上述pcr產物進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳；

(4)觀察結果並回收目的dna片段。

作為本發明的優選方式之一，所述步驟(4)中zeb2的pcr產物和pegfp-c2載體進行bamhi和xbai的雙酶切反應依照限制性內切酶產品說明書進行，酶切體系如下：bamhi限制性內切酶、xbai限制性內切酶、10×buffertango、zeb2的pcr產物或pegfp-c2載體；具體步驟如下：

(1)配製反應體系：10×buffertango2μl+bamhi和xbai各0.5μl+zeb2的pcr產物或和pegfp-c2載體各7μl；

(2)將上述反應體系放置37℃水浴鍋中，並作用4-6h；

(3)將上述酶切產物進行1-1.2％瓊脂糖凝膠電泳；

(4)觀察結果並回收目的dna片段。

作為本發明的優選方式之一，所述步驟(4)中連接方法具體如下：

(1)配製去磷酸化體系10μl：ciap1μl、10×ciap緩衝液1μl、pegfp-c2載體8μl，對載體進行去磷酸化處理；

(2)配製連接體系10μl：ciap去磷酸化後pegfp-c2載體0.5μl、10×t4dna連接酶緩衝液1μl、t4dna連接酶1μl、pcr酶切純化產物7.5μl；

(3)將上述反應體系置於0.5ml的離心管中混勻，16℃水浴過夜。

作為本發明的優選方式之一，所述步驟(5)中連接產物轉化至大腸桿菌tg1中的具體步驟如下：

(1)取出儲存於﹣80℃的tg1感受態細胞，冰浴解凍後加入10μl連接產物，混勻，冰上靜置30min；

(2)42℃熱休克90s，迅速取出置冰上3min；

(3)加入500μllb培養液，37℃、250rpm振蕩培養45min；

(4)取出約100μl轉化液塗於帶有相應抗性的lb固體培養基上，37℃倒置培養8-12h。

一種使用上述過表達zeb2基因質粒的應用，將所述過表達zeb2基因質粒轉染入人hk-2細胞系中，抑制人hk-2細胞中炎症因子的分泌。

本發明相比現有技術的優點在於：

(1)有助於研究zeb2基因功能，並且為研究其對炎症在aki病程中的作用提供了有用分子生物學工具；

(2)運用基因重組技術，針對zeb2基因，構建重組真核表達載體pegfp-c2-zeb2，並將其轉染至人hk-2細胞株中，研究zeb2過表達對hk-2細胞中炎症因子表達的影響，為進一步研究zeb2的功能，以及aki的基因治療奠定了基礎。

附圖說明

圖1是實施例1中的一種過表達zeb2基因質粒的真核表達載體pegfp-c2的結構示意圖；

圖2是實施例2中的一種過表達zeb2基因質粒的構建方法的真核重組載體pegfp-c2-zeb2的結構示意圖；

圖3是實施例2中的一種過表達zeb2基因質粒的構建方法的真核重組載體pegfp-c2-zeb2的酶切鑑定圖譜；

圖4是實施例3中的一種過表達zeb2基因質粒的表達過程中真核重組載體pegfp-c2-zeb2在hek293t細胞中的表達情況圖；

圖5是實施例4中的一種過表達zeb2基因質粒的應用的轉染組的hk-2細胞炎症因子(il-6、tnf-α)mrna表達水平的情況圖；

圖6是實施例4中的一種過表達zeb2基因質粒的應用的轉染組的hk-2細胞炎症因子(il-6、tnf-α)蛋白表達水平的情況圖。

具體實施方式

下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施例。

實施例1

本實施例的一種過表達zeb2基因質粒，由zeb2基因cds序列與pegfp-c2真核表達載體的重組構建而成；其核苷酸如序列表seqidno:1，位於zeb2基因的第134-3778位；胺基酸序列如序列表seqidno:2所示；此外，pegfp-c2真核表達載體的結構如圖1所示。

實施例2

本實施例的一種過表達zeb2基因質粒的構建方法，包括如下步驟：

1、zeb2cdna的提取

(1)取出細胞培養皿棄淨培養基，用1ml的pbs緩衝液清洗培養的hk-2細胞的細胞面(2-3次)；

(2)加入1ml的trizol裂解細胞10min，用移液器輕輕混勻細胞後將細胞裂解液轉移至離心管中，顛倒混勻後室溫靜置5min；

(3)加入trizol的1/5量的三氯甲烷(4℃預冷)，劇烈混勻後室溫靜置5min，高速低溫離心15min(4℃，12000r/min)；

(4)將0.4ml上層液體轉移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻後靜置60min(-20℃)，高速低溫離心15min(4℃，12000r/min)後棄上清；

(5)加入1ml75％的乙醇溶液後振蕩混勻，高速低溫離心5min(4℃，12000r/min)後棄上清，並乾燥5min；

(6)加入20μl無酶水溶解沉澱後，用於逆轉錄，也可凍存於-80度；

(7)rna的變性

將抽提好的rna進行變性，變性步驟如下：將rna在65℃中放置5min後，迅速轉移至冰水中放置2min。

逆轉錄反應體系(10μl)如下：

工藝步驟包括：

①將上述反應體系放置37℃，並作用15min；

②將上述反應體系轉移至50℃，並作用5min；

③將上述反應體系轉移至98℃，並作用5min；

④將上述反應體系轉移至4℃，冷卻後凍存，即得到cdna。

2、zeb2基因的克隆

(1)根據zeb2的cds序列，設計上下遊引物，引物序列分別如下：

zeb2-f:5』-ggggtaccccatgaagcagccgatcat-3』(含bamhi酶切位點)

zeb2-r:5』-gctctagagctcacatgccatcttcc-3』(含xbai酶切位點)

(2)pcr過程中所用的酶優選為takara公司的primestarmax高保真酶，其反應體系和反應程序如下：

反應體系(50μl)：

將上述反應體系混勻後放入pcr儀器，設置如下程序運行：

(3)將上述pcr產物進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳；

(4)觀察結果並回收目的dna片段；

將pcr產物進行瓊脂糖凝膠電泳，通過與dnamarker的對比，結果發現在3645bp出得到一條帶，大小與zeb2目的片段(包括酶切位點)的大小基本一致，表明成功擴增出人zeb2基因的cds序列。

3、zeb2目的片段的純化

純化所用的試劑盒優選為愛思進公司的膠回收試劑盒，純化步驟如下：

(1)在紫外燈下切下含有目的dna的瓊脂糖凝膠，用濾紙吸盡凝膠表面液體並切碎。計算凝膠重量，每100mg等於100μl體積；

(2)加入3個凝膠體積的bufferde-a，混合均勻後於75℃加熱(低熔點瓊脂糖凝膠於40℃加熱)，間斷混合(每2～3min)，直至凝膠塊完全熔化；

(3)加0.5個bufferde-a體積的bufferde-b，混合均勻。當分離的dna片段小於400bp時，需再加入1個凝膠體積的異丙醇；

(4)吸取步驟3中的混合液，轉移到dna製備管(置於2ml離心管)中，12,000rpm離心1min。棄濾液；

(5)將製備管置回2ml離心管，加500μlbufferw1，12,000rpm離心30s，棄濾液；

(6)將製備管置回2ml離心管，加700μlbufferw2，12,000rpm離心30s，棄濾液；以同樣的方法再用700μlbufferw2洗滌一次12,000rpm離心1min；

(7)將製備管置回2ml離心管中，12,000rpm離心1min；

(8)將製備管置於潔淨的1.5ml離心管中，在製備膜中央加30μleluent或去離子水，室溫靜置1min。12000rpm離心1min洗脫dna。

4、pcr產物和真核表達載體的雙酶切

對zeb2的pcr產物和pegfp-c2載體進行bamhi和xbai的雙酶切，酶切體系和方法如下：

酶切體系(10μl)：

酶切方法：將以上反應體系置於0.5ml的離心管中混勻，37℃水浴6h(溫度和時間的選擇依據內切酶的說明書而定)，1.2％瓊脂糖凝膠電泳後迅速觀察結果並回收目的dna片段，避免紫外長期照射。

5、酶切產物的連接

對zeb2和pegfp-c2的雙酶切產物進行連接，連接所用的酶優選為t4連接酶；在連接之前，為避免載體的自身環化，故對載體進行去磷酸化處理；

去磷酸化體系(10μl)：ciap1μl、10×ciap緩衝液1μl、pegfp-c2載體8μl；

連接體系(10μl)：ciap去磷酸化後的pegfp-c2載體0.5μl、10×t4dna連接酶緩衝液1μl、t4dna連接酶1μl、pcr酶切純化產物7.5μl；

連接方法：將上述反應體系置於0.5ml的離心管中混勻，16℃水浴過夜。

6、連接產物的轉化

轉化所用的大腸桿菌感受態為：tg1，轉化步驟如下：

(1)取出儲存於﹣80℃的tg1感受態細胞，冰浴解凍後加入10μl連接產物，輕輕混勻，冰上靜置30min；

(2)42℃熱休克90s(不要搖晃)，迅速取出置冰上3min；

(3)加入500μllb培養液，37℃、250rpm振蕩培養45min；

(4)取出約100μl轉化液塗於帶有相應抗性的lb固體培養基上，37℃倒置培養12h。

7、質粒的小量抽提

挑去8個陽性克隆加入含有2mllb培養基(氨苄抗性)的離心管中，37℃、250rpm振蕩培養12h，然後對菌液進行質粒抽提，所用的試劑盒為愛思進公司的質粒小量抽提試劑盒，抽提步驟如下：

(1)用滅菌牙籤挑取細菌的單克隆，放入盛2ml含有相應抗生素的lb培養液的15ml離心管中，37℃、250rpm振蕩培養12h；

(2)將約1ml菌液轉入1.5ml離心管中，4℃、12,000rpm離心1min，上清；

(3)加250μlbuffers1懸浮細菌沉澱，懸浮需均勻，不應留有小的菌塊；

(4)加250μlbuffers2，溫和並充分地上下翻轉6次使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液；

(5)加350μlbuffers3，溫和並充分地上下翻轉混合8次，12,000rpm離心10min；

(6)吸取步驟5中的離心上清並轉移到製備管(置於2ml離心管中)，12000rpm離心1min，棄濾液；

(7)將製備管置回離心管，加500μlbufferw1，12,000rpm離心1min，棄濾液；

(8)將製備管置回離心管，加700μlbufferw2，12,000rpm離心1min，棄濾液；以同樣的方法再用700μlbufferw2洗滌一次。棄濾液；

(9)將製備管置回2ml離心管中，12,000rpm離心1min；

(10)將製備管移入新的1.5ml離心管中，在製備管膜中央加80μl無菌水，室溫靜置1min，12,000rpm離心1min，棄製備管；

(11)樣品置-20℃備用，圖2為真核重組載體pegfp-c2-zeb2的結構示意圖。

8、對質粒進行酶切鑑定和送測序

對抽提好的質粒進行bamhi和xbai的雙酶切鑑定，酶切體系和方法如下：

酶切體系(10μl)：

酶切方法：將上述反應體系置於0.5ml的離心管中混勻，37℃酶切6h後，瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光儀觀察、凝膠成像儀拍照保存，並將酶切鑑定正確的質粒送生工生物公司測序；其中，真核重組載體pegfp-c2-zeb2的酶切鑑定圖譜見圖3，其中標示1為pegfp-c2雙酶切，標示2為zeb2的pcr產物，標示3為pegfp-c2-zeb2雙酶切；

將測序結果通過blast比對，發現與gencbank中公布的序列一致，目的基因片段長度實為3645bp。

實施例3

一種過表達zeb2基因質粒的表達，根據實施例2得到過表達zeb2基因質粒後，對其進行表達，具體步驟如下：

1、細胞培養

本發明所需培養的細胞為：hek、293t、thp-1、大鼠腹腔巨噬細胞、hk-2細胞，首先復甦細胞，並用含有體積比為10％胎牛血清的dmem高糖培養基於37℃、5％co2的細胞培養箱中進行培養，並及時換液和傳代。

(1)細胞復甦：將液氮內凍存的細胞取出，迅速浸入37℃的溫水中並輕輕搖晃至完全融化(復溫時間應控制在兩分鐘以內)，迅速轉移細胞懸液至離心管中並加入5ml培養基，低速離心(1000r/min，2min)後棄盡上清，加入5ml培養基輕輕懸浮細胞後接種至培養皿中開始培養；

(2)細胞換液：輕輕棄去舊的細胞培養基，pbs溫和清洗後加入新鮮的完全培養基(含有10％胎牛血清的高糖dmem)繼續培養(註：pbs和新鮮的培養基需要37℃預熱)；

(3)細胞傳代：在細胞中加入1ml的胰酶後置於培養箱中進行消化，在顯微鏡下觀察細胞形態變化，及時加入完全培養基終止消化，轉移細胞懸液至離心管中低速離心(1000r/min，2min)後棄上清，用pbs洗滌一次後加入0.2ml培養基懸浮細胞並重新接種至培養皿中繼續培養；

(4)細胞凍存：將傳代過程中的細胞懸液低速離心(1000r/min，2min)後棄上清，加入1ml細胞凍存液(配方見)輕輕懸浮細胞後分裝至細胞凍存管中進行分級凍存，即4℃0.5-1h、-20℃1-2h、-80℃約24h、液氮凍存。

2、質粒瞬時轉染(脂質體法)

(1)用250μl的opti-mem稀釋5μl的脂質體和總量約為2μg的dna，溫和混勻，室溫靜置5min；

(2)將上述步驟中的兩種溶液溫和混勻，室溫靜置20min，以形成dna-脂質體複合物；

(3)棄去培養皿中的培養液，加入1mlopti-mem轉染液，將(2)中的dna-脂質體複合物緩慢滴加到培養皿中，輕輕搖晃培養皿混勻；

(4)37℃、5％co2培養6h後，用預溫的pbs清洗一次，換新鮮的完全培養液後繼續培養約24h。

3、免疫印記

(1)總蛋白提取：離心收集細胞，用pbs清洗2-3次後，加入0.5ml細胞裂解液，冰上裂解10min，然後高速冷凍離心10min，收集0.4ml上清液，加入上樣緩衝液，沸水浴5min，放置冰上待電泳；

(2)安裝制膠板並檢漏，首先配製10％分離膠，用1ml異丙醇壓線，待充分凝固後(約1h)，配製濃縮膠，插入所需梳子，待充分凝固後使用；

(3)安裝電泳系統，在電泳槽中加入500ml電泳緩衝液，將10μl樣品加入上樣孔後開始電泳(80v電泳0.5h+100v電泳1.5h)；

(4)電泳結束後，切下sds-page膠，應用三明治方式(從下往上依次是濾紙+膠+pvdf膜+濾紙)進行溼轉；

(5)安裝電轉系統，在電轉槽中加入500ml預冷的電轉緩衝液，並將整個電轉槽放入冰水中，開始電轉(100v電轉2h)；

(6)電轉結束後，輕輕取下pvdf膜，用麗春紅染色鑑定轉膜是否成功，轉膜成功後，用tbst洗去麗春紅，室溫封閉至少1h；

(7)封閉完之後，用tbst洗膜(3次，5min)後，加入一抗溶液4℃孵育過夜；

(8)次日，用tbst洗膜(3次，10min)後，加入二抗溶液室溫孵育2h。然後用tbst洗膜(3次，20min)；

(9)用ecl發光劑檢測pvdf上的條帶，並用x射線膠片暗室顯影。

實驗結果顯示，真核重組表達載體pegfp-c2-zeb2在真核細胞內能夠正常表達，為後續的研究奠定了基礎；圖4為真核重組載體pegfp-c2-zeb2在hek293t細胞中的表達情況圖，圖中，標示1為未轉染的293t細胞裂解液，標示2為轉染pegfp-c2-zeb2的293t細胞裂解液。

實施例4

一種過表達zeb2基因質粒的應用，將所述過表達zeb2基因質粒轉染入人hk-2細胞系中，研究過表達zeb2基因對人hk-2細胞株炎症因子(il-6、tnf-α)分泌的影響；具體步驟如下：

1、將對數生長期的細胞進行傳代，得到細胞懸液，並以適當密度(約1×108·l-1)將細胞接種到6孔板中，培養約24h，待到細胞密度為80％左右，進行pegfp-c2-zeb2的瞬時轉染，轉染一段時間後收集細胞懸液；

2、根據製造商的說明書，使用trizol試劑的將總rna從培養hk-2細胞中分離，總rna用無rnase的水洗脫，並儲存在-80℃；

3、使用轉錄子第一鏈cdna合成試劑盒合成cdna，並使用具有sybr-greenmastermix的檢測系統進行實時pcr，從invitrogen獲得q-pcr引物，樣品一式兩份，每次測量重複至少三次，q-pcr結果如圖5所示；

圖5a的qrt-pcr的分析表明：pegfp-c2-zeb2的轉染上調了zeb2的表達；圖5b的qrt-pcr的分析表明：pegfp-c2-zeb2的轉染下調了tnf-α和il-6的表達(*p<0.05和**，p<0.01vs正常組；#p<0.05和##p<0.01vs空白質粒組)；

綜合以上結果發現：與未轉染組細胞的炎症因子(il-6、tnf-α)mrna水平相比，轉染了pegfp-c2-zeb2組的hk-2細胞中炎症因子il-6和tnf-αmrna的表達均有明顯降低，且差異存在統計學意義(p＜0.05)；說明過表達zeb2基因能夠明顯降低炎症因子(il-6、tnf-α)mrna水平，從而抑制炎症反應。

另外，提取總蛋白並檢測濃度，進行凝膠電泳，溼轉硝酸纖維膜後，用5％脫脂牛奶封閉60min，加入1：200稀釋的zeb2兔抗、1：1000稀釋的il-6、tnf-α和1∶1000稀釋的beta-actin內參一抗後，4℃孵育過夜，用tbst漂洗3次，加入相應濃度的二抗，室溫下放置60min，tbst漂洗3次，加入eclplus，暗視條件下顯影，用quantityone軟體對蛋白條帶分析，westernblot結果如圖6所示；

圖6a的westernblot的分析表明：pegfp-c2-zeb2的轉染上調了zeb2的表達；圖6b的westernblot的分析表明，pegfp-c2-zeb2的轉染下調了tnf-α和il-6的表達(*p<0.05和**p<0.01與正常組相比；#p<0.05和##p<0.01與vector組相比)；

綜合以上結果發現：與未轉染組細胞的炎症因子(il-6、tnf-α)蛋白水平相比，轉染了pegfp-c2-zeb2組的細胞的炎症因子(il-6、tnf-α)蛋白均有明顯降低，且差異存在統計學意義(p＜0.05)；說明過表達zeb2基因能夠明顯降低炎症因子(il-6、tnf-α)蛋白水平，從而抑制炎症反應。

以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。

sequencelisting

安徽醫科大學

一種過表達zeb2基因質粒及其構建方法和應用

2017

1

patentinversion3.3

1

3645

dna

human

1

atgaagcagccgatcatggcggatggcccccggtgcaagaggcgcaaacaagccaatccc60

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