AaDBR2基因啟動子DBR2pro1及其用途的製作方法

2023-05-31 05:39:27

本發明涉及一種在植物分泌性腺毛特異性表達的啟動子及其用途，具體地涉及一種AaDBR2基因啟動子DBR2pro1及其用途。
背景技術：
：青蒿(ArtemisiaannuaL.)是菊科蒿屬的一年生草本植物。青蒿素是從其地上部分分離出的一種含有過氧橋結構的倍半萜內酯化合物，是目前世界上公認的最有效的治療瘧疾藥物，特別是對腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾更加有效。目前，世界衛生組織推薦的最有效的治療瘧疾的方法就是青蒿素聯合療法(ACTs)。目前青蒿素的主要來源是從青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低(0.01％～1％)，使得這種藥物的大規模商業化生產受到了限制。隨著青蒿素生物合成途徑的逐漸清晰，採用基因工程手段提高青蒿中青蒿素含量具有非常大的潛力，例如過量表達代謝途徑中的青蒿素合成途徑關鍵酶編碼基因被證實是一種提高青蒿素含量的有效方法。在目前的青蒿基因工程研究中，多採用組成型的啟動子，例如菸草花葉病毒35S啟動子(CaMV35)。這種啟動子能夠驅動外源基因在所有的組織和器官中表達，可能會對植物的正常生長造成一定的負擔和危害。由於腺毛不是植物生長所必須的，利用腺毛特異表達的啟動子對植物的腺毛系統進行遺傳操作不會對植物的生長發育造成危害。因此，克隆得到青蒿腺毛特異性的啟動子對青蒿素代謝工程具有較為重要的意義。青蒿素合成途徑中有許多關鍵的酶，包括AaADS，AaCYP71AV1，AaDBR2，AaALDH1等。其中AaADS和AaCYP的啟動子已經被克隆出來了，但AaDBR2的啟動子還沒有報導。AaDBR2是從青蒿腺毛特異cDNA文庫中分離出來的一個編碼青蒿醛△11(13)雙鍵還原酶的基因。先前的研究表明AaDBR2在青蒿腺毛中大量表達，而在其他組織中表達量很低，這暗示其啟動子可能是腺毛特異表達的啟動子。因此，克隆AaDBR2啟動子對利用植物腺毛組織表達和生產代謝產物的基因工程育種具有重要意義。技術實現要素：本發明的目的在於克服現有技術中的不足，提供一種在植物分泌性腺毛中特異性表達的AaDBR2基因啟動子DBR2pro1及其用途，本發明提供的啟動子能引導基因在轉基因植物的分泌性腺毛中特異表達。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：第一方面，本發明涉及一種AaDBR2基因啟動子DBR2pro1，所述啟動子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。第二方面，本發明還涉及前述AaDBR2基因啟動子DBR2pro1在利用植物分泌性腺毛組織表達和生產代謝產物的基因工程育種中的用途。優選的，所述代謝產物為青蒿素。本發明涉及的AaDBR2基因啟動子DBR2pro1的獲得步驟具體如下：步驟一，培養青蒿無菌苗；步驟二，基因組DNA步移(GenomicDNAWalking)法克隆啟動子基因組序列；步驟三，分析啟動子上的順式作用元件，確定AaDBR2基因啟動子DBR2pro1的類型；步驟四，AaDBR2基因啟動子DBR2pro1連入1391Z載體；步驟五，將構建好的載體1391Z-DBR2pro1載體轉化根癌農桿菌；步驟六，將帶有1391Z-DBR2pro1載體的根癌農桿菌轉化青蒿；步驟七，PCR檢測轉基因植株；步驟八，啟動子所引導的GUS報告基因在植株中的表達部位的確定。與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果：本發明克隆得到的AaDBR2基因啟動子DBR2pro1，可以特異性地在分泌性腺毛組織啟動並高效表達外源基因，能廣泛應用於利用植物腺毛組織表達和生產代謝產物的基因工程育種中。附圖說明通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特徵、目的和優點將會變得更明顯：圖1為1391Z-DBR2pro1與GUS基因融合的植物雙元表達載體示意圖；圖2為轉基因青蒿PCR陽性電泳檢測結果；圖3為非轉基因青蒿在GUS染色下的幼嫩葉片的照片；圖4為非轉基因青蒿在GUS染色下幼嫩葉片的藍光激發的螢光照片；圖5為轉DBR2pro1的陽性植株在GUS染色下的幼嫩葉片的照片；圖6為轉DBR2pro1的陽性植株在GUS染色下的幼嫩葉片的照片；圖7為圖5中轉DBR2pro1的陽性植株在GUS染色下的幼嫩葉片的藍光激發螢光照片；圖8為圖6中轉DBR2pro1的陽性植株在GUS染色下的幼嫩葉片的藍光激發螢光照片。具體實施方式下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助於本領域的技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬於本發明的保護範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆：實驗室手冊見NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress的1989年版中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。本實施例涉及的根癌農桿菌EHA105已在《黃亞麗，蔣細良，田雲龍，郭萍，朱昌雄；根癌農桿菌介導的哈茨木黴菌遺傳轉化的研究，中國生物工程雜誌，2008，28(3)：38-43》文獻中公開。根癌農桿菌EHA105可通過公開市售的商業渠道取得，如可以從澳大利亞CAMBIA公司購得，菌株編號為Gambar1。下述實施例涉及一種AaDBR2基因啟動子DBR2pro1的獲得，具體包括如下步驟：步驟一，培養青蒿無菌苗青蒿種子用體積分數為75％的乙醇浸泡1min，再用20％(w/v)的NaClO浸泡20min後，無菌水衝洗3次～4次，用無菌吸水紙吸乾表面水分，接種於無激素的MS固體培養基上，25℃、16h/8h(light/dark)光照培養，14天後即可獲得青蒿無菌苗；步驟二，基因組DNA步移(GenomicDNAWalking)法克隆啟動子基因組序列本實施例採用基因組DNA步移分離AaDBR2基因5′側翼序列，基因組DNA步移的方法參照基因組WalkerTMUniversalKit(Clontech,638904)的說明書，具體步驟如下：(1)基因組酶切採用3種平末端的限制性內切酶DraI、EcoRV和StuI分別對青蒿基因組DNA進行酶切，反應體系如表1所示：表1限制性內切酶體系基因組DNA(0.1μg/μL)25μL限制性內切酶(10units/μL)8μL限制性內切酶buffer10μLddH2O57μL總體積100μL將反應體系輕輕地混勻，於37℃水浴中反應過夜；(2)接頭三種酶切產物分別進行純化，用20μL水溶解；取4μL酶切並純化的DNA於新的EP管中，分別加入如下反應物：25μM的基因組WalkerAdaptor1.9μL，1.6μL10×LigationBuffer，6units/μL的T4DNA連接酶0.5μL，混勻後於16℃PCR儀中反應過夜；70℃水浴5min終止反應；加入72μL水後可用於PCR擴增；(3)PCR擴增為了提高產物的特異性，採用兩輪巢式PCR擴增，基因組DNA步移中使用的引物如表2所示，其中AP1和AP2是試劑盒中附帶的引物，DBR2-SP1和DBR2-SP2是根據AaDBR2基因的序列設計的特異引物，首輪PCR反應體系如表3所示，PCR反應條件為：94℃預變性3min；94℃25s，72℃3min，7個循環；94℃25s，67℃3min，32個循環；67℃延伸7min；表2基因組DNA步移引物引物名稱引物序列(5′→3′)AP1GTAATACGACTCACTATAGGGCAP2ACTATAGGGCACGCGTGGTDBR2-SP1ATAAGAAAGCCACCAGCAGTTGADBR2-SP2ATTGAACTTGCCCATCTTGTAGG表3基因組DNA步移的反應體系首輪PCR的產物稀釋50倍用作第二輪PCR的模版，第二輪PCR的反應體系如表4所示，PCR反應條件為：94℃預變性3min；94℃25s，72℃3min，5個循環94℃25s，67℃3min，20個循環；67℃延伸7min；PCR產物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收得到的特異條帶，連接到pMD18-T載體用於測序，將該片段的序列與AaDBR2基因的序列進行拼接，結果獲得了AaDBR2基因上遊約1.8kb的序列；表4基因組DNA步移的第二輪反應體系1:50稀釋的第一輪PCR產物3μL10×exTaqBuffer5μLdNTP(2.5mMeach)3μLAP21μLDbr2-SP21μLexTaqDNA聚合酶0.5μLddH2O36.5μL步驟三，分析啟動子上的順式作用元件，確定AaDBR2基因啟動子DBR2pro1的類型本實施例中得到啟動子DBR2pro1是長度為1813bp的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，為了尋找啟動子上的順式作用元件，用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對AaDBR2基因的啟動子DBR2pro1進行分析，發現在DBR2pro1上有TATAbox，ABRE，ACE，CAAT-box，CAT-box，HSE，LAMP-element，G-box，Wbox等，G-box發現於很多植物基因的啟動子中，它是很多刺激響應啟動子行使功能所必需的元件，它在植物啟動子對光、無氧環境和植物激素的響應過程中起到重要的作用；另外，DBR2pro1的其它元件也可以對一些刺激做出響應，例如ABRE在ABA應答中起作用，Wbox在植物抗脅迫應答中起作用，以上的分析結果表明，DBR2pro1是誘導型的啟動子，能受幾種刺激物的誘導；步驟四，AaDBR2基因啟動子DBR2pro1與GUS報告基因的融合併連入1391Z載體將AaDBR2基因的啟動子DBR2pro1與GUS報告基因融合，研究該啟動子驅動GUS基因在不同組織部位中的表達，為了方便表達載體的構建，正向引物中引入了PstI的酶切位點，反向引物中引入了BamHI的酶切位點，將DBR2pro1連入1391Z載體，載體的示意圖如圖1所示，引物如表5所示；表51391Z-DBR2pro1載體構建的PCR引物引物名稱引物序列(5′→3′)1391Z-DBR2pro1-upgactgcagTGAAGGATGACCAAAAGCATAA1391Z-DBR2pro1-downgcggatccTATTGAATTTGATGTTGATCAGG步驟五，將構建好的載體1391Z-DBR2pro1載體轉化根癌農桿菌將含DBR2pro1的片段和GUS基因融合的植物雙元表達載體轉入根癌農桿菌，並進行PCR驗證，結果表明，含DBR2pro1片段的植物雙元表達載體已成功構建到根癌農桿菌菌株中，即獲得含DBR2pro1和GUS基因融合的植物表達載體1391Z-DBR2pro1根癌農桿菌工程菌；步驟六，將帶有1391Z-DBR2pro1載體的根癌農桿菌轉化青蒿(1)外植體的預培養青蒿種子用體積分數為75％的乙醇浸泡1min；再用20％(w/v)的NaClO浸泡20min；無菌水衝洗3～4次；用無菌吸水紙吸乾表面水分；接種於無激素的MS，該MS培養基採用Murashige和Skoog在1962年發明的固體培養基，該固體培養基可以通過商業渠道獲得；25℃、16小時的日光和8小時的黑夜培養，即可獲得青蒿無菌苗，待苗長至5cm左右後，剪取無菌苗葉片外植體用於轉化；(2)農桿菌與外植體的共培養將所述的葉片外植體，轉到1/2MS和100μmol/LAS組成的共培養培養基中，滴加活化好的含有所述DBR2pro1的植物雙元表達載體的根癌農桿菌工程菌的1/2MS懸液，使外植體與菌液充分接觸，28℃暗培養3d，以滴加在不帶有目的基因的根癌農桿菌的1/2MS液體培養基懸液的葉片外植體為對照；(3)抗性再生植株的篩選將所述的共培養3d的青蒿外植體轉入到MS、0.5mg/L6-BA、0.05mg/LNAA、50mg/LKan和500mg/LCb組成的發芽篩選培養基上，於25℃、16小時的日光和8小時的黑暗中培養，每兩周繼代培養一次，經過2～3次繼代後即可獲得Kan抗性叢生芽，將生長良好的抗性叢生芽剪下轉入1/2MS0和125mg/LCb組成的生根培養基上培養至生根，從而獲得Kan抗性再生青蒿植株；步驟七，PCR檢測轉基因植株根據目的基因所在表達盒DBR2pro1-GUS序列中的DBR2pro1和GUS分別設計正向引物和反向引物(上遊引物DBR2pro1:GACTGCAGTGAAGGATGACCAAAAGCATAA；下遊引物GUS-down：GCCTGCCCAACCTTTCGGTATA)進行檢測；利用所設計的PCR特異引物，進行兩次獨立的PCR檢測，能擴增出特異DNA片段，而以非轉化青蒿基因組DNA為模板時，沒有擴增出任何片段，電泳結果如圖2所示；步驟八，啟動子所引導的GUS報告基因在植株中的表達部位的確定對PCR檢測為陽性的青蒿植株，取其葉片進行GUS組織染色，圖3所示為非轉基因青蒿在GUS染色下的幼嫩葉片，圖4為圖3對應的藍光激發的螢光照片；圖5及圖6所示為轉DBR2pro1的陽性植株在GUS染色下的幼嫩葉片，圖7和圖8分別為圖5和圖6對應的藍光激發螢光照片，結果表明，染色部位為青蒿的分泌性腺毛，說明DBR2pro1在轉基因青蒿中能夠引導外源基因在分泌性腺毛中特異表達。綜上所述，本發明克隆得到的AaDBR2基因啟動子DBR2pro1，可以特異性地在分泌性腺毛組織啟動並高效表達外源基因，能廣泛應用於利用植物腺毛組織表達和生產代謝產物的基因工程育種中。以上對本發明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發明並不局限於上述特定實施方式，本領域技術人員可以在權利要求的範圍內做出各種變形或修改，這並不影響本發明的實質內容。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp