厭氧短小棒狀桿菌藥用成分的分離方法、藥用用途及藥物製劑的製作方法

2023-05-30 22:26:26 1

專利名稱：厭氧短小棒狀桿菌藥用成分的分離方法、藥用用途及藥物製劑的製作方法
技術領域：
本發明提供一種厭氧短小棒狀桿菌藥用成分的分離方法，並提供了其藥用用途及藥物製劑，屬於生物工程技術分離純化工藝技術領域。
背景技術：
現有的厭氧短小棒狀桿菌(以下簡稱CP)製劑為全菌體製劑，商品名「長生利康」，是一種免疫治療製劑，該項製劑在生產過程中異種蛋白含量過高，致使產品在使用中副作用大，包括發熱，注射局部疼痛，使患者難以接受，限制了其推廣應用。

發明內容
本發明提供一種厭氧短小棒狀桿菌(CP)藥用成分的分離方法。
本發明還提供了該桿菌的藥用用途及藥物製劑。
本發明的技術解決方法包括以下步驟取CP菌株用1-2ml生理鹽水稀釋，接種於4-5g碎肉培養基中，37℃厭氧培養4-5天，傳至抗氧化劑培養基中，厭氧培養，再傳至肝透析液培養集中，厭氧培養3-7天，收集菌體，用生理鹽水稀釋成250億-500億/ml，加入2-3倍的脫水劑(冷-20～-60℃丙酮)，置4℃冰箱過夜，收集菌體，用冷丙酮洗2-3次，將沉澱物至37℃乾燥成菌粉，研磨後備用。
取1-3克菌粉加入50-100ml生理鹽水製成懸液，用蛋白酶消化(胰糜蛋白酶0.1-0.6mg/ml，胰蛋白酶0.1-0.6mg/ml，37℃-55℃消化3-6小時)，然後升高溫度80-120℃終止消化，用PBS洗滌，收集沉澱，該消化重複兩次以上為佳；離心收集沉澱，加入RNAse 70-200μg/ml，DNAse 50-150μg/ml，蛋白酶0.1-0.6mg/ml在0.2M Tris液中20-37℃消化12-36小時，高速離心，洗滌，取沉澱物重複消化過程一次，離心，生理鹽水洗滌2次，然後進行脫脂殺菌處理用乙醚/乙醇0.5-1.5/1-2(V/V)脫脂24-72小時，2-4次，收集沉澱用氯仿脫脂24-72小時2-4次，收集沉澱，用氯仿/甲醇3-1/0.5-2(V/V)24-72小時，2-4次然後生理鹽水洗滌，冷凍乾燥製成厭氧短小棒狀桿菌的藥用成分純化物。
抗氧化劑包括硫乙醇酸鈉。
脫水劑包括丙酮。
消化蛋白酶胰糜蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶。
經過藥理學實驗篩選，上述提取物具有以下特徵1、促進脾單核細胞酸性磷酸酶的活性。
2、促使單和吞噬細胞功能增強。
3、激活骨髓多能幹細胞。
4、對免疫細胞有明顯的激活作用。
通過對其機理的研究，上述提取物具有抗腫瘤、抑制轉移的藥理活性。
上述提取物還具有對銀屑病的治療作用。
具有對婦女外陰白斑的治療作用。
本發明的藥物組合物含有治療有效量的上述提取物為活性成分，以及含有一種或多種藥學上可以接受的載體。
本發明的提取物和組合物可用於製備治療癌症的藥物。
同時還可製備具有治療銀屑病、婦女外陰白斑疾病的藥物。
上文的載體是指藥學領域常規的藥物載體，包括稀釋劑、賦形劑，填充劑，粘合劑，溼潤劑，崩解劑，吸收促進劑，表面活性劑，吸附載體。
本發明可以組合物的形式通過口服、直腸、靜脈、肌肉注射或胃腸外給藥方式施用於這種治療的患者。按照藥學領域的常規生產方法製備各種劑型如片劑、顆粒劑、衝劑、膠囊、栓劑、噴霧劑、緩釋劑和注射劑。也可使其活性成分與一種或多種載體或藥物混合，製成所需劑型。
本發明的藥物組合物優選重量比為0.1％～99.5％活性成分，優選含有10-90％，更優選20-80％，最好為70％的本發明提取物。
本發明的施藥量可根據用藥途徑、患者年齡、體重、疾病類型和嚴重程度等變化，日劑量為0.01～10mg/kg。
下述的藥理實驗證實了本發明提取物藥理活性一、純化製劑動物實驗結果用體重18-20g的C57小鼠，實驗組和對照組各10隻，雌雄各半.將樣品稀釋為0.8-2.4mg/ml，給實驗組腹腔注射0.5ml/只，對照組腹腔注射生理鹽水0.5ml/只，14天處死，稱體重，脾重，計算脾激活指數，其值不應低於1.5，該實驗重複三次得到類似結果，統計學處理結果表明實驗組和對照組相比有顯著性差異(p＜0.01)。

表1純化製劑脾指數測定結果

二、通過臨床研究1.對癌症治療效果(1)抗腫瘤，抑制轉移對癌症治療有較好的療效，特別對癌性胸腹水效果達95％以上；對於肺癌手術患者，隨機分組，18例作為實驗組，術前皮下注射CP製劑，18例做為對照組皮下注射生理鹽水。結果表明，與對照組相比，實驗組癌細胞有明顯變性，癌巢周圍有明顯的纖維增生，免疫活性細胞聚集，隨訪一年半，對照組4例死亡，6例復發，；而治療組均活存並復發。
表2 CP對中早期肺癌術後抗復發作用

統計學處理結果P＜0.01
(2)能延長化療放療使用時間，延長存活期有明顯效果表3短棒狀製劑與化療合用的療效

統計學處理結果P＜0.05.
2.婦女外陰白斑治療觀察，對於來自白求恩醫大二院，哈爾濱醫科大學附屬一院，中國醫大三院，河北中醫院共522例患者治療結果表明，痊癒率15％，總有效率92％，無效7.2％。
3.銀屑病觀察對於來自鞍山市礦泉研究所，白求恩醫科大學二院，東北輸油管理局，職工療養院，瀋陽市第七人民醫院患者共466例總有效率87.7％，治癒率35％，無效17％。
本發明的積極效果在於提供了厭氧短小棒狀桿菌藥用成分的分離方法，為除去熱源物質，降低副作用，保留其有效成分，純化製劑，獲得更新換代的產品，為患者提供更安全有效的產品。
具體實施例方式實施例1取CP菌株用2ml生理鹽水稀釋，接種於4g碎肉培養基中，37℃厭氧培養5天，傳至硫乙醇酸鈉抗氧化劑培養基中，厭氧培養，再傳至肝透析液培養集中，厭氧培養5天，收集菌體，用生理鹽水稀釋成300億-450億/ml，加入3倍的脫水劑(-46℃冷丙酮)，置4℃冰箱過夜，收集菌體，用冷丙酮洗2次，將沉澱物至37℃乾燥成菌粉，研磨後備用。
取3克菌粉加入100ml生理鹽水製成懸液，用胰糜蛋白酶0.1-0.6mg/ml，胰蛋白酶0.1-0.6mg/ml，37℃-55℃消化3-6小時，然後升高溫度80-120℃終止消化，用PBS洗滌，收集沉澱，在同上重複消化一次；離心收集沉澱，加入RNAse 70-200μg/ml，DNAse 50-150μg/ml，蛋白酶0.1-0.6mg/ml在0.2M Tris液中20-37℃消化12-36小時，高速離心，洗滌，取沉澱物重複消化過程一次，離心，生理鹽水洗滌2次，然後進行脫脂殺菌處理用乙醚/乙醇0.5-1.5/1-2(V/V)脫脂24-72小時，2-4次，收集沉澱用氯仿脫脂24-72小時2-4次，收集沉澱，用氯仿/甲醇3-1/0.5-2(V/V)24-72小時，2-4次然後生理鹽水洗滌，冷凍乾燥製成CP藥用成分純化物。
實施例2取實施例1製備的CP藥用成分純化物20克，加人賦形劑藥用澱粉20克，混合均勻，造粒整粒壓片，製得片劑，每片含CP的藥用成分純化物200毫克。
實施例3製備本發明膠囊製劑取實施例1製備的厭氧短小棒狀桿菌的藥用成分純化物20克，加人賦形劑藥用澱粉30克，充分混合均勻，裝入膠囊，每粒含厭氧短小棒狀桿菌的藥用成分純化物200毫克。
實施例4
粉針注射劑將實施例1所得產物用甲醇重結晶得本發明純品。
CP藥用成分純化物 15克氯化納 75克注射用水 1000ml製備過程將CP藥用成分純化物、氯化納溶解與適量的注射用蒸餾水中，用1～5％的氫氧化鈉溶液調PH8.5，加注射用水至1000ml，通過0.2μm的微孔濾膜過濾所得溶液，在無菌條件下裝入安瓶，冷凍乾燥。
權利要求
1.一種厭氧短小棒狀桿菌藥用成分的分離方法，其特徵包括以下步驟取CP菌株用1-2ml生理鹽水稀釋，接種於4-5g碎肉培養基中，37℃厭氧培養4-5天，傳至抗氧化劑培養基中，厭氧培養，再傳至肝透析液培養集中，厭氧培養3-7天，收集菌體，用生理鹽水稀釋成250億-500億/ml，加入2-3倍的脫水劑(冷-20～-60℃丙酮)，置4℃冰箱過夜，收集菌體，用冷丙酮洗2-3次，將沉澱物至37℃乾燥成菌粉，研磨後備用。取1-3克菌粉加入50-100ml生理鹽水製成懸液，用蛋白酶消化(胰糜蛋白酶0.1-0.6mg/ml，胰蛋白酶0.1-0.6mg/ml，37℃-55℃消化3-6小時)，然後升高溫度80-120℃終止消化，用PBS洗滌，收集沉澱，該消化重複兩次以上為佳；離心收集沉澱，加入RNAse 70-200μg/ml，DNAse 50-150μg/ml，蛋白酶0.1-0.6mg/ml在0.2M Tris液中20-37℃消化12-36小時，高速離心，洗滌，取沉澱物重複消化過程一次，離心，生理鹽水洗滌2次，然後進行脫脂殺菌處理用乙醚/乙醇0.5-1.5/1-2(V/V)脫脂24-72小時，2-4次，收集沉澱用氯仿脫脂24-72小時2-4次，收集沉澱，用氯仿/甲醇3-1/0.5-2(V/V)24-72小時，2-4次然後生理鹽水洗滌，冷凍乾燥製成CP的藥用成分純化物。
2.根據權利要求1所述的分離方法製得的藥用成分純化物。
3.根據權利要求1藥用成分純化物在製備抗腫瘤、抑制轉移作用藥物中的應用。
4.根據權利要求1藥用成分純化物在製備治療銀屑病藥物中的應用。
5.根據權利要求1藥用成分純化物在製備治療婦女外陰白斑藥物中的應用。
6.用於製備抗腫瘤、抑制轉移作用的藥物組合物，其中含有治療有效活性成分的權利要求1藥用成分純化物和藥學上可接受的載體。
7.用於製備治療銀屑病的藥物組合物，其中含有治療有效活性成分的權利要求1藥用成分純化物和藥學上可接受的載體。
8.用於製備治療婦女外陰白斑病的藥物組合物，其中含有治療有效活性成分的權利要求1藥用成分純化物和藥學上可接受的載體。
9.根據權利要求6～8所述的藥物組合物，優選重量比為0.1％～99.5％活性成分，優選含有10-90％，更優選20-80％，最好為70％。
10.根據權利要求3～8所述的藥物，其特徵在於所說的藥劑是任何一種藥劑學上所說的劑型。
全文摘要
本發明公開一種厭氧短小棒狀桿菌藥用成分的分離方法，並提供了其藥用用途及藥物製劑，採用本發明對厭氧短小棒狀桿菌的藥用成分進行分離，可除去熱源物質，降低副作用，保留其有效成分，純化製劑，獲得更新換代的產品，為患者提供更安全有效的產品。對癌症治療有較好的療效，特別對癌性胸腹水效果達95％以上；對婦女外陰白斑治療的痊癒率15％，總有效率92％；對銀屑病治療觀察治癒率35％，總有效率87.7％。
文檔編號A61K35/74GK1439381SQ03110879
公開日2003年9月3日 申請日期2003年1月17日 優先權日2003年1月17日
發明者張靜華, 萬金會, 邰桂香 申請人:張靜華