提高植物脅迫抗性的方法和材料的製作方法

2023-05-31 00:15:56 1

專利名稱：：提高植物脅迫抗性的方法和材料的製作方法
技術領域：
：本發明涉及植物中的脅迫抗性，比如抗旱性、抗鹽性、抗熱或抗旱性、抗光性和抗PH性，以及用於提高植物中脅迫抗性和用於篩選植物中與提高脅迫抗性提高相關的突變的方法和材料。本發明還涉及用於延遲植物中開始開花和改變植物葉片形狀的方法和材料。
背景技術：
：全世界作物產量最大的限制因素是非生物脅迫，導致平均有超過50%的潛在產量損失(Boyer,J.S.(1982),"PlantProductivityandEnvironment"Science218(4571)443-448)。非生物脅迫包括極端溫度、鹽度、酸性土壤、高光強、乾旱及其組合。因為植物是固定的，不能逃離這些脅迫條件，所以它們通過改變蛋白質和代謝物組成、形狀和生理而作出響應。這些改變允許植物通過適應脅迫條件而使所受損傷受到限制，還可以修復由脅迫引起的損傷。這些改變由過程介導，所述過程可感知脅迫和/或其對植物的影響，並激活多個複雜的信號傳導通路。依賴於經歷的脅迫條件的類型，由植物激活不同的通路，但是通路間經常重疊並且相互作用。這種重疊能引起交叉抗性，即儘管只接觸一種脅迫條件，卻對多種類型脅迫產生抗性。這很重要，因為脅迫很少單獨發生。例如低溫脅迫還會導致高光脅迫，因為儘管低溫會引起植物代謝變慢，但如果光能和從前一樣多，植物還是能豐收。同樣地，乾旱能引起高溫脅迫，因為要關閉氣孔保持水分，但是因此犧牲了蒸發的冷卻作用，導致高溫脅迫。此外，在自然中，脅迫條件很少單獨存在。在澳大利亞，作物同時經歷乾旱和高光脅迫是可以理解的。儘管已經研究了脅迫信號傳導通路的一些組分，但是由於脅迫響應通路的複雜性，對這些組分在通路中的位置和它們與其它組分的相互作用知之甚少，並且因此現有的改善植物脅迫抗性的方法有限。因此，需要新方法生產脅迫抗性提高的植物。
發明內容本研究令人驚訝地顯示了SALl基因中的突變，所述突變可導致與SALl蛋白質有關的活性降低或消失，使突變體植物的脅迫抗性提高。因此，根據本發明的一個方面，提供用於獲得相對於野生型植物的脅迫抗性提高的植物的方法，方法包括(a)將至少一個突變或外源性核酸導入一個或多個植物細胞的基因組，所述至少一個突變或外源性核酸導致在所述一個或多個植物細胞中與SALl或其同源物有關的活性降低；(b)從所述一個或多個植物細胞再生一個或多個植物；和(c)選擇一個或多個相對於野生型植物的脅迫抗性提高的植物。可以通過本領域已知的任何適當方法將至少一個突變或外源性核酸導入。例如，可以通過化學或物理誘變技術，或使用插入突變方法如轉座子或T-DNA，導入突變，並且可以通過重組方法，使用例如化學輔助細胞滲透(使用，例如鈣、鋰、PEG)、電穿孔、微注射、月旨質體介導的轉染、微粒轟擊(生物彈道)、農桿菌介導的轉化、病毒感染、原生質體融合或本領域已知的任何其它合適的方法導入外源性核酸。根據本發明的實施方式，所述方法包括將至少一個突變導入SALl基因或其同源物，或者抑制或阻抑SALl基因或其同源物的表達。可以將至少一個突變導入一個或多個植物細胞中編碼SALl或其同源物的核苷酸序列中，並且可以包含一個或多個核苷酸的插入、缺失或替代。根據另一個實施方式，突變可以包括位於SEQIDNO:1的核苷酸731至745、1226、1518、1519和1690區域中，或在SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置處的一個或多個核苷酸的插入、缺失或替代。根據另一個實施方式，突變可以包括在SEQIDNO:1的位置1226處，或SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置處由鳥嘌呤至腺嘌呤的突變。產生的突變可以導致SEQIDNO:2的位置217處由甘氨酸至天冬氨酸的胺基酸變化。根據另一個實施方式，突變可以包括在SEQIDNO:1的位置731處，或SEQIDNO:1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置處由胞嘧啶至胸腺嘧啶的突變。產生的突變可以導致SEQIDNO2的位置124處由丙氨酸至纈氨酸的胺基酸變化。根據另一個實施方式，突變可以包括在SEQIDNO1的位置736處，或SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置處由鳥嘌呤至腺嘌呤的突變。產生的突變可以導致SEQIDNO:2的位置217處由穀氨酸至賴氨酸的胺基酸變化。根據另一個實施方式，突變可以包括在SEQIDNO:1的位置1690處，或SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置處由鳥嘌呤至腺嘌呤的突變。根據另一個實施方式，突變可以包括在SEQIDNO:1的位置734和735之間，或SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置處一個或多個核苷酸的插入，或者突變可以包括用一個或多個核苷酸替代SEQIDNO1的核苷酸734-735，或SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同的核苷酸。根據另一個實施方式，突變可以包括在SEQIDNO1的位置1518和1519之間或包含位置1518和1519，或在SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置處插入一個或多個核苷酸。根據一個實施方式，突變可以是SALl無效突變。根據另一個實施方式，本發明的方法可以包含向所述一個或多個植物細胞導入外源性核酸，所述外源性核酸能抑制內源性SALl或其同源物的表達，或者用外源性蛋白質的表達替代內源性SALl或其同源物的表達。外源性蛋白質可以是外源性突變SALl或其同源物，或者任何其它合適的蛋白質，比如提供可篩選的表型的蛋白質。由根據本發明方法產生的植物對很多非生物脅迫的抗性相對於野生型植物提高，所述脅迫包括，但不限於，乾旱、鹽、溫度脅迫、光脅迫、土壤PH和礦物質毒性、或它們的任何組合。相對於野生型植物，所述植物對生物脅迫的抗性提高，所述脅迫由動物(包括食草動物和寵物或寄生生物體)、細菌、真菌和病毒或它們的任何組合誘導，但不限於此。根據一個實施方式，產生的植物相對於野生型植物至少抗旱性提高。根據本發明的方法的另一個實施方式，產生的植物的開花時間延遲。根據本發明的方法的另一個實施方式，產生的植物的葉片表型改變。根據本發明的另一個實施方式，提供用於獲得相對於野生型植物的開花時間改變的植物的方法，方法包含(a)將至少一個突變或外源性核酸導入一個或多個植物細胞的基因組，所述至少一個突變或外源性核酸使所述一個或多個植物細胞中與SALl或其同源物有關的活性降低；(b)從所述一個或多個植物細胞再生一種或多種植物；和(c)選擇相對於野生型植物的開花時間改變的一種或多種植物。根據本發明的另一個實施方式，提供用於獲得相對於野生型植物葉片表型改變的植物的方法，方法包括(a)將至少一個突變或外源性核酸導入一個或多個植物細胞的基因組，所述至少一個突變或外源性核酸使所述一個或多個植物細胞中與SALl或其同源物有關的活性降低；(b)從所述一個或多個植物細胞再生一種或多種植物；和(c)選擇相對於野生型植物的葉片表型改變的一種或多種植物。還提供通過本發明的方法獲得的植物，和植物部位(包括葉、莖、根、塊莖、花、果實及其部分)和來自植物的突變體/轉基因種子。根據本發明的另一個實施方式，提供篩選存在核苷酸序列的至少一個突變等位基因的植物的方法，所述核苷酸序列編碼SALl或其同源物，所述方法包括使用至少一個適合作為探針或引物的核酸分子分析植物的DNA，所述探針或引物能在嚴格條件下與SALl基因或其同源物雜交。根據更具體的實施方式，篩選方法可以包括使用適於擴增SALl基因或其同源物區域的至少一個寡核苷酸引物對，所述引物對包括正向引物和反向引物，檢測所述區域中是否存在突變。所述區域包含完整的SALl基因或其同源物，或者可以僅包含其中一部分，比如，例如(參照圖10)，核苷酸區域，其包含外顯子3、外顯子3和4之間的內含子、外顯子5、外顯子5和6之間的內含子、和外顯子6和7之間的內含子、或它們的任何組合。核酸分子，或寡核苷酸引物對的成員，可以是適於在嚴格條件下與靶標核苷酸序列特異性雜交的任意長短，並且包含從約15個核苷酸到約100個核苷酸，但是長度更通常地從約15至約30個核苷酸。圖l-alx8中SAL基因中點突變的鑑定A.色譜圖譜，表示Col-O野生型和由逆代雜交得到的多個alx8個體以及包含APX2-LUC構建體的Col-O野生型中點突變區域的序列。下劃線表示由ContigExpress(Invitrogen,Carslbad，CA,USA)計算得到的一致性序列。第二個下劃線表示來自ArabidopsisInformationResource(TAIR;www.arabidopsis.orR)的SALl基因序列。點劃線框表示點突變的位點，並且實線框表示為dCAPS引物導入的突變。除APX2-LUC之外的所有序列為反向，即3』到5』。B.來自TAIR的所有alx8個體和SALl基因+3kb啟動子的所有序列的比對。箭頭表示基因序列5』到3』的方向。圖2-alx8中SALl基因中點突變的驗證將來自擬南芥信息資源(TAIR)的T8H11BAC的SALl基因和約1.07kb的啟動子消化並連接進PCAM2300文庫載體(CAMBIA，Canberra,Australia)。通過農桿菌介導轉化而轉化Col-O野生型和alx8植物。分離得到用基因的野生型拷貝回補的alx8的兩系。還分離得到七個系的包含構建體的Col-O野生型，並且所述野生型未表現出可見的表型。圖3-alx8SALl基因組序列(TAIR登錄序列4010730406；名稱AT5G63980.1；序列長度(bp):2122；最後修正日期2007-04-17)。這個序列在序列表中鑑定為SEQIDN0:1。這個基因組序列是此前的TAIR登錄號2160829的更新版本，並且其位於TAIR登錄號2160829中預測的起始密碼子上遊162個核苷酸處。alx8中的點突變(gl226a)、起始密碼子(atg)和終止密碼子(tga)高亮顯示。圖4-alx8胺基酸序列(TAIR登錄號:AA序列4010745380；名稱AT5G63980.1；長度407aa；最後修訂日期2007-08_16)。這個序列在序列表中鑑定為SEQIDNO:2。alx8中的胺基酸變化(G217D)高亮顯示。圖5-與SALl同源的蛋白質的比對使用blastp工具，在國家生物技術信息中心網站(NCBI;www.ncbi.nlm.nih.gov)鑑定與SALl同源的蛋白質。然後使用ClustalW，在歐洲生物信息研究所(EMBL-EBI；www,ebi.ac.uk)比對這些蛋白質。登錄號如下SALl，AY03894/Q42546(SEQIDNO46)；水稻(Oryzasativa),NP_001066326/NM_001072858(SEQIDNO44)；玉米(Zeamays),AAK57915/AF288075(SEQIDNO:45)。「*」表示列中的殘基在所有序列中都一樣，「」表示觀察到保守替代，並且「.」表示觀察到半保守替代。圖6-EST與SALlmRNA的同源性A.在基因索引軟體網站(TGI；www.compbio.dfci.harvard,edu)使用blastn，發現EST與SALlmRNA具有同源性。通過同樣的軟體計算得到百分比同一性。B.A中列出的EST的序列比對，在EMBLjBI網站使用ClustalW比對序列。「*」表示列中的核苷酸在比對的所有序列中相同。鑑定了序列表中的下述序列雲杉(SEQIDN047)；松樹(SEQIDNO48)；苜蓿(SEQIDNO49)；蓮花(SEQIDNO50)；大豆(SEQIDNO51)；SALl(SEQIDNO52)；油籽(油菜籽)(SEQIDNO53)；白楊(SEQIDNO54)；棉花(SEQIDNO55)；西紅柿(SEQIDNO56)；馬鈴薯(SEQIDNO57)；洋蔥(SEQIDNO58)；小麥(SEQIDNO59)；大麥(SEQIDNO60)；稻米(SEQIDNO61)；和玉米(SEQIDNO62)。C.進化分支圖，顯示根據B中的比對對共同祖先的估計。由EMBL-EBI網站計算。圖7-乾旱條件對Col-O野生型、fryl-Ι和alx8的影響。在21°C，150微摩爾光子mY1，16小時白晝/8小時黑夜，保持水分13天。對於每種生態型，由5個生物複製樣本作為代表。所有植物都是大概相同的發育年齡，並且在乾旱時期開始時尚未開花野生型植物4周齡，而alx8和fryl-Ι植物為8周齡。圖8-fryl-l和alx8耐旱。4周齡植物接觸乾旱條件25天，條件為21°C，150微摩爾光子JiT2iT1,12小時白晝/12小時黑夜。A)0、10、17、21和25天後，fryl_l、C24野生型、alx8和Col-O野生型植物接觸乾旱條件。在兩個單獨的實驗中，每個基因型由五株植物作為代表。B)由盆重量隨時間的變化估計土壤的水流失。給出了A)中植物的盆重量和平均盆重量。誤差條為五個生物副本之間的標準偏差。圖9-來自耐乾旱擬南芥突變體SALK—020882的SALl基因組序列(突出顯示起始密碼子(atg)和終止密碼子(tga))。從擬南芥生物資源中心(ABRC)獲得Col-O生態型中的T-DNA插入系。突變與alx8等位。A)TAIR給出的插入位點。通過從T-DNA插入的LB單次測序而建立。這給出了互補序列，即朝向基因的5，末端。(SEQIDNO3)B)為了確認插入的位置，從來自一個植物的DNA上的插入的左邊界開始進行熱不對稱交錯PCR(TAIL-PCR)。由兩側獲得序列，表明出現雙插入的可能性。獲得的序列還表明在插入位點附近缺失llbp。(SEQIDNO4)圖10-SAL1基因的大規模描述。外顯子用方框表示，內含子用線表示，箭頭代表設計用於擴增的引物(參見表1)，還給出了salk和fryl-3插入的位置，和fryl-l,fryl_2、hos2和鑑別的alx8點突變的位置。圖Il-SALl的western印跡。使用抗SALl抗體和來自Col-O和alx8的全葉蛋白質，將來自Col-0、C24、alX8和fryl-Ι的體內全可溶葉蛋白質提取物中的SALl蛋白質粉豐度與5ng重組SALl蛋白質比較(圖11B)。使用由Ponceau染色檢測的二磷酸核酮糖羧化酶的大亞基作為上樣對照(loadingcontrol)。分析每個基因型的兩株植物，並標明蛋白質標記的分子量。圖12-從左至右為下述照片alx8突變體、fryl-Ι突變體、Col-O野生型、C24野生型和salk_020882突變體擬南芥植物，表示與對應於C24野生型的葉形改變相比，salk_020882突變體和alx8突變體葉形的改變和fryl_l突變體葉形的改變相似。圖13-表示植物無水存活平均天數的條形圖。突變體salk_020882表現出最大的耐乾旱性，平均存活18.4天，alx8突變體為16.3天，野生型為12.0天(樣品大小三株野生型和alx8植物和六株salk_020882植物)圖14-照片表示最下面一行_乾旱測試；最上面一行_對照；從左至右野生型植物(11天，乾旱脅迫植物即將死亡前)，salk_020882突變體和alx8突變體(兩種突變體在14天乾旱處理後仍然存活)。圖15A和15B-圖15A顯示下述照片，從左至右為，在接觸乾旱條件0、14、16和18天後(從上至下)，然後重新澆灌後三天的Col-O野生型、alX8、salk_020882、fryl-l和C24野生型植物。重新澆灌三天後，alx8和fryl-Ι突變植物表現出較強的恢復，包括葉片綠色並膨脹，同時野生型植物如果有任何恢復的跡象，也是表現為大多數葉子變黃和枯萎。所示植物是三次重複實驗的代表，實驗涉及每個基因型的五株植物。圖15B顯示乾旱處理過程中的土壤水含量(SWC)。圖16A和16B-圖16A顯示葉片相對水含量(RWC)，並且圖16B顯示在非脅迫條件下和乾旱12天後Col-O和alx8的葉片中的葉片水勢。柱為至少四株植物的平均值士標準偏差(SD)。圖17-顯示下述照片2、3、5和8周齡Col-O野生型植物(上圖)和alx8植物(下圖)，表明alx8植物中存在發育延遲。還證明8周齡Col-O野生型植物正在開花(花籽為證)，同時alx8植物還沒有開花。圖18-A顯示Col-O野生型葉片和alx8葉片的葉片厚度的條形圖；B顯示典型的Col-O野生型葉片和alx8葉片的橫截面。圖19-表示早晨(上圖)和晚上(下圖)fryl_l、C24野生型、alx8和Col-O野生型植物葉片碘染色的結果，表明這些SALl突變體葉綠體中的澱粉含量顯著降低。圖20-SAL1突變體及其野生型的代謝物譜的主成份分析(PCA)。使用每個生態型的至少四株生物副本中的超過150個代謝物的豐度計算PCA。繪製出由主成份1和2(PCl和PC2)考查的總方差百分比。圖21-顯示大小、發育和形態對抗旱性的影響。㈧在相同發育階段(開始開花)時Col-0,alx8和salk_020882的抗旱性；顯示了27株alx8和5株fryl-Ι植物在乾旱的第O天和第9天的代表圖像。植物每天生長12小時。(B)在發育的相同生長階段(成熟綠色)植物的抗旱性，alx8和fryl-Ι為四周齡，Col-O為八周齡。植物為每個生態型的五株生物副本的代表，生長條件為每天16小時。(C)測量(A)的盆重量，並繪製成初始重量的百分比；繪製了五個家系中每個的平均值+S.D.。(D)針對乾旱活力，繪製在兩個單獨實驗中生長的一些30日齡Col-O植物的蓮座區域。生長條件為每天8小時。(E)分離的蓮座的脫水。數據為四個生物副本的平均值+SD。實驗重複三次。(F)在相同年齡的Col-O(每盆一株植物)和alx8(每盆兩株植物)進行9天保水。生長條件為每天16小時。縮寫ABA-脫落酸IP3-I,4，5三磷酸肌醇I(1，4)P2-I，4二磷酸肌醇1(4,5)P2-4，5二磷酸肌醇PAP-3』多腺苷5』磷酸酯ROS-活性氧部分WT-野生型定義如本文所使用的，術語「包含」表示「主要包括，但不一定僅包括」。單詞「包含」的變化形式，具有相對應的相似含義。如本文所使用的，術語「基因」，指位於基因組中的確定區域，並且可以包含負責控制表達，即編碼部分的轉錄和翻譯的控制性核苷酸序列。基因還可以包含其它5』和3』未翻譯序列和終止序列。可以存在的其它元件為例如內含子。如本文所使用的，在描述蛋白質時，術語「同源」表示在不同部分基本具有相同功能和相似性質的蛋白質，並且其在至少部分區域中，共享至少50%胺基酸同一性。這種同源蛋白質可以在完整的胺基酸序列中共享至少約30%胺基酸同一性，至少約40%胺基酸同一性，至少約50%胺基酸同一性，至少約60%胺基酸同一性，至少約70%胺基酸同一性，至少約80%胺基酸同一性，至少約90%胺基酸同一性或至少約95%胺基酸同一性。相似地，核苷酸分子的同源性是編碼在不同部分基本具有相同功能和相似性質的蛋白質的核酸分子，其中所述編碼的蛋白質在至少部分區域中，共享至少50%胺基酸同一性(這種核酸同源性由於基因編碼的簡併性和不同植物種屬之間優選密碼子用途之間的差異而共享顯著少於50%的同一性)，可以在完整的胺基酸序列中共享至少約30%胺基酸同一性，至少約40%胺基酸同一性，至少約50%胺基酸同一性，至少約60%胺基酸同一性，至少約70%胺基酸同一性，至少約80%胺基酸同一性，至少約90%胺基酸同一性或至少約95%胺基酸同一性。如本文所使用的，術語「突變」表示相對於野生型多肽或核酸分子，多肽或核酸分子中的任何變化，由這種變化產生「突變體」，並且「突變體」可以例如包含單個或多個胺基酸或核苷酸變化，或者同時包含核苷酸和胺基酸變化，包括點突變、無效突變、移框突變，並且可以包含一個或多個核苷酸或胺基酸的缺失、插入或替代，其可以包含天然或非天然發生的核苷酸或胺基酸或其類似物。「核酸」，如本文所表示的，指脫氧核糖核酸或核糖核酸及其單鏈、雙鏈或三重形式的聚合物。該術語可以包括包含天然核苷酸的類似物的核酸，所述天然核酸與參照核酸具有相似的結合活性。特定的核酸序列還可以包含其經過保守修飾的變體(例如簡併密碼子替代物)和互補序列。術語「核酸」、「核酸序列」或「多核苷酸」也可以與基因、cDNA和由基因編碼的mRNA交替使用。術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」在本文中可以交替使用，指胺基酸殘基的聚合物。這些術語的範圍中包括聚合物，其中一個或多個胺基酸殘基可以包含相應天然發生的胺基酸的人工化學類似物，以及，或者替代天然發生的胺基酸聚合物。術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」還可以包括包括修飾的聚合物，比如，但不限於，糖基化、脂質吸附、硫酸化、穀氨酸殘基的、羧化作用、羥基化和ADP-核糖基化。術語SALl和FRYl如本文所使用的，可互換，術語SALl和FRYl亦然，這些術語指相同的蛋白質和編碼核苷酸序列。具體實施例方式本發明基於下述發現在SALl編碼基因中具有突變的植物對脅迫的耐受性提高，包括提高抗旱性。SALl蛋白質是雙功能的，具有肌醇多磷酸酯1-磷酸酶活性和3』(2』)，5』-二磷酸核苷酸酶活性，並且參與IP3的分解代謝，IP3是涉及壓力信號傳導的小分子。有多種肌醇磷酸酶或Ptase，其都從IP3分子上的不同位置剪切磷酸酯。這些不同的活性，除了全部導致IP3降低外，經常產生不同表型，可能是由於水解產物的功能功能，比如I(1，4)P2和1(4，5)P2。表型差異還可能由於這些已經被極大削弱的酶的第二種活性，比如SALl的核苷酸酶活性。此外，酶的定位和表達水平的差異可能影響表型。令人驚訝的是，SALl對IP3的體外活性相對較低(特別是和它的核苷酸酶比較)。已經分離了SALl中的多個突變體，並稱為fryl突變體(fieryl；Ishitani,M.,L.M.Xiong等(1997),"GeneticahalysisofosmoticandcoldstresssignaltransductioninArabidopsisInteractionsandconvergenceofabscisicacid-dependentandabscisicacid-independentpathwaysPlantCell9(11)1935-1949；Xiong,L.Μ.,B.H.Lee^(2001),"FIERY1encodinganinositolphlyphosphate1-phosphataseisanegativeregulatorofabscisicacidandstresssignalinginArabidopsis，，，Genes&Development15(15):1971-1984)或hos2突變體("highexpressionofosmoticstressregulatedgeneexpression2，，；Lee,H.,L.Xiong等(1999),『『Cold-regulatedgeneexpressionandfreezingtoleranceinanArabidopsisthalianamutant，，，ThePlantJournal17(3)301-308；Xiong,L.,H.Lee,等(2004),『『AsingleaminoacidsubstitutionintheArabidopsisFIERYl/H0S2proteinconferscoldsignalingspecificityandlithiumtolerance",ThePlantJournal40=536-545)。如先前所報導的，在選擇脅迫響應基因RD29A的表達變化中分離這些突變體。在正常條件下fry1-1突變體的RD29A表達增加，在低溫、鹽和滲透脅迫和ABA處理後也是如此。據報導這是由於點突變產生SALl蛋白質(At5g63980)的第六個外顯子中的終止密碼子，產生截短型蛋白質，其不包含保守的α-螺旋，α-螺旋包含WD-X11-GG基序，是金屬離子和磷酸鹽的協調以及親核水活化所需的。結果是蛋白質對IP3或PAP無活性。據報導fryl-Ι突變體對鹽、低溫和滲透壓的脅迫敏感性增加(Xiong等，2001)。脅迫響應基因表達，比如HSP70(Atlgl6030)、C0R15A(At2g42540),KINl(At5gl5960)和ADH(Atlg77120)，與野生型相比，在對脅迫響應時在突變體中也增加(Xiong等，2001)，使人們相信SALl作為壓力脅迫途徑的負調節子。也報導了其它fryl突變體，fryl-2和fryl_3，，是具有相似性質的無效突變(Xiong等，2001)。hos2-l突變體是溫度敏感突變體，其中脅迫響應基因表達在低溫改變，並且是低溫脅迫敏感型(Xiong等，2004)。與野生型植物相比，這個突變體的基因表達在正常條件下或通過滲透或ABA脅迫不會改變(Lee等，1999)。在fryl或hos2突變體中未報導乾旱、鹽、光、冷或熱耐受性。本發明人先前在正常條件和高光脅迫後篩選抗氧化酶抗壞血酸過氧化物酶2(APX2)誘導變化的突變體中，已經分離了擬南芥突變體，alx8。在兩種條件下alx8突變體的APX2表達均增加，並且葉形變化，抗旱性增加(Rossel,J.B.，P.B.Walter等.(2006),"AmutationaffectingASC0RBATEPER0XIDASE2geneexpressionrevealsalinkbetweenresponsestohighlightanddroughttolerance",Plant,CellandEnvironment29(2)=269-281)發現這些性質共分離(co-segregating)，表明它們是單點突變的結果。還發現alx8改變了多個脅迫響應基因的表達，表明參與擬南芥中乾旱脅迫響應信號傳導的多個途徑的差異調節。然而，這個突變體的本質至今為止尚未確定。在突變體的定位克隆後，發現突變位於先前鑑別的SALl基因中。對這個基因的無效突變體fry1-1的研究，現在表明還增加了抗旱性。另一個擬南芥突變體，命名為salk_020882，其在SALl基因中包含約IOkbT-DNA插入，對其已經進行了研究，發現相對於野生型植物增加了抗旱性。因此，通過修飾這個基因的表達可能改善農業上具有重要意義的植物品種的抗旱性。因此，本發明提供用於獲得相對於野生型植物的脅迫抗性提高的植物，包括(a)將至少一個突變或外源性核酸導入一個或多個植物細胞的基因組中，使所述一個或多個植物細胞中與SALl或其同源物有關的活性降低；(b)從所述一個或多個植物細胞再生一個或多個植物；和(c)選擇相對於野生型植物的脅迫抗性提高的一個或多個植物。根據實施方式，方法包括向SALl基因或其同源物導入至少一個突變，或者抑制或阻抑SALl基因或其同源物的表達。可以通過本領域已知的任何合適的方法，將導致一個或多個植物細胞與SALl或其同源物有關的活性降低的突變導入所述一個或多個植物細胞中，例如，合適的方法可以包括使一個或多個植物細胞(其可以是植物種子細胞，或植物部位的細胞，以及分離的植物細胞)接觸化學或物理突變手段，或插入突變手段如轉座子、還原轉座子、逆轉錄病毒或T-DNA。合適的用於將突變導入植物基因組的材料和方法也在例如國際專利公開W098/26082,"ArabidopsisProtocoIs，，(2ndEdition,Salinas,J.禾口Sanchez—Serrano，J.，eds,MethodsinMolecularBiology323(2006),HumanaPress)，禾口「CurrentProtocolsinMolecularBiology」(Ausubel等(eds)，JohnWiley&Sons(2000))中描述，其通過引用併入本文。還通過用野生型植物與包含突變的植物(如先前通過基因篩選和/或分析所確定的-包含期望突變的植物可以已經存在於提供的植物種質/培養物/種子收集物/變體中)雜交而將突變導入一個或多個植物細胞，並且植物可以由得到的種子產生，然後篩選突變繼承。根據本發明的實施方式，將突變導入所述一個或多個植物細胞中編碼SALl的核苷酸序列或其同源物，並且突變可以包括編碼SALl的核苷酸序列或其同源物中一個或多個核苷酸的插入、缺失或替代。在一個實施方式中，突變是SALl無效突變。或者，突變可以產生表達產物，然而其與SALl或其同源物有關的活性至少降低。在本研究過程中鑑別的SALl突變導致相對於野生型植物，包括fryl-1、alx8和salk_02882突變體，擬南芥植物的抗旱性至少提高。fryl-Ι突變導致從色氨酸到終止密碼子的第341個胺基酸的變化，產生缺失α5螺旋的截短型蛋白質，所述螺旋是酶活性所需要的(At5g63980)。alx8突變體具有點突變，包括在At5g63980.1基因組序列中第1226個鹼基對上鳥嘌呤到腺嘌呤的變化(TAIR序列4010730406(2007年4月17日)，登錄號NM_125794.4:SEQIDNO1的1226位置)。alx8突變體表達突變的SALl蛋白質，包含胺基酸序列的第217個胺基酸上甘氨酸到天冬氨酸的胺基酸變化(TAIR序列4010745380(2007年8月16日)，登錄號NP_201203.2:SEQIDNO:2)，並且salk_02882突變體在SEQIDNO1的位置734和735之間包含約IOkbT-DNA插入或替代SEQIDNO1的核苷酸735至745。期望具有更高脅迫抗性的其它突變體，包括抗旱性更高的突變體，是fryl-2、fryl-3和hos2突變體。fryl_2突變體包括在At5g63980.1基因組序列中第736個鹼基對上鳥嘌呤到腺嘌呤的變化(TAIR序列4010730406，登錄號:NM_125794.4=SEQIDNO:1的736位置)，導致位置126(SEQIDNO2)的穀氨酸殘基替代成賴氨酸，產生無活性蛋白質。fryl-3突變體在At5g63980.1基因組序列中第1518個鹼基對上第五個和第六個外顯子之間包含6.7kbT-DNA插入(TAIR序列4010730406，登錄號NM_125794.4=SEQIDNO1的1518位置)，導致沒有RNA轉錄本。hos2-l突變體在At5g63980.1基因組序列中第731個鹼基對上包含胞嘧啶到胸腺嘧啶的突變(TAIR序列:4010730406，登錄號:NM_125794.4=SEQIDNO1的731位置)，導致位置124(SEQIDNO2)的丙氨酸殘基由纈氨酸替代，產生具有溫度敏感活性的表達蛋白質。根據本文提供的教導，僅通過常規實驗，可以獲得或產生SALl的其它突變體，或其同源物，並且，例如，這種核苷酸序列(和編碼蛋白質)表現出高保守程度-參見，例如，圖5和6。本發明的方法能應用本領域已知的任何誘變劑(使用本領域同樣已知的方法)，包括，但不限於紫外光、X-射線輻射、Y輻射或快中子突變、N-乙基-N-亞硝基脲(ENU)、甲基亞硝基脲(MNU)、甲苄胼(PRC)、三乙撐蜜胺(TEM)、丙烯醯胺單體(AA)、苯丁酸氮芥(CHL)、美法侖(MLP)、環磷醯胺(CPP)、二乙基磺酸(DES)、乙基甲磺酸(EMS)、甲基甲磺酸0MS)、6_巰基嘌呤(6-MP)、絲裂黴素C(MMC)、N-甲基-N，-亞硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、3H2O和尿烷(UR)。接觸一種或多種誘變劑的基因修飾率可以通過改變處理劑量和/或重複次數而調節，並且能為具體應用定製。在一個實施方式中，處理劑量和方案基本不誘導對於一個或多個細胞的細胞毒性。SALl或其同源物中的突變，可以檢測，然後(在後面幾代中)通過使用本領域公知的技術，用已知的SALlDNA序列，和根據編碼SALl或其同源物的基因或核苷酸序列的合適探針或引物檢測。如果突變在SALl以外的基因中，在植物傳代中跟蹤/追蹤之前需要鑑別、定位和/或識別突變。用於鑑別、定位和識別未知突變的合適方法對於本領域人員已知，並且在很多公知的標準文本中描述，比如Sambrook，J.等，MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratory(1989),Sambrook,J.和Russell，D.W.(2001),"MolecularCloning:ALaboratoryManual，，，3rdedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,和本文弓|用的文獻，禾口Ausubel等(eds)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons(2000)。還參見Rossel，J.B.，Cuttriss,Α.禾口Pogson,BlJ."IdentifyingPhotoprotectionMutantsinArabidopsisthaliana"inMethodsinMolecularBiology274287-299(Carpentier,R.Ed,HumanaPress)。鑑別突變等位基因的更新的方法包括「Tilling」和高分辨熔融(HRM)。ILLING(基因組中的靶向誘導局部損傷)是分子生物學中的方法，允許特定基因中突變的定向鑑別。方法將標準技術(例如，用化學誘變劑如乙基甲磺酸(EMS)誘變)與可以鑑別靶基因中單鹼基突變(也稱作點突變)的敏感的DNA篩選技術相結合。第一篇描述擬南芥中TILLING的論文(McCallumCM,ComaiL,GreeneEA,HenikoffS,"Targetedscreeningforinducedmutations，，，NatBiotechnol.(2000)Apr；18(4):455_7,通過交叉引用併入本文)使用dHPLCHPLC鑑別突變。所述方法通過使用限制性酶Cel-I結合基於凝膠的系統鑑別突變而獲得更高的通量(ColbertΤ,TillBJ,TompaR，ReynoldsS，SteineMN,YeungAT,McCallumCM,ComaiL,HenikoffS,"High-throughputscreeningforinducedpointmutations，，，PlantPhysiol.(2001)Jun；126(2):480_4，也通過交叉引用併入本文)。其它突變檢測，比如重測序DNA，已經與TILLING結合。已經使用TILLING作為其它生物體如斑馬魚、玉米、小麥、稻米、大豆、馬鈴薯和萵筍中的反向基因方法。還參見McCallumCM，ComaiL，GreeneEA,HenikoffS.「Targetinginducedlocallesionsingenomes(TILLING)forplantfunctionalgenomics，，PlantPhysiol.(2000)Jun；123(2)439-42；ColbertT，TillBJ，TompaRiReynoldsSiSteineMN，YeungATjMcCallumCM，ComaiL，HenikoffS.High-throughputscreeningforinducedpointmutations」，PlantPhysiol.(2001)Jun；126(2)480-4；DraperBff,McCalIumCM,StoutJL,SladeAJ,MoensCB,"Ahigh-throughputmethodforidentifyingN-ethyl-N-nitrosourea(ENU)-inducedpointmutationsinzebrafish，，，MethodaCellBiol.(2004)；77:91_112；禾口SladeAJ,FuerstenbergSi,LoefflerD,SteineMN,FacciottiD,"Areversegenetic,nontransgenicapproachtowheatcropimprovementbyTILLING，，，NatBiotechnol.(2005)Jan；23(1):75_81，也通過交叉引用併入本文。HRM(高分辨熔融)是近來的進展，其能通過利用高分辨熔融設備最近的進展和雙鏈特異性DNA(dsDNA)結合染料的進展的優勢，極大地擴展傳統DNA熔融分析的用途，其中所述染料能以足夠高的濃度使用，使PCR過程中產生的所有雙鏈位點飽和(參見http//www,corbettlifescience.com/control,cfm？page=Introduction4&bhcp=1)，以及DufresneSD，BelloniDR，WellsWA,TsongalisGJ,"BRCAlandBRCA2MutationScreeningusingSmartCyclerIIhigh-resolutionmeltcurveanalysis」，ArchPatholLabMed(2006)130185-187；GrahamR，LiewM,MeadowsC,LyonE,WittwerCT，"DistinguishingdifferentDNAheterozygotesbyhighresolutionmelting，，，ClinicalChemistry(2005)511295-1298；HermannMG,DurtschlJD,BromleyK，WittwerCT,VoelkerdingKV,"AmpIiconDNAmeltinganalysisformutationscanningandgenotypingcross-platformcomparisonofinstrumentsanddyes，，，ClinicalChemistry(2006)52494-503；LiewM，PryorR，PalaisR,MeadowsC，EraliM，LyonE，WittwerC，「Genotypingofsinglenucleotidepolymorphisms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默技術可以通過過量產生正義和/或反義序列(可以是全長或部分)而增強，從而產生大量dsRNA。可以使用本領域技術人員已知的標準植物轉化方法產生具有上述轉基因之一的轉基因植物，例如，農桿菌介導的轉化、原生質體的陽離子或聚乙二醇處理、電穿孔、微粒轟擊、用包被轉化DNA的微球或微粒攪拌溶液中的細胞懸浮液、直接DNA攝入、脂質體介導的DNA攝入等，如很多公開文本中所述，比如「MethodSforPlantMolecularBiology，，(ffeissbach&Weissbach,eds.,1988)；Clough,S.J.禾口Bent,A.F.(1998)"Floradip-.asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana"PlantJ.16,735-743；"MethodsinPlantMolecularBiology，，(Schuler&Zielinski,eds.,1989)；"PlantMolecularBiologyManual，，(Gelvin,Schilperoort,Verma,eds.,1993)；和」MethodsinPlantMolecularBiology-ΑLaboratoryManual，，(Maliga,Klessig,Cashmore,Gruissem&Varuer,eds.，1994)。還參見Sambrook,J.等，MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratory(1989),SambrookJ.禾口Russell，D.W.(2001)，"MolecularCloning:ALaboratoryManual，，,3rdedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,禾口其中弓|用的文獻禾口Ausubel等(eds)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&SonS(2000)，這些文獻通過交叉弓I用併入本文。轉化的優選方法依賴於待轉化的植物。經常使用農桿菌載體轉化雙子葉物種。對於單子葉物種的轉化，經常使用基因槍轟炸包被轉化DNA的顆粒和包被轉化DNA的矽纖維，用於核轉化。然而，現在已知農桿菌介導轉化單子葉植物包括小麥的方法(參見，例如，國際專利公開WO97/48814；還參見Hiei，Y等(1994),PlantJ.6(2):271_282和國際專利公開WO92/06205)。用於轉化選擇的植物的DNA構建體可以包含與合適的5』調節序列(例如，啟動子和翻譯調節序列)和3』調節序列(例如，終止子)可操作連接的目的編碼序列。在優選的實施方式中，編碼域位於有效的組成型啟動子之下，比如花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子或玄參花葉病毒35S啟動子。期望用於本發明的其它組成型啟動子包括，但不限於T-DNA甘露氨酸合成酶、胭脂氨酸合成酶(NOS)和章魚鹼合成酶(OCS)啟動子。在本發明的範圍中也期望在誘導型啟動子下表達正義或反義SALl-編碼序列的轉基因植物。本發明特別期望脅迫誘導型啟動子，比如高光、乾旱、鹽度或溫度誘導型啟動子。根據本發明可以使用的啟動子包括，例如，用於在光合作用組織中表達的二磷酸核酮糖羧化酶(RuBisCo)小亞基基因啟動子或葉綠素a/b結合蛋白質(CAB)基因啟動子；用於在種子中表達的各種種子儲存蛋白質基因啟動子；或者用於在轉化植物的根系統中表達的根_特異性穀氨醯胺合成酶基因啟動子。編碼域還與合適的3』調節序列可操作地連接。例如，可以使用胭脂氨酸合成酶(NOS)多腺苷化域或章魚鹼合成酶(OCS)多腺苷化域。使用農桿菌二元載體系統進行轉化，在如上所述的組成型或誘導型啟動子調控下的選擇的編碼域，可以與核藥物抗性標記連接，比如卡那黴素抗性。其它選擇性標記系統包括，但不限於攜帶抗生素抗性(例如，對潮黴素或雙丙氨磷抗性)或殺蟲劑抗性(例如，對磺醯脲、草丁膦或草甘膦的抗性)的其它基因。可以使用本發明的方法轉化任何植物細胞。用這種方式，可以獲得基因修飾的植物、植物細胞、植物組織、種子等。根據一個實施方式，待轉化的植物細胞可以選自經濟和/或農業經濟上重要的植物家族，包括傘形科(Apiaceae)、紫菀科(Asteraceae)、十字花科(Brassicaceae)、薬禾鬥(Chenopodiaceae)/覽禾鬥(Amaranthaceae)、菊禾鬥(Compositae)、葫聲禾鬥(Cucurbitaceae)、蝶形花禾鬥(Fabaceae)、禾本禾鬥(Gramineae)、豆禾鬥(Leguminosae)、早熟禾禾鬥(Poaceae)、薔薇禾鬥(Rosaceae)或爺禾鬥(Solanaceae)0已經轉化的細胞可以按照本領域已知的常規方法在植物中生長(參見，例如，McCormick,S.等(1986)，PlantCellReports5:81-84)。得到的植物可以使自花授粉，用同樣的轉化株或不同轉化株或混合株授粉，並且鑑別與SALl或其同源物有關的活性降低或失活的植物。可以生長兩代或多代，確保這種基因型特性能穩定保持。或者，在生長繁殖的作物中，通過剪切或通過組織培養技術產生相同的植物，可以繁殖成熟突變體/轉基因植物。可以進行突變體/轉基因植物的選擇，並且可以獲得並繁殖新品種用於商業用途。可以根據缺少SALl蛋白質或其同源物或其活性，或通過增加脅迫(比如乾旱)抗性，使用特異性寡核苷酸探針和/或靶基因的擴增，篩選通過本發明的方法轉化/突變的植物。根據本發明的實施方式，得到的植物相對於野生型植物，對乾旱、溫度脅迫、光脅迫或任何其它非生物或生物脅迫，或它們的任何組合的抗性提高。根據本發明的具體實施方式，得到的植物至少相對於野生型植物的抗旱性提高。在本研究的過程中，還發現影響植物中SALl活性的突變可以以特有的方式影響開花時間，以及葉形，並且與野生型相比，顯著影響突變植物的代謝。具體地，研究的所有SALl突變體中的開花時間都顯著延遲，研究的植物延遲約4-5周(從而使開花時間延遲約100%)。依賴於引起開花時間延遲的突變或內源核酸，和突變或外源性核酸導入的植物，可以期望開花時間延遲不同時間，例如開花時間可以延遲從約7天至約100天，比如約14天至約80天，約21天至約60天，約25天至約50天，約30天至約40天，約10天，約20天，約25天，約30天，約35天，約40天，約45天，約50天，約60他，約80天或約100天。SALl活性改變，其包括但不限於過表達，也可以以近似的時間推遲開花時間。葉形也受到顯著影響，導致葉片厚度比野生型植物厚，並且還更短、更圓，淺裂葉緣更多。觀察到的葉片表面有起伏，並且葉柄長度減小，使葉蓮座變成捲心菜樣外觀。葉片表明的起伏增加能增加邊界層效應，減少蒸發。代謝組學分析表明，兩種突變體都表現出相似的明顯代謝重建，包括暗示脅迫抗性的多胺、腐胺的水平增加，和很多未知的可能的滲透保護劑糖衍生物的積累。還提供由本發明的方法獲得的植物部位，包括但不限於獲得自植物的葉、莖、根、塊莖、花、果實和種子。檢測SALl或其同源物中突變的方法篩選存在編碼SALl或其同源序列至少一個突變等位基因的植物，可以包含使用至少一個適合作為探針或引物的核酸分子分析植物的DNA，所述探針或引物能與SALl基因或其同源物在嚴緊條件下雜交。在更具體的方法中，篩選方法可以包括使用至少一個適合擴增SALl基因或其同源物的寡核苷酸引物對，其中包含正向引物和反向引物，檢測在所述區域中是否存在突變。區域可以包括完整的SALl基因或其同源物，或者可以僅包括其中部分，比如，例如(並參照圖10)，包含下述的核苷酸區域外顯子3，外顯子3和4之間的內含子，外顯子5，外顯子5和6之間的內含子，外顯子6，和外顯子6和7之間的內含子，或它們的任何組合。來自待評價客體的DNA可以通過本領域技術人員已知的很多合適的方法提取，比如很多公知文本所述，包括(但不限於)Sambrook，J.等，MolecularCloning，ColdSpringHarborLaboratory(1989),Sambrook,J.禾口Russell，D.W.(2001)，"MolecularCloningALaboratoryManual，，,3rdedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,禾口其中弓|用的文獻，禾口Ausubel等(eds)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons(2000)，其通過交叉引用併入本文。還參見Lukowitz，W.，Gillmor，C.S.和Scheble，ff-R.(2000)"PositionalCloninginArabidopsis:ffhyItFeelsGoodtoHaveaGenomeInitiativefforkingforYou"PlantPhyiology123，795-805中所述方法，和其中引用的文獻。一旦已分離合適的DNA，可以通過本領域已知的任何合適方法分析是否存在突變，並且使用何種方法/策略依賴於期望的特異性，和是否可用合適的序列和/或酶進行限制性片段長度多態性(RFLP)分析。合適的方法可以涉及在突變特異性探針和至少部分SALl基因或其同源物之間標記的雜交產物，或者更通常地，通過使用引物和合適的探針，或使用用於SALl基因或其同源物的特異性部分擴增的一對引物(正向和反向引物)擴增至少部分SALl基因或其同源物，然後進行擴增DNA的直接部分和/或完全測序，或其RFLP分析。用於擴增SALl基因的部分的合適引物對提供於表1中(還參見圖10)-可以根據SEQIDNO:1設計其它合適的引物或引物對用於分析SALl基因或其同源物，所述序列以At5g63980(TAIR序列4010730406，登錄號NM_125794.4)或其同源物(參見，例如，圖6B)提供。用於PCR擴增反應中的方法和試劑為本領域技術人員所公知。合適的規程和試劑在很大程度上依賴於個體環境。可以從多種來源獲得指南，比如例如Sambrook，J.等，MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratory(1989),Sambrook,J.禾口Russell，D.W.(2001),"MolecularCloning:ALaboratoryManual3rdedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,禾口其中弓|用的文獻，禾口Ausubel等(eds)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons(2000)，其通過交叉引用併入本文。本領域的技術人員將容易理解的是，可以改變PCR反應的各種參數而不影響擴增期望產物的能力。例如Mg2+濃度和使用的溫度可以改變。類似地，用作模板的基因組DNA的量還可以依賴於提供的DNA的量而改變。分析擴增的DNA以確定是否存在突變的其它方法為本領域中技術人員所公知。例如，在用合適的限制性酶消化擴增的DNA以檢測SALl基因或其同源物中的突變後，可以通過多種合適的方法包括電泳分析DNA。特別是瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠電泳，這是本領域的技術人員常用的技術，用來根據大小分離DNA片段。凝膠中瓊脂糖或聚丙烯醯胺的濃度在很大程度上決定了凝膠的解析能力，並且因此瓊脂糖或聚丙烯醯胺的合適的濃度將依賴於待識別的DNA片段的大小。SALl基因或其同源物中突變存在的檢測和/或確定可以使用任何合適的軟體由計算機分析輔助進行。合適的用於比較已確定核苷酸序列的軟體包在本領域中公知，並且容易獲得。現在描述本發明的優選形式，僅通過實施例的方式，參照下述實施例，包括可比數據，並且其不應視為以任何方式對本發明的範圍或精神的限制。實施例實施例I-材料與方法植物和生長條件用甲磺酸乙酯(EMS)誘變已經用APX2啟動子-螢光素酶報告子基因(APX2=LUC)構建體轉化的擬南芥種子(Karpinski,S.等(1999)，Science284:654_657)，並且從源自500M1親本的植物池中篩選M2植物(參見Ball，L.等(2004)，PlantCell16:2448-2462)。如Rossel，J.B.等(2004),MethodsinMolecularBiology274:287_300所述，使用發光計數器為96孔微孔板中每株幼苗發射的光子計數，進行突變體篩選。為了確認改變的APX2表達的重複性，使用冷卻CCD照相機(ModelDV435，AndorTechnology，Tokyo，Japan)，將包含APX2=LUC的四周齡擬南芥植物成像。在成像前，用包含幾滴Tween80的ImMD-螢光素(BI0SYNTH,Staad,Switzerland)溶液噴灑植物，並保持生長光條件5分鐘。使用Image-Pro軟體(MediaCybernetics；Carlsbad,CA,USA)分析用CCD照相機獲得的圖像。鑑別了幾株APX2:LUC表達改變的突變體，包括突變體alx8，其中APX2:LUC表達增加，並且還表現出抗旱性提高，以及葉形改變。對於fryl-Ι無效突變的種子保存液，由擬南芥生物資源中心(Columbus，Ohio)獲得salk020882插入突變體和野生型(WT)哥倫比亞植物。此處的WT所有參照請參照哥倫比亞生態型；salkl和salk2指來自salk_020882家系種子保存液的T3代的兩株相同植物。fryl-Ι突變是在C24野生型背景中發生的，並且是第三次逆代雜交。對於在土壤中的生長，在早期實驗中，將一些擬南芥種子灑在盆(4CmX4CmX6Cm)中的無菌土壤(1份蛭石對4份土壤)上，並且在後期實驗中，植物在metromix土壤(35%加拿大泥煤苔，19%珍珠巖500，40%蛭石，1.5gL—1石灰)上生長。在4°C，黑暗中保持72至96小時，人工促進種子開花結果。然後將幼苗轉移至生長室，在約21+/-2，以100-160微摩爾光子HT2s-1進行12小時光照/12小時黑暗的循環。選擇光照較短的循環以促進生長。為了促進開花，在同樣的條件下生長植物，但是用16小時光照。使用保鮮膜保持環境溼度，直至幼苗生成。使幼苗稀疏至每盆一株，定位群體除外，其每盆兩株生長。用0.5X荷格蘭特(Hoaglands)培養基每十四個晚上為植物殺菌一次(Hoaglands和Arnon，1950)。還將底盤從邊緣旋轉至光源的中心，保持所有植物都具有相似的生長條件。而且，在可能時，將進行相同實驗的植物緊挨著在相同的底盤中生長，使它們經歷相同的生長條件。對於在組織培養基上發芽的種子，在層流中完成表面殺菌。將種子置於1.5mLEppendorf管中，並用ImL70%乙醇洗滌3分鐘。將種子在臺式離心機(14，OOOrpm)中旋轉30秒，並去除乙醇。在ImL漂白溶液(3%次氯酸鈉，75%壓0+1滴1^擾11-20清潔劑)中重新懸浮並洗滌種子5分鐘。如前旋轉種子。進行5個洗滌和離心步驟，每次洗滌使用ImL無菌水，每次旋轉後棄去水。在塗布在Murashige和Skoog(MS)(GibcoBRL,USA)植物應用瓊脂上之前將種子重新懸浮於無菌水中。MS瓊脂由下述組成4.3g/LMS鹽、20g/L蔗糖、lmL/L維生素、7g/L植物凝膠，用KOH將pH調至5.8，溶於Mi11iQ處理後的水中。當需要進行篩選時，瓊脂中包含抗生素30-50μg/mL卡那黴素(MPBiomedical，Solon，0H，USA)，或30yg/mL潮黴素(GibcoBRL)。用鋁箔包被平板，並將平板置於4°C72小時以促進開花，然後放置在21°C的生長櫃中，24小時光照，100微摩爾光子HT2iT1,或者在與土壤中植物相同的條件下生長。脅迫條件對於乾旱脅迫實驗，在正常條件下放置底盤，並在底盤上隨機分布生物副本，每兩天輪換一次，以控制光密度、溫度和空氣接觸的差異。在處理前一天和t=O天澆灌植物，將過量的水倒出底盤，表明植物在乾旱實驗開始時相對土壤水含量為100%。每天為每個盆稱重，如下計算得到相對水損失％formulaseeoriginaldocumentpage22對於低溫脅迫，土壤中生長的植物接觸24小時低溫脅迫(4°C)，使用1微摩爾光子mY1的光照。對於鹽脅迫，土壤中生長的植物從下用NaCl溶液澆灌，每兩天澆灌一次。培養基上生長的植物的脅迫處理在塗布在包含適當濃度的蔗糖、甘露醇、LiCl,NaCl或甲基紫羅鹼的培養基上之前，如常將種子殺菌。然後如常人工促進平板發育和生長。觀察對於發芽和幼苗生長的影響。DNA操作擬南芥DNA提取DNA粗提向小量植物組織中加入40μL0.25ΜNaOH。使用黃色P20槍尖研磨樣品，直至色素溶入溶液。加熱樣品至100°C30秒鐘，然後加入20μL0.5MTriS-HCl、ρΗ8和0.25%TritonX-100。通過倒置混合樣品，然後加熱至100°C2分鐘。DNA的提取方法本提取方法改編自Weigel禾口Glazebrook,Arabidopsis:alaboratorymanual,(ColdSpringHarborPress,2002)0使用油漆攪拌器和兩個玻璃珠，在2mL管中震蕩組織和提取緩衝液(220mMTris-HClpH7.5,250mMNaCl，25mMEDTA，0.5%SDS)。如此研磨並裂解組織。然後在微型離心機中用最大速度離心5分鐘，並將300μ1上清液轉移至1.5mLEppendorf管中。加入300μ1異丙醇沉澱DNA，然後通過以最大速度(Eppendorf離心機)離心5分鐘而使DNA成球。棄去上清液，並用70%乙醇洗滌DNA球。然後將DNA溶於100μ1TEdOmMTris-HClpH8.0、ImMEDTA)中。DNA的CTAB提取從每株植物富集少量植物組織，所述組織為葉或花。向每個樣品加入300μ1CTAB緩衝液(2%(w/v)溴化十六烷基三甲胺(CTAB)U.4MNaClUOOmMTrisHClpH8.0、20mMEDTA)，伴隨使用1/8」滾珠。然後在TissueLyser(Qiagen，Hilden，Germany)以30/秒的頻率裂解樣品2分鐘。然後在65°C培育樣品，時間在30分鐘和幾小時之間。使樣品冷卻，然後加入300μ1氯仿並劇烈漩渦震蕩。在14，OOOrpm旋轉樣品1分鐘，並將上面的水層轉移至新的Eppendorf管中。向每個樣品加入300μ1異丙醇，並通過倒置幾次而混合。以14，OOOrpm將樣品旋轉5分鐘，以成球。倒去上清液，並用500μ170%乙醇洗滌小球。將樣品風乾，然後溶於100μ1TE緩衝液(IOmMTrisHClρΗ8.0,ImMEDTA)中。針對96孔模式的適應如下改編CTAB提取方法，用於96孔板使用板底座(Qiagen，Hilden，Germany)通過臺式4-15°C離心機離心沉澱的DNA，並使用多通道多次分配移液器。PCR擴增和凝膠電泳引物設計除了參照論文之外，可以佳用在TAIR網站(www,arabidopsis.org)上公開的序列禾口Primer3禾呈序(www,frodo.wi.mit.edu/cRi-bin/primer3/primer3www,cri)設計弓I物。使用下述條件設計引物50mM鹽濃度；GC含量約50%;最大自互補為8；並且最大3』自互補為3。通常，引物的Tm為55-60°C，並且長約20bp。在NCBI網站(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)上通過使用BLASTn的「短，接近完全匹配」測試引物結合併擴增其它產物的可能性。用於擴增和測序的引物的實例(正向-F-和反向-R)提供於表1中，並且圖10中提供了對SALl基因的大規模描述，其中表示了內含子、外顯子、引物雜交位置，以及fryl-3和salk_020882T-DNA插入、fryl-1、fry1-2和alx8突變的位置。表1-用於部分SALl基因擴增的引物tableseeoriginaldocumentpage23tableseeoriginaldocumentpage24對於SSLP繪製，如MonsantoSNP和LerCollections在TAIR網站上公布的，圍繞InDels設計引物。在TAIR多態性資料庫中還發現了一些多態性。設計引物以產生200-300bp的產物，Tm為57°C。所述區域的序列取自合適的BAC。對於SNP，使用在線程序dCAPSFinder2.0(www,helix,wustl.edu/dcaps/dcaps.html:Neff等，2002)、合適的BAC序列和Primer3設計dCAPS引物。對於alx8突變體特異性的dCAPS引物(其在alx8突變體產物中產生限制性位點，但在野生型中則沒有，並且其通過XbaI限制性酶表徵)如下F5，-GAGGAAGGGAAAGTAGTTCTAG-3，(SEQIDNO21)；R:5，-TGCACTTTTACAGGAGAAGA-3，(SEQIDNO22)。然後在NraCutterV2.0(www,tools,neb.com/NEBcutter2/index.php；Vinzce等，2003)中模擬測試消化結果。對於重組載體構建，如上設計引物，但是向引物的5』末端加入合適的間隔段和重組位點。弓I—自Proligo(Lismore,Australia)Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)。標準的PCR條件使用標準PCR條件進行構建體的繪製、確認和聚集群落的篩選。所有PCR反應在PeltierThermalCycler(MJResearch,BI0RAD,ffaltham,MA,USA)或Palm-Cycler(CorbettResearch,Sydney,Australia)中進行。在陽性克隆的PCR不產生任何產物或多個產物時，優化擴增條件。在Palm-Cycler上運行有12個不同溫度的溫度梯度，MgCl2含量從1-2.5mM不等，並且測試了不同Taq聚合酶的優先性。反應液通常包含下述成分0.2mMdNTPUXTaq緩衝液(酌情)、0.5μM每條引物、2mMMgCl2(FisherBiotech,WA,Australia)、1-2μ1樣品DNA和0.25UTaq(酌情)。典型的循環條件為94°C2分鐘；940C30秒鐘，Tm-2°C30秒鐘和72°C30秒鐘的40個循環；72°C2分鐘。高保真PCR條件對於測序和構建體產生，需要非常精確和/或長的PCR產物。在這些情況下，根據生產商的說明，使用校對聚合酶。這些酶是PfuDNA聚合酶(Promega，Madison，WI)，PlatinumPfxTaq聚合酶(Invitrogen，Carlsbad,CA)和Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzyme,Espoo,Finland)。電泳對於核酸分離和定量，用精確分子量標準梯度(BioRad，USA)和IkbDNA梯度(Promega,USA)，在瓊脂糖凝膠上跑樣。還使用了用HindIII和EcoRI消化的自製λDNA梯度。對於標準PCR，電泳在0.5-2%(w/v)瓊脂糖凝膠(FisherBiotech,WA,Australia)中進行，凝膠中包括0.5ng/mL溴化乙啶(Biorad)用於成像。當需要高解析度時，比如dCAPS分離，用瓊脂糖-1000(GibcoBRL，Invitrogen，Rockville，MD，USA)製成3-4%(w/v)凝膠。用IXTBE緩衝液(89mMTris鹼、89mM硼酸、2mMEDTA,pH8.0)或IXTAE緩衝液(40mMTris-乙酸、20mMNa2EDTA,pH8.5)制膠並跑樣。在傳統的電泳設備或超級120高效凝膠系統(6mgel,Biokeystone,EIMonte,CA,USA)中跑膠。對於質粒消化物的分離，將0.7-1.0%凝膠在4°CIOOV跑樣6小時。在上樣前向PCR產物加入上樣緩衝液(70%甘油、30%H20、溴酚藍)。通過UV光源使凝膠成像。DNA片段的純化和凝膠提取在用於連接或測序前，從瓊脂糖凝膠或PCR混合物中純化DNA片段。這個過程可去除引物、核苷酸、酶、礦物油、鹽、瓊脂糖、溴化乙啶和其它雜質。對於70-i0kp的小片段，按照生產商的說明使用Wizardsv凝膠和PCRClean-Up系統或QIAquick凝膠提取試劑盒或PCRClean-Up試劑盒(Qiagen)。總而言之，從凝膠上切下合適的條帶，並將其溶於包含異硫氰酸胍的緩衝液中。然後使溶解的凝膠或PCR產物在存在高離液鹽的情況下通過包含矽膜的柱。然後洗滌結合DNA的膜，之後將DNA洗脫在無菌dH20中。對於IOObp-IOkbp的DNA片段的凝膠提取，也按照生產商的說明使用Ultrafree-DA離心過濾單元(Millipore)。這個試劑盒與凝膠噴霧器不同，使用凝膠壓縮來從瓊脂糖提取DNA。然後通過加入1/10體積的3M乙酸鈉，加入2.5體積的100%乙醇並在-20°C沉澱DNA3小時而純化DNA。通過在臺式離心機中以最大速度離心15分鐘而使DNA成球。用70%乙醇洗滌小球。然後將DNA溶於無菌dH20中。使用QIAEXII試劑盒進行已知大於IOkb的條帶的凝膠提取，並且按照生產商的說明使用。這個試劑盒使用矽珠結合DNA，而不是使用矽膜，當較大的DNA片段通過膜時可防止片段發生剪切。MMiSfflnanodrop^jfeT^iSif(GenomicSolutions,Melbourne,Australia)產量定量。定位克隆和互補從alx8(Col-0背景)和野生型Landsbergerecta之間雜交的F2群落提取基因組DNA。使用F2的葉片表型，或野生型F2的後代，確定它們在alx8突變位點的表型。使用由Lukowitz等(Lukowitz,W.，C.S.Gillmor,等(2000)，「PositionalcloninginArabidopsis.Whyitfeelsgoodtohaveagenomeinitiativeworkingforyou，，,PlantPhysiology123(3):795_805)。在Cereon資料庫(www,arabidopsis.org)中發現的SSLP和SNP附近設計標記。在dCAPSFinder2.O(http//helix,wustl.edu/dcaps/dcaps.html；Neff等，2002)的幫助下設計dCAPS引物。使用標準方法進行PCR、消化和凝膠電泳。載體操作限制性消化所有酶都來自Promega，並且按照生產商的說明使用，只做了一些修正。為了精細的繪製而使用dCAPS標誌進行限制性消化。在這個情況下，用1單位合適的酶在37°C將10μ1消化一小時到過夜。質粒如BACS的限制性消化，在1μgDNA和5單位酶上進行。通過在65°C加熱15分鐘或在_20°C冷凍而停止消化。去磷酸化按照生產商的說明，使用小牛腸鹼性磷酸酶(CIAP；Promega)將消化的片段去磷酸化。反應重複兩次，然後使用提供的終止緩衝液停止。然後通過苯酚氯仿異戊醇(25241)提取液和乙酸鈉和100%乙醇沉澱而淨化溶液。在70%乙醇中洗滌小球，然後風乾，並重新懸浮於無菌水中。載體連接按照生產商的說明，使用T4連接酶連接製備的插入片段和質粒。主要使用插入片段載體DNA為31的比例，其優於11或13比例，並且在4°C過夜進行連接。載體重組對於需要重組的載體，使用高保真條件和包含attB重組序列的引物擴增插入片段。按照生產商的說明，使用Gateway系統(Invitrogen)進行重組反應。總而言之，使用10μ1反應液中的2μ1BP克隆酶，將50fmol合適的插入片段與50fmol載體pDONR/Zeo(Invitrogen)重組，所述載體包含相應的attP重組序列。這可以參照BP反應，並產生attL重組序列。反應在25°C過夜，然後通過與1-2μg蛋白酶K在37°C孵育10分鐘而停止。在轉化進感受態大腸桿菌並在篩選條件系孵育後，純化質粒並確認插入片段。然後在LR反應中使分離的質粒與目的載體重組。目的載體，比如pHellsGate8(pHG8；由PeterWaterhouse和ChrisHelliwell,PI,CSIRO捐贈)，包含attR重組序列。然後將這些與包含插入片段的供體質粒中的attL位點重組，再次得到SttB序列。LR反應與BP反應相同，但是需要LR克隆酶。再次將相同摩爾數的pDONR-插入片段和pHG8過夜重組，得到pHG8_插入片段。然後使用這個質粒轉化大腸桿菌，在篩選條件下擴增，分離並確認。感受態大腸桿菌為了產生感受態大腸桿菌，用5μ1DH5a細胞接種5mLLB，並在37°C以適度的震蕩(200rpm)過夜培養。然後使用這個起始培養物接種200mLLB，其於37°C以適度震蕩培養3-4小時，直至培養物的0D600為0.6。然後在冰上孵育培養物30分鐘，之後以約3，OOOg在4°C離心20分鐘使其成球。將小球重新懸浮於200mL冰冷的水中，然後再次以相同的條件成球。這個循環再重複兩次，其中最後一次重新懸浮於20mL冰冷的10%甘油中。再次在4°C將細胞成球，但是為2，OOOg10分鐘，並且重新懸浮於ImL冰冷的10%甘油中。然後將這個重新懸浮液稀釋於50μL等分試樣中，其在液氮中急速冷凍，並保存於-80°C。大腸桿菌轉化對於較難的轉化，使用商業感受態細胞，OneShotOmniMAXTM-TlR化學感受態大腸桿菌(Invitrogen)。將100μ1細胞在冰上解凍，並加入IOOng連接混合物。然後將細胞置於冰上30分鐘，之後在42°C熱擊30秒鐘。然後將細胞放回冰上2分鐘，之後加入提供的250μ1SOC培養基。然後在37°C震蕩回收細胞1-2小時。對於大多數轉化，使用自製的感受態細胞。將100μL感受態細胞在冰上解凍，並加入IOOng質粒DNA，用移液器槍尖混合。然後在液氮中將細胞急凍，之後在37°C水浴中培育五分鐘。然後向細胞中加入ImLLB，並在37°C震蕩培養1-2分鐘。然後將兩個不同體積的細胞塗布在合適的選擇性培養基上並在37°C過夜培養。細菌生長和甘油儲備(glycerolstock)所有細菌液體培養物都在Luria-Bertani(LB)培養基中生長，所述培養基由下述組成10g/L細菌用胰蛋白腖(BactoLaboratories，Australia)，5g/L酵母提取物(BactoLaboratories)和5g/LNaCl的MilliQ處理的水溶液。如果需要LB瓊脂，向肉湯中加入15g/L瓊脂(LenerDavisGelatin，Australia)。所有培養基在使用前通過高壓而滅菌。以下述濃度使用抗生素100μg/mL壯觀黴素(Sigma)，100μg/mL氨苄青黴素(Sigma)和150μg/mL利福平(Sigma)，30-50μg/mL卡那黴素(MPBiomedical,Solon,OH,USA),50g/mL§iMM(zeomycin)(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。)(寸f黴素篩選，使用低鹽LB:10g/L細菌用胰蛋白腖(BactoLaboratories，Australia)，5g/L酵母提取物(BactoLaboratories)和5g/LNaCl的MilliQ處理的水溶液。對於藍-白篩選，平板還包含0.5mMIPTG(異丙基-b-硫代半乳糖苷；FisherBiotech)和80μg/mLX-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷；ProgenBioscience,QLD,Australia)。大腸桿菌的液體培養物在37°C震蕩過夜培養，大腸桿菌的平板在37°C過夜培養，農桿菌的平板在28°C培養幾天，並且農桿菌的液體培養物在28°C震蕩培養16-20小時。細菌培養物的甘油儲備通過將700μL的培養物與700μL甘油溶液(65%甘油ν/v、0.IMMgS04、0.025MTris-Cl,ρΗ8)相混合而得到。隨後將儲備保存在-800C0菌落PCR進行菌落PCR，篩選存在質粒和插入片段的菌落。PCR條件與平常一樣，但是每個反應的體積為20μ1，並且使用移液器槍尖將少量細胞從菌落轉移至PCR。質粒分離對於大多數應用，使用GeneEluteTM質粒小提試劑盒(Sigma)從3_5mL液體培養物分離質粒，所述培養物來自單菌落或甘油儲備的過夜生長。總而言之，使細胞成球並使用修正的鹼-SDS裂解方法裂解。然後在存在高鹽的情況下將質粒DNA吸附至矽膜上。然後洗滌膜，之後用無菌dH20洗脫質粒DNA。對於需要大量質粒的應用，比如BACDNA的製備，使用大規模鹼裂解規程。這個操作規程基於獲得自NIH細胞和分子調控實驗室(Bethesda，MA,USA)的規程。將包含篩選物的500mL培養物在37°C和200rpm過夜生長。然後在4°C6000g離心15分鐘使250mL細胞成球，棄去上清液，將瓶置於冰上。然後將細胞懸浮於20mL室溫的IOmMEDTA，pH8.0中，並置於室溫5分鐘。然後加入40mL裂解溶液(0.2MNaOH,1%SDS)，並將瓶置於室溫5分鐘。然後加入30mL冰冷的中和溶液(11.5%(體積比)乙酸，1.9M乙酸鉀)，，並將瓶置於冰上15分鐘。然後在4°C30，OOOg離心20分鐘使細胞碎片成球。將上清液移至新瓶並重複上述過程。然後通過加入45mL異丙醇使DNA從上清液沉澱出來，並在6，500g離心15分鐘使其成球。然後將小球溶於9mLIOmMtris/50mMEDTA中並加入4.5mL7.5M乙酸鉀。然後在_70°C冷凍溶液30分鐘，解凍並在4，OOOg離心10分鐘。然後通過加入27mL100%乙醇而沉澱DNA，並在4，OOOg離心10分鐘而使DNA成球。然後將小球溶於700μL50mMTris/50mMEDTA，pH8.0中，並加入10μL的lOng/μLRNAse。然後在37°C培育樣品1小時，使RNA分解。然後通過加入700μ1苯酚氯仿異戊醇(25241)，混合併在微型離心機中以14，OOOrpm離心5分鐘而淨化樣品。然後再次在700μ1氯仿異戊醇中淨化頂層。然後通過加入700μ1異丙醇而將DNA從頂層沉澱出來，並通過在14，OOOrpm離心20分鐘而使DNA成球。去除上清液並用500μ70%乙醇洗滌小球，並在14，OOOrpm旋轉10分鐘。再次去除上清液，並風乾小球，然後重新懸浮於100μ1無菌H2O中。消化物判斷為了確認質粒和是否存在插入片段，過夜消化分離的質粒並在瓊脂糖凝膠上跑樣。使用NEBEutterV2.0(www,tools,neb.com/NEBcutter2/index,php；NewEnglandBiolabs)鑑別條帶的期望模式。感受態農桿菌由在28°C過夜生長的500mL培養物產生感受態根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)。然後將250mL培養物在冰上冷藏，並在4°C以3，OOOg離心5分鐘而成球。將小球重新懸浮於ImL冰冷的20mMCaCl2中，並分成0.ImL等分試樣，然後在液氮中冷凍並於-80°C保存。農桿菌轉化用分離的質粒轉化自製的感受態根癌農桿菌細胞。將100μ1感受態細胞在冰上解凍，並加入Iyg質粒。然後在37°C熱擊細胞5分鐘，然後加入ImL液體LB。在28°C震蕩回收細胞2-4小時。包括無任何質粒的感受態農桿菌細胞陰性對照。然後將細胞塗布在LB瓊脂平板上，平板包含用於篩選質粒的卡那黴素(50yg/mL)；和用於篩選農桿菌的利福平(100μg/mL)和慶大黴素(25μg/mL)。然後在28°C培養平板2_3天或直至菌落出現。通過菌落PCR，使用插入片段的特異性引物篩選包含插入片段的菌落。這些菌落還用於接種於包含篩選物(50μg/mL卡那黴素，100μg/mL利福平，25μg/mL慶大黴素)的5mL液體LB發酵劑。培養物在28°C過夜震蕩生長。擬南芥轉化待轉化的擬南芥在土壤上生長，並修剪第一個開花的花苞，以促進多個二次花苞出現。當有很多花叢時將植物浸溼並剪去任何已發育的果實。然後使用來自Clough和Bent(1998)的規程的修正規程轉化擬南芥。使用包含篩選物的5mL發酵劑接種500mL液體LB。然後在28°C震蕩過夜生長。在RC5CPlus離心機(Sorvall)中使用SLA-3000轉頭，以4，OOOrpm在室溫離心20分鐘，使500mL培養物成球。然後將小球重新懸浮於500mL5%(w/v)蔗糖溶液中。然後加入清潔劑SilwetL-77(lehleSeeds,RoundRock,TX,USA)至終濃度0.05%(體積比)。將花浸入溶液中5-10秒鐘，伴有溫和攪拌，然後平放在保鮮膜下的底盤中保溼。第二天靜置植物，並在一周後重複所述過程。種子放置兩周後，將植物轉移至黑暗的乾燥櫃中乾燥種子。將種子置於篩選劑上分離轉化體，然後將其轉移至土壤上。測序將DNA片段或質粒與合適的引物一起送至BiomolecularResourceFacility(JCSMR,ANU,Canberra)或AustralianGenomicResourceFacility(UQ,Queensland)測序。或者，在20μL測序反應液中製備DNA，所述反應液由下述組成0.5μM引物，IX緩衝液，2yLDNA和1.5yLBigDye。如下進行反應96°C2分鐘和下述共40個循環96°C5秒鐘，50°C15秒鐘，60°C3.5分鐘。然後使用EDTA純化方法純化PCR產物。加入5μL0.125ΜEDTA和60μL室溫100%乙醇至20μL。混合樣品並覆蓋錫箔紙在室溫靜置沉澱40分鐘。然後以最大速度離心20分鐘，使標記的DNA成球，並用70%乙醇洗滌，之後再次離心5分鐘。去除上清液，並使用Speedi-Vac乾燥小球。然後將樣品送給Yang測序。熱不對稱互動式(Tail)-PCR改編了來自(LiuY-G,MitsukawaN,OosumiT和Whittler，RF(1995)「EfficientisolationandmappingofArabidopsisthalianaT-DNAinsertjunctionsbythermalasymmetricinterlacedPCR",ThePlantJournal8:457_463)的操作規程。如Liu等1995所述，順序使用三個對T-DNA插入片段左邊界特異性的引物(LBal-5』-TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3'(SEQIDNO23)；LBb1-5『-GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT-3『(SEQIDNO24)；和LBc1-5'-GGACTCTTGTTCCAAACTGG-3'(SEQIDNO25))和隨機簡併引物，AD2(5，-NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA-3』，128倍簡併，其將結合至擬南芥序列中)，進行了一系列三個PCR反應。第一次的反應液為2(^1^，包含1\0緩衝液，20(^]每種(1^13，21111MgCl2,0.2μMLBal,3yMAD2,0.8UFlTaq和約20ng基因組DNA。每個樣品進行兩次平行反應，一個稀釋50倍以進行下一次PCR，另一個保留以在最後的凝膠上跑樣。第二次的反應液為20μL。包含1父？0緩衝液，20(^]\1每種(1^13，211111%(12，0.2μΜLBcl,2yMAD2,0.6UFlTaq和1μL來自第一次反應的稀釋PCR產物。每個樣品進行兩次平行反應，一個稀釋10倍以進行下一次PCR，另一個保留以在最後的凝膠上跑樣。第三次反應為100μL，並且除了使用第三條LB特異性引物和AD2之外，條件和第二次反應相同。通過瓊脂糖凝膠電泳分析所有擴增產物。通過第二次和第三次反應中條帶之間的大小差異鑑別插入特異性產物。使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)從凝膠上切下合適的條帶並測序(AGRF,Brisbane,Australia)。SALl蛋白質分析為了產生重組SALl蛋白質，使用PlantRNeasyKit，用柱上DNAse消化步驟(Qiagen，www.qiagen.org)從Col_0和alx8葉片提取總RNA，並按照生產商的說明用於第一鏈cDNA合成(SuperScriptII,Invitrogen,www,invitrogen.com)。從克隆的Col-0禾口alx8SALlcDNA,用弓I物SacII-SALlFl(5，-ctccgcggtggtatggcttacgagaaagagc-3，)(SEQIDNO26)和EcoRI-SALl(5，-gctcgaattctcagagagctgaagctttctc-3，)(SEQIDNO:27)，擴增完整的SALl編碼序列，然後克隆進pHUE載體(Baker等，2005)。在用ImMIPTG誘導後在大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen,www,emdbiosciences.com)中表達重組蛋白質，並使用His-結合樹脂，根據生產商(Novagen)的說明通過親和色譜純化。通過酶裂解回收無標籤的真正SALl蛋白質，並測定對於磷酸腺苷5』磷酸酯(PAP)的磷酸酶活性(Murguia等，(1995)，Science267，232-234)，並通過免疫親和純化從接種的兔血清IgG部分分離抗SALl多克隆抗體(IMVS，Adelaide)。對於western印跡，將20μg葉片蛋白質提取物溶於梯度凝膠中，電轉移至硝酸纖維素膜，並用11，000稀釋的針對重組SALl蛋白質的純化單克隆抗體進行檢測。在用0.05%(體積百分比)TweenPBS洗滌後，用110，000稀釋的HRP-結合羊抗兔IgG孵育印跡，並使用SuperSignalWestFemtoChemilumiscent檢測試劑盒(Pierce)展開。基因表達分析處理RNA時的注意事項因為環境中存在大量RNAse酶，所以要注意很多事情以避免RNA發生降解。在處理RNA時始終戴手套，並且儘可能在乾淨的環境中謹慎操作。樣品保持置於冰上，於-80°C保存，並限制凍融次數。無RNAse的水可以購買或通過用0.2%(體積百分比)焦磷酸二乙酯(DEPC，Sigma)處理MilliQH20而產生。在使用前，用DEPC處理的水過夜攪拌，然後高壓滅菌，以破環任何殘餘的DEPC。玻璃容器在180°C過夜烘焙，塑料容器在稀釋的H2O2中過夜浸泡，然後用DEPC處理過的水衝洗幾次。RNA提取使用PlantRNeasy試劑盒(Qiagen，Germany)提取RNA。總而言之，使用無菌微型杵將不超過IOOmg的冷凍組織研磨成粉末。裂解樣品並在提供的包含異硫氰酸胍(GITC)的緩衝液中變性，所述緩衝液也可使任何RNAse失活。然後將樣品應用於QIAshredder，去除不溶材料並剪切基因組DNA。洗脫液與100%乙醇混合，沉澱RNA，並使混合物通過RNeasy微型柱，RNA在其中結合矽凝膠膜。洗滌膜並用無RNAse的DNAseI(Qiagen)處理約20分鐘，並在用無RNAseH2O洗脫RNA前再次洗滌。RNA沉澱為了濃縮並純化RNA，使用了分子生物學(Ausubel等，1998)中當前的規程。概述之，向RNA加入1/10體積的乙酸鈉，pH5.2。將樣品短暫漩渦震蕩而混合，然後加入2.5體積的冰冷的100%乙醇。再次通過漩渦震蕩混合樣品，並置於-20°C30分鐘以促進RNA沉澱。然後在臺式離心機中以最大速度離心5分鐘而使RNA成球。去除上清液，並用70%乙醇洗滌小球，然後再次離心。去除上清液，並在Speedi-Vac中以中熱乾燥RNA5分鐘，然後溶於無RNAse的H2O中。eDNA合成根據獲得自ChristianDelessert(PlantIndustry,CSIRO,Canberra,Australia)的規程進行cDNA合成。向IygDNA中加入1μgT23V引物，並在70°C孵育10分鐘，使引物結合。然後反應液由下述組成30yL:lX合適的緩衝液，IOmM二硫蘇糖醇，0.17mM無RNAse的dNTP(Invitrogen)，100單位的SuperScriptII(Invitrogen)和無RNAse的H2O至30μL。然後在45°C孵育反應物2小時，並在無菌milliQH2O中稀釋至200μL0然後準備cDNA進行實時RT-PCR分析。實時RT-PCR使用實時反轉錄聚合酶鏈式反應(實時RT-PCR)測定轉錄本豐度。引物設計使用Primer3禾呈序(www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi)，用下述條件設計用於實時RT-PCR的合適的引物產物大小約250bp熔融溫度(Tm)約60°CGC含量約50%最大自互補為4最大3』自互補為3使用的基因序列為拼接的cDNA序列，獲得自TAIR(www,arabidopsis.org)。可能時，設計引物使其位於內含子的任一邊，以檢測DNA的汙染。通過「Blastn」，在國家生物技術中心網站(NCBI，http//www,ncbi.nlm.nih.gov/)上搜索，檢查引物的特異性。所有引物都訂購自Proligo(Australia)。使用的一些引物的實例在(Rossel,J.B.，P.B.Walter等(2006),Plant,CellandEnvironment29(2):269_281)中給出。使用的其它引物的實例包括APX2(At3g09640)，5，-GGCTGGGACATTTGATGTG-3，(SEQIDNO28)禾口5，-AGGGAACAGCTCCTTGATAGG-3』(SEQIDNO29)；APXl(Atlg07890)，5，-CCACTCGCATTTCTCCAGAT-3，(SEQIDNO30)禾口5』-TCGAAAGTTCCAGCAGAGTG-3，(SEQIDNO31)；sHSP(At2g29500)，5，-CCTGGATTGAAGAAGGAGGAAG-3，(SEQIDNO32)和5，-TAGGCACCGTAACAGTCAACAC-3，(SEQIDNO33)；ZAT10(Atlg27730)，5，-AGGCTCTTACATCACCAAGATTAG-3，(SEQIDNO34)和5，-TACACTTGTAGCTCAACTTCTCCA-3』(SEQIDNO35)；親環蛋白(At2g29960)，5，-TCTTCCTCTTCGGAGCCATA-3，(SEQIDNO36)禾口5』-AAGCTGGGAATGATTCGATG-3』(SEQIDNO37)；DREB2A(At5g05410)，5，-AGACTATGGTTGGCCCAATG-3，(SEQIDNO38)禾口5，-TCGAGCTGAAACGGAGGTAT-3，(SEQIDNO39)；HSP70(At3g09440)，5，-GCTGCTATTGCTTACGGTCTTG-3，(SEQIDNO40)和5，-CTCTCGGGTTTCCACTAATGTC-3『(SEQIDNO:41)。為了檢查引物的精確度和有效性，用100、25、5和IngcDNA製作標準曲線。每個濃度重複兩次。通過Rotorgene5程序自動生成R2值、反應效率和熔融曲線。對於精確的引物，R2值必須>0.99，反應效率必須>95%，並且熔融曲線必須說明只擴增一個產物。只有在這些條件都滿足時，這些引物才可用於實時RT-PCR。實時RT-PCR過程建立在Rotor-Gene2000或Rotor-Gene3000(CorbettResearch,Australia)中進行實時RT-PCR反應。在某些情況下，每個cDNA樣品重複三次實驗。或者，重複兩次反轉錄，並且每個反轉錄有兩次技術重複，所以每個RNA樣品有四個重複。用針對目的基因和針對「管家」基因的引物測試每個樣品。在相對於管家基因(其表達不改變)進行各種處理後，實時RT-PCR可以定量具體組織中的mRNA豐度。這可以如下進行通過測定轉錄本中螢光染料SYBR綠的合併而測定轉錄本經過重複循環後的擴增速率。這種染料可以結合所有dsDNA分子，並且在結合時僅發出螢光信號。為了進行反應，按照生產商的說明使用SYBRGreenJumpStartTMTaqReadyMixTM(SigmaAldrich)RocheLightCycler4800SYBRMaster(Roche,Basel,Switzerland)。對於Sigma產品，混合物包含IOmMTris-HCl,ρΗ8.3,50mMKC1,3.5mMMgCl2,0.2mM每種dNTP，0.25單位TaqDNA聚合酶，JumpStartTaq抗體和SYBR綠I。對於Roche產品，混合物的內容物未公開。通常1(^1^反應液包含25叫cDNA，0.2μM每條引物和0.9ΧMaster混合物。典型的循環條件如下950C2分鐘(TaqDNA聚合酶的初始活化)循環重複45次95°C15秒鐘(變性)，55°C30秒鐘(引物結合)，72°C30秒鐘(延長和螢光讀數)和80°C15秒鐘(螢光讀數)600C2分鐘(最後的延遲步驟)通過升至99°C，每5秒鐘增加1°C，從而進行熔融曲線分析。分析使用Rotor-Gene5程序(CorbettResearch)分析實時RT-PCR結果。對於每次反應，查看熔融曲線，確保每組引物產生單一的產物，並且產物進行了有效擴增。用於實時RT-PCR的分析方法如前所述(Rossel,J.B.，P.B.Walter等(2006)，Plant,CellandEnvironment29(2)269-281；Pfaff1,Μ.W.(2001),"Anewmathematicalmodelforrelativequantificationinreal-timeRT-PCR，，，NucleicAcidsResearch29(9))。對於可比的Ct方法，將擴增反應的閾值設定為所有樣品以指數速率擴增的點。閾值循環(Ct)值是特定樣品達到閾值而進行的循環數，其中每個樣品的螢光量相同，並且從而dsRNA量相同。然後將這些Ct值轉化成Excel(Microsoft，USA)。刪除每組三個重複中Ct值相差超過0.5的異常值。然後通過在某個時間點和條件比較目的基因的表達和相同時間和條件的管家基因的表達，將得到的數據集歸一化。這可以通過從目的基因三個重複的每個Ct值減去該樣品中管家基因的平均Ct值而得到ACt=Ct(目的基因)_平均Ct(管家基因)然後將這些數值與對照樣品比較，通常t=0。這可以通過從每個樣品值剪去對照值而得到ΔACt。ΔΔCt=ΔCt(目的基因)-ΔCt(對照)然後使用這些數值，用公式2-ΔACt計算絕對值。結果是，對照值成為1，並且所有其它樣品給出相對於對照值的數值。對於可比定量方法，將程序分析的樣品與用戶確定的對照樣品比較，通常t=0。然後使用下述公式計算可比濃度可比濃度=擴增(對照takeoff-本樣品takeoff)使用隨循環增加的螢光速率而計算takeoff值。最大速率為峰值速率，並且takeoff速率是峰值速率的80%以下。Takeoff值是當反應到達takeoff速率時已進行的循環數。擴增是對於特定引物組，所有樣品的評價擴增效率。可以以到達take-off點後四個循環中螢光增加的平均倍數而計算。理想地，這個數值在反應的指數期為2。對每個引物組，給出了平均擴增效率和置信區間，並且置信區間值增加，說明樣品之間波動更大。然後將每個引物源自計算機的可比濃度輸出至Excel，並針對管家基因歸一化。這導致表達量相對於對照的百分比或倍數改變。使用Excel功能計算每組平行實驗的標準偏差。然後使用Excel將結果繪成柱狀圖。適當的時候，將多個生物副本的結果平均，並使用STDEVPA功能計算實驗間的標準偏差，其根據全群落確定標準偏差作為參數。Northern印跡使用Northern印跡研究基因表達的程度和是否出現拼接變體。使用RNeasy試劑盒，如上進行RNA提取，每個生物副本僅使用三個QIAShredder柱，並且通過一個RNeasy柱洗脫，使得到的洗脫液濃度最大。然後如上將每個樣品的20μgRNA沉澱，並重新懸浮於5μL無RNAse的水中。用濃縮的RNA在無RNAse的條件中進行凝膠電泳。通過在125mLDEPC處理的H2O中使2.25g瓊脂糖熔化而制膠。冷卻混合物，然後加入15mL10XMOPS(0.4MM0PS，0.IM乙酸鈉，0.OlMEDTA)，7.5mL甲醛和2μL溴化乙啶(EtBr)。將凝膠置於正常凝膠電泳槽中，然後用加入1μL/IOOmLEtBr的1XMOPS平衡。向每20μgRNA中加入9yL甲醛、25yL甲醯胺和4.2yL10XM0PSo然後將樣品漩渦震蕩而混合，並在55°C加熱使RNA變性。在向凝膠上樣前，向每個樣品加入0.5μLEtBr和2μL上樣緩衝液(ImMEDTAρΗ8.0，50%甘油，2.5mg/mL溴酚藍，2.5mg/mL二甲苯藍)。以100V跑膠幾小時，直至染料沿凝膠移動2/3。然後在UV照射下快速給RNA照相，查看RNA的質量和數量。通過用20XSCC過夜重力印跡，將RNA轉移至尼龍膜(Hybond-N，AmershamBiosciences,Buckinghamshire,UK)。然後用保鮮膜將尼龍膜包起來，並通過UV以1200V照射而將RNA固定於膜上。然後在黑暗中保存膜備用。通過使用引物Fryl-IF(5，-AACCCATTTTGTAAATCTTCC-3，)(SEQIDNO42)和Fryl-rt2R(5，-CAGAGAAACAAAGAACGTACGAGA-3，)(SEQIDNO43)和40μL反應液，從Col-0WTcDNA擴增SALl而產生探針。在凝膠上將PCR產物跑樣，並使用凝膠提取試劑盒純化。然後使用Prime-a-gene標記系統(Promega)，按照生產商的說明，用放射性α32P_dCTP標記探針。如(RosselJ.B.,WilsonI.W禾口PogsonB.J.(2002),「GlobalchangesingeneexpressioninresponsetohighlightinArabidopsis",PlantPhysiol.130:1109_1120)中所述進行過程。微陣列使用RNeasy試劑盒如上提取RNA用於微陣列。然後使用Nanodrop分光光度計測定RNA的濃度和純度。還通過3ygRNA的凝膠電泳檢查RNA的數量。概述之，通過在1XMOPS緩衝液中融化高保真瓊脂糖-1000而製成1%凝膠。在55°C冷卻混合物，然後加入溫的甲醛至終濃度18%(體積百分比)並倒入凝膠槽中。凝固後用1XM0PS跑樣緩衝液平衡凝膠。將IOyL的RNA與20μL上樣緩衝液(52%甲醯胺，1XM0PS，17%甲醛，7%甘油，0.02mg/mLEtBr,少許溴酚藍)，在70°C加熱5分鐘，然後在冰上冷卻2分鐘。然後在凝膠中在90V跑樣幾小時，直至染料走過凝膠長度的2/3。如果需要更濃的RNA，以中熱在Speedi-Vac中短時間降低體積。也在RNA6000NanoLabChip上，根據生產商的說明，使用Agilent2100Bioanalyser系統(SantaClara,CA,USA)測試RNA的質量和數量。這個系統由通過毛細管中凝膠基質上電泳的RNA分子大小而分離RNA分子。在不同的管中跑樣之前加熱使每個樣品和梯度變性。凝膠基質中的插入染料可以標記RNA，並在通過毛細管時讀出數量和重量。一旦確認了RNA的質量，使用生產商試劑盒和說明製備RNA用於AffymetrixGeneChip表達分析系統(SantaClara,CA,USA)中。概述之，使用T7_01igo(dT)引物和SuperscriptII，將5ygRNA反轉錄，稱為第一鏈合成。這使RNA結合在互補的DNA鏈上。然後合成cDNA的第二鏈，替代第二鏈合成中的RNA。這個合成使用RNAseH去除RNA，然後使用T4DNA聚合酶如DNA—樣重建第二鏈。然後通過使用cDNA結合柱而從cDNA去除反應組分，所述柱經過洗滌、乾燥並洗脫cDNA。然後使用體外轉錄(IVT)過程，從cDNA擴增用生物素標記的cRNA。這個過程使用生物素化核苷酸類似物/核苷酸混合物和T7RNA聚合酶。然後使用可以結合cRNA的柱純化cRNA，並允許少量等分試樣通過Bioanalyser，確認產物的質量和數量。也通過nanodrop分光光度計定量用生物素標記的cRNA，並確認純度。由於初始樣品中使用總RNA，針對存在的未標記RNA而調整產量。使用下述公式進行調整的cRNA產量=RNAm-總RNAi其中RNAm是在IVT反應和淨化後測得的cRNA的量(μg)，並且總RNAi是RNA的初始起始量(μg)。然後通過Mg2+離子誘導的水解，將20μgcRNA分解成35_200bp的片段。在Bioanalyser中允許少量等分試樣通過，確認發生了分解。為了確認RNA的質量，然後將來自一個樣品的少量片段化cRNA與TeStArray3雜交。過程與針對ATHl晶片的過程相同。對於ATHlGeneChipJf15μg片段化cRNA的每個樣品在45°C過夜(16小時)旋轉雜交。然後使用FluidicsSatation400，用非嚴緊洗滌方式洗滌GeneChip。然後用鏈黴親和素藻紅蛋白(SAPE)將GeneChip染色，SAPE可與生物素標記的cRNA結合。然後通過加入可以結合SAPE的一抗而放大信號。然後加入可以結合一抗的生物素化二抗，並最後加入可以結合二抗的SAPE。藻紅蛋白在570nm發螢光，所以在這個波長掃描GeneChip。然後分析結果。在上述步驟中加入很多對照。在第一鏈合成過程中加入四個polyARNA對照，以確保有效產生標記的cRNA。這些對照來自枯草芽孢桿菌(B.subtilis)的四個基因，其不存在於真核細胞中。還以不同濃度加入，以確保過程對於低、中和高豐度轉錄本有效。在陣列的最終分析中，這些基因的強度讀數應與它們的初始濃度成線性關係。在雜交前向片段化cRNA加入一組雜交對照。這些也以一定濃度範圍加入，確保雜交和信號強度成線性關係。一些對照來自大腸桿菌，並且還有一個對照來自Pi噬菌體。最後，還向雜交混合物中加入生物素化B2寡核苷酸。這些可以以交錯的方式結合在陣列外部附近，允許自動對其格線來鑑別探針組。如前所述(Rossel等(2007)，ThePlantCell,10.1105/tpc.1106.045898)進行分析，包括MAS5歸一化，統計學分析和錯誤發現改正率。形態和生理學測量葉片測量使用訂製的熱電偶乾濕計測量總水勢(Morgan，(1991)，AustralianJournalofPlantPhysiology，18，249-257)。將葉盤在22°C置於平衡室中4小時。將珀爾帖冷卻電流通過熱電偶並在微伏計(HR33DewPoint,Wescor,www.wescor.com/environmental)中根據指針的偏向讀出電動勢(emf)。通過將emf插入標準曲線而計算葉片水勢(MPa)。使用壓力盤設備測定土壤水勢(Klute(1986),MethodsofSoilAnalysis,Part!,PhysicalandMineralogicalMethods-AgronomyMonographno.9(Klute,A.，ed.Madison,WI,USAAmericanSocietyofAgronomy-SoilScienceSocietyofAmerica，pp.635-662)0還對葉片樣品進行了多種生理學測量。記錄葉片的厚度和表面積。在早期實驗中，通過記錄鮮重，在紙袋中在60°C乾燥3天，然後記錄乾重，從而測量葉片樣品的相對水含量。然後使用下式計算它們的相對水含量(RWC)RffC(%)=(Fff-Dff)/Fff在後期實驗中，從相同的植物切下蓮座葉，記錄鮮重(Fw)並在4°C在水中黑暗培養至少4小時。印跡葉片並測定膨脹重量(Dw)。如(Jones,(2007),JournalofExperimentalBotany,58,119-130)計算相對水含量RffC=(Fw-Dw)/(Tw-Dw)氣體交換在白晝光照生長12小時的植物上進行氣體交換測定，促進生長並因此得到較大的葉片。唯一的例外是在乾旱實驗中的植物，其在白晝生長16小時。用Li-6400(Li-Cor，Lincoln,NE,USA)，按照生產商的說明進行氣體交換。這個設備使葉片附著於植物上，植物固定在腔室中，並測定多個參數。在腔室中，可以控制光強度、波譜、溫度、溼度和C02濃度。通過比較進入腔室的和離開腔室的C02和水蒸氣量，可以推斷光合作用的量和氣孔的通透性。通過改變條件如光強度和C02濃度，我們能看到氣孔如何通過安排葉片的平均導度而作出響應。腔室為2cm2，所以如果擬南芥葉片不完全覆蓋這個區域，則導度將針對腔室內部的葉片區域而調整。高效液相色譜(HPLC)通過HPLC分析葉片材料的類胡蘿蔔素譜。總而言之，在500yL丙酮/乙酸乙酯的60/40(體積百分比)混合物中研磨葉片材料。用400yLdH20稀釋，並在臺式離心機中以最大速度離心3分鐘。分級提取類胡蘿蔔素，並如(Pogson，B.J.，Niyogi，K.K.，Bjorkman,0.禾口DelIaPerma，D.(1998),"AlteredxanthophyllscompositionsadverselyaffectchlorophyllaccumulationandnonphotochemicalquenchinginArabidopsismutants，，，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9513324-13329)所述使用AgilentHPLC和光電二極體陣列檢測器分析。通過與標準品比較波譜和保留時間而鑑別類胡蘿蔔素，並使用極性消光係數記錄峰面積用於定量。C-13測量葉片組織中13C的量可以指示植物生命過程中的平均氣孔大小，因為當氣孔打開時，將更傾向於12C而不是13C。稱重葉片樣品，得到鮮重，並於60°C在紙袋中乾燥3天。然後使用研缽和杵研磨乾燥樣品，並使用粉末測定樣品中12C對13C的比例。葉綠素含量通過測定光吸收而測量總葉綠素含量，其中在647nm處測量葉綠素a，在663nm處測量葉綠素b。為了提取葉綠素，用滾珠和700μL提取緩衝液(80%丙酮，2.5mM磷酸鈉緩衝液pH7.8)在組織研磨儀中研磨10-20μg葉片組織。然後在臺式離心機中以最大速度將樣品離心5分鐘。然後在647nm、663nm和750nm處測量提取物的吸收值。在750nm處的吸收是背景吸收，因此從647nm和663nm處的吸收值減去背景吸收值。為了計算總葉綠素含量，使用下述等式總葉綠素formulaseeoriginaldocumentpage36花青素含量由530nm處的吸收值測定總花青素含量。在組織研磨儀中使用滾珠在300μL酸化的乙醇(1%HC1)中研磨約30mg組織。為了提取花青素，加入250yL氯仿和200yLMilliQH2O並漩渦震蕩。然後在臺式離心機中以最大速度將混合物離心5分鐘。然後去除200yL水相併在530nm和657nm處的吸收值。使用96孔板在讀板儀中或在單獨的比色杯中測定吸收值。然後通過從530nm處的吸收值減去樣品霧化產生的吸收值(657nm處)而計算花青素的吸收值。通過下述等式測定花青素的濃度C=A/εLX體積/1000XMWX1/重量XDX106其中C是濃度(μg/g)；A是吸收值；ε為269000，對於最豐富的花青素即矢車菊素-3-葡萄糖苷是常數；L是比色杯的通路長度；體積是提取物的總體積(mL)；麗是449，矢車菊素-3-葡萄糖苷的分子量；重量是初始的樣品重量(g)；並且D是稀釋因子(如果使用的話)。抗壞血酸實驗測定冷凍葉片組織的抗壞血酸含量和抗壞血酸池的氧化還原狀態。使用研缽和杵在液氮中研磨組織，然後稱出約50mg粉末放在冷凍的1.5mLEppendorf管中。加入四倍體積的提取緩衝液(2%w/v偏磷酸的milliQH2O溶液；SigmaUltra，SigmaAldrich,St.Louis,MT,USA)，並將樣品漩渦震蕩以徹底混合。然後在臺式離心機中以最大速度(16.Ixg)將樣品在4°C離心4分鐘。然後向485μL實驗緩衝液(67.5mMKH2PO4,32.9mMK2HPO4,1.27mMEDTA)中加入50μL提取物，並輕拍以混合。然後通過在265nm和415nm處的吸收值測定還原的抗壞血酸含量。然後通過加入33.3U抗壞血酸氧化酶的實驗緩衝液(5μL6.67υ/μL,CalzymeLaboratories,SanLuisObispo,CA,USA)WMMW^Mi^M.酸池，並測定吸收值。用5yL0.2M二硫蘇糖醇的實驗緩衝液溶液將另一個樣品還原20分鐘，並測量吸收值。使用合適的空白。還計算了提取物的總體積。為了確定存在的抗壞血酸的量，將265nm處的吸收值針對背景吸收和在415nm處的吸收值歸一化。這樣得到的抗壞血酸濃度能用來計算mg/100gFW組織。可以用初始樣品濃度減去氧化的樣品濃度計算還原的抗壞血酸池的量。可以用還原的樣品濃度減去氧化的樣品濃度測量存在的抗壞血酸的總量。氧自由基吸收能力(ORAC)實驗ORAC實驗測量物質的抗氧化能力，並且廣泛用於確定食品的抗氧化能力。對於擬南芥，測試植物材料的提取物。這個提取物可以是膜結合的；來自質膜、葉綠體類囊體和其它內膜上；或者可溶；來自胞液、液泡、葉綠體氣孔等。實驗測量抗氧化敏感螢光分子藻紅蛋白(R-PE;Sigma)的螢光。向R-PE加入自由基產生劑AAPH(Sapphire，BioScience)，結果使螢光緩慢下降。然後加入植物提取物，或者降低下降速率，或者增加下降速率，依賴於是否分別具有更大的抗氧化能力或氧化能力。抗氧化劑Tr0I0x(Fluka)用作標準，替代植物提取物。Trolox是維生素E衍生物。然後可以通過比較每條曲線的面積而以微摩爾Trolox當量/g鮮重組織將提取物的抗氧化能力定量。為了產生提取物，將20_100mg成熟但未開始衰老的葉片在液氮中冷凍，並在預先稱重的Eppendorf管中測定它們的鮮重。然後將冷凍的組織研磨成細粉，並重新懸浮於40(^1^無菌時1110H2O中。在臺式離心機中以最大速度在4°C離心30分鐘，使不溶於水的材料成球。去除上清液並用PBS(磷酸緩衝鹽；75mM，pH7.0)中稀釋至濃度為IOmg初始鮮重/mL。對於脂溶性提取物，在dH20中洗滌上述小球兩次，然後重新懸浮於400μL丙酮中。然後在臺式離心機中以最大速度在室溫離心10分鐘使固體材料成球。去除上清液並用PBS稀釋至濃度為IOmg鮮重/mL。對於實驗本身，使用Eclipse分光光度計(Cary)，其能使用小攪拌棒在比色杯中混合樣品，並且能同時測定四個樣品的螢光。因此可以同時運行空白、標準和兩個樣品。這些由下述組成1.空白-2738μL3.38mg/LR-PE+150μLlXPBS+150μL320mMAAPH2.標準-2738μL3.38mg/LR-PE+150yL20μMTrolox+δθμL320mMAAPH3.樣品-2738μL3.38mg/LR-PEPBS+150μL樣品+150μL320mMAAPH首先，向攪拌的比色杯加入R-PE和樣品/Trolox/PBS，並將螢光穩定在800超過大約20分鐘。然後向所有比色杯快速加入AAPH並測定螢光強度的下降直至到達零。將每條曲線下的面積積分，針對稀釋因子調整並計算抗氧化能力。ABA測量使用基於PhytodetekEliza的實驗(Agdia，Elkhart,Indiana,USA)測量葉片中的ABA含量。對於ABA提取物，富集約IOOmg葉片組織，並立即在液氮中冷凍。使用Qiagen組織研磨儀和滾珠將組織研磨成細粉。將冷凍的粉末懸浮於ImL提取溶液(80%HPLC級甲醇，100mg/L丁羥甲苯，500mg/L檸檬酸一水合物)中，然後在暗處在4。C旋轉24小時。然後在IOOOXg將樣品離心20分鐘，然後將上清液轉移至新管中。將上清液在暗處使用SpeediVac以中熱去除甲醇，乾燥至約50μL。然後用TBS緩衝液(3.03g/LTris鹼，5.84g/L氯化鈉，0.2g/L七水合硫酸鎂，0.2g/L疊氮化鈉，pH7.5)將剩餘的液體稀釋至lmL。使用每個樣品的1100的TBS緩衝液稀釋液進行實驗。按照生產商的說明進行實驗。在讀板儀中在405nm處讀板。試驗了很多不同的提取操作規程，包括在重新懸浮前徹底乾燥樣品，過濾提取物和離心提取物。還試驗了20、100和200mg的組織重量和110和1100的稀釋度。成像掃描電子顯微鏡^tDr.ChengHuang,ANUElectronMicroscopyUnit白勺禾呈。使用冷凍掃描電子顯微鏡將葉側表面成像。概述之，將小片成熟葉片用組織冷凍培養基和碳糊的混合物固定粘附，幫助導電。然後在真空下將樣品在液氮中冷凍，以快速冷凍並防止形成水晶體。然後在真空中將樣品加熱至-90°C至腐蝕，即除去樣品表面的水晶體。然後使樣品回到_160°C，之後包被金顆粒。然後在CambridgeS360(SEM；1987；Leica/Cambridge,Wetzlar,Germany)中將樣品成像。使用相同的過程查看花苞和成熟葉片的橫截面。然而這些樣品冷凍後斷裂。概述之，一旦固定並在真空中冷凍，敲打樣品頂部，使樣品斷裂並露出橫截面。透射式電子顯微鏡固定葉片樣品將小片成熟葉片嵌入樹脂中，用電子顯微鏡觀察葉片橫截面。首先用由0.IMcacolydehyde,4%甲醛和2.5%戊二醛組成的緩衝液在弱真空中將3mmX3mm的樣品洗滌2小時。然後去除緩衝液並用0.IMcacolydehyde將樣品洗滌三次共15分鐘。然後用0.IMoacicacid和0.05Mcacolydehyde緩衝液將樣品固定90分鐘。然後用水洗滌樣品三次共15分鐘。然後使樣品通過甲醇梯度，開始為70%甲醇，然後通過80%，90%，95%和三批100%甲醇。每次洗滌保持至少15分鐘。然後用100%丙酮洗滌樣品15分鐘以替代甲醇。然後使樣品接觸水平不斷升高的樹脂(環氧樹脂醛)中，所述樹脂用丙酮稀釋。首先為1/3樹脂2/3丙酮，然後是1/2樹脂1/2丙酮，然後2/3樹脂1/3丙酮。每次至少30分鐘，並且旋轉以混合。然後使樣品接觸純樹脂三次，超過2小時，去除任何酮。然後將樣品和新樹脂載於樣品模子中，在60°C過夜烘焙。切片和染色將嵌入的葉片材料切成薄片進行TEM並使用UltracutsUltramicrotome(Reichert,Depew,NY,USA)光學顯微鏡觀察。製作玻璃刀將切片切下放在水上。在挑取至標本支撐格上之前用熱使切片變平。然後將樣品過夜放置乾燥，然後在暗處用6%(體積百分比)乙酸鈾醯的水溶液染色20分鐘。用dH20衝洗樣品幾次，然後在檸檬酸鉛中染色10分鐘。在乾燥前通過用dH20衝洗而去除染料。成像使用附著於SISMegaviewIIIWidefieldCCD照相機(1300X1024像素，12位元組；SoftImagingSystemsCorporations,Lakewood,CO,USA)的HitachiH7100FA(125kVTEM；1995；Tokyo,Japan)攝取圖像。光學顯微鏡在LilyShen，ANUElectronMicroscopyUnit的幫助下進行過程。用ultramicrotome切開的葉片橫截面在玻片上乾燥並用甲苯胺藍染色，然後用dH20衝洗。使用配備SPOTCCD照相機(1300X1240,36位元組色彩；SpotImagesCorporation,Chantilly,VA,USA)的ZeissAxioskop(CarlZeisslnc.,Oberkochen,Germany)從下面獲得固定玻片狹縫的圖像。然後用SPOT高級軟體處理圖像。螢光素酶成像使用冷CCD照相機在體內檢測轉基因植物的螢光素酶活性。用0.5mM螢光素(Biosynth，Switzerland)噴灌植物，所述螢光素為水溶液，並且包含幾滴Tween-80(LaboratorySupply，Australia)，均處理15分鐘並立即成像。將植物置於暗處幾分鐘直至葉綠體螢光下降，然後曝光2至10秒的不同時間。然後將這些整合，以增加圖像強度。使用冷CCD照相機(AndorTechnology,Japan)並使用ImageProPlus4.5.1(MediaCybernetics,USA)處理圖像。代謝物/溶質的提取和分析提取約50mg鮮重的葉片組織並基本如Roessner-Tunali等(2003)，PlantPhysiology,133:84_99所述通過GC-MS分析。概述之，在液氮中將組織冷凍，然後在Retsch球磨中以15次振動/秒鐘研磨3分鐘。然後在70°C用0.5mL85%(體積百分比)Me0H/H20提取組織粉末(約50mg)15分鐘，所述提取液中包含0.2mg/mL核糖醇作為內標。然後通過在20，OOOg離心10分鐘而使不溶材料成球。然後在真空下將100μL上清液等分試樣乾燥，並通過用20μL20mg/mL鹽酸甲氧胺的無水吡啶溶液通過甲氧化而衍生乾燥的代謝物提取物(30°C，90分鐘)。為了將包含活性氫的活性功能團轉化成它們的三甲基矽炕基(TMS)衍生物，向反應混合物加入30μLMSTFA，並在37。C反應30分鐘。然後將反應平衡至少4小時，之後進行GC-MS分析。向GC-MS中注入1μL，並且使用45分鐘溫度程序在配備IOm整合保護柱的30mVarianFactorFour5msGC柱上分離分析物。用從40至600m/ζ的掃描範圍中，以全掃描模式獲得四極柱-MS數據。通過使用免費提供的AMDIS軟體自動去卷積和整合峰，進行數據分析，所述軟體可以與真正的質譜和保留指數的內部資料庫相競爭。使用定製的PHP腳本自動處理AMDIS批次報告並在MicrosoftExcel中可視化，從而進行統計學分析。實施例2-結果在EMS誘變擬南芥種子後，鑑別了APX2=LUC表達改變的幾株突變體，包括APX2LUC表達增加的突變體alx8。三株植物表現出抗旱性增加-保水9天後，alx8突變體的葉片保持膨脹、綠色並且有活力，而野生型葉片已枯萎死亡(參見圖7)。發現ABA水平在alx8中更高，儘管在相同時間，ABA-依賴和ABA-無關途徑中的組分都上調了(Rossel，J.B.,P.B.Walterφ(2006),Plant,CellandEnvironment29(2):269_281)。例如高光響應基因，ZATlO和APX2，在alx8中均上調。然而，認為ZAT10存在於ABA-無關途徑中(Zhang,J.Ζ.等(2004),"FromLaboratorytoField.UsingInformationfromArabidopsistoEngineerSalt,Cold,andDroughtToleranceinCrops",PlantPhysiol.135(2):615_621)，而APX2為ABA依賴的(Rossel等，2006)。脅迫抗性基因的上調與先前的fryl突變體一致，儘管每個突變體中上調的脅迫抗性基因不同，例如RD29A4在fryl-Ι中上調(Xiong,L.Μ.等(2001),"FIERY1encodinganinositolpolyphosphate1-phosphataseisanegativeregulatorofabscisicacidandstresssignalinginArabidopsis"Genes&Development15(15):1971_1984)，但是在alx8中則沒有(Rossel等，2006)。相似地，在alx8中觀察到的脅迫抗性提高是新線索。alx8還具有不尋常的萵筍樣葉形。Fl和F2植物的研究表明，APX2:LUC表達增加和其它脅迫基因上調，抗旱性和葉形改變共分離。alx8是SALl中的點突變通過定位克隆和測序鑑別alx8點突變的位置。通過將Col_0背景中的alx8野生型Landsbergerecta雜交，產生定位群體。Fl的葉形、發育和APX2表達為野生型(未給出數據)，證明為隱性突變。Fl個體自體繁殖，並且將分離的F2代播種在土壤上。通過葉形從F2代鑑別alx8突變均一的個體，其表現為與抗旱性分離並且APX2表達增加(Rossel等，2006)。用400個突變F2個體，用遍布與擬南芥基因組中的22條引物進行第一次通過定位。這說明突變與染色體5的下半部相關。在這個區域用更多的標記進行深入的連接分析，得到617kb的目的區域。用617kb區域側翼的兩個標記物MUB3和匪19，對約4000個F2個體進行精確定位。為了確認alx8突變的位置，使用SALl基因和啟動子的野生型拷貝補充突變體表型。兩個確認的單獨alx8轉化體均具有野生型葉形和發育。互補的alx8的後代與alx8突變體表型有明顯區別，並且表現為正常的野生型葉形(參見圖2)。這確認了SALl中的突變的確負責突變體表型。還用這個構建體轉化野生型植物，但是葉形、APX2表達或發育沒有變化。alx8基因和2kb啟動子的測序表明在At5g63980.1基因組序列(TAIR序列4010730406(2007年4月17日)，登錄號NM_125794.4；SEQIDNO1；圖3)的第1226個鹼基對存在鳥嘌呤到腺嘌呤的單個核苷酸多態性。這在編碼序列(TAIR登錄號4010745380(2007年8月16日)；SEQIDNO:2，圖4)的第217個胺基酸處產生了甘氨酸到天冬氨酸的胺基酸變化。通過對多個突變植物的啟動子和基因組序列的進一步測序，確認這個突變為SALl中的唯一突變。還通過使用衍生的裂解多態序列(dCAPS)標記物，在四代逆交中篩選突變，確認突變體繼承葉形(參見圖1A)。即，植物中沒有其它突變導致突變體表型。先前已鑑別了多個SALl中的突變體，包括溫度敏感突變、滲透壓脅迫調節基因表達2的高表達(hos2；Xiong等，2004)和firey1突變體(fryl；Xiong等，2001)。fryl-1突變導致第341個胺基酸從色氨酸變為終止密碼子，產生缺失α5螺旋的截短蛋白質，所述螺旋為酶活性所必需的(Xiong等，2001)。使用針對酵母相似物HAL2的已知結構進行模擬蛋白質建模，將alx8突變定位於蛋白質內部的保守β-摺疊。這個域沒有已知的功能。Salk_020882突變體在alx8突變體的基因分型過程中，對重組體的進一步基因分型和表型分型使目的區域縮小至BAC克隆MBM17和七個基因。為了確定alx8表型，針對這些基因訂購了很多T-DNA插入系。一個系，SALK_020882，模擬alx8葉形改變和發育延遲的表型(參見圖10)。這個系在AT5G63980基因中包含插入，已知為SALl(FRY1/H0S2)。為了確認等位性，在alx8和SALK_020882之間雜交。所有後代都具有和兩個親本相同的葉形變化和同樣延遲的發育，表明兩個突變體為等位的。還發現SALK_020882植物(本文研究了兩個特定系，稱為salkl和salk2)比Col-O野生型植物更能耐受乾旱(圖12和15)。這些突變體在獲得自擬南芥生物資源中心(ABRC)的Col-O生態型中包含T-DNA插入系。同源植物具有改變的捲心菜樣葉形，如alx8(參見圖10)，並且具有卡那黴素抗性。突變與alx8是等位的，並且這些突變體表現出抗旱性(參見圖11、12和15)。Northern印跡表明與Col-O野生型相比，在SALK_020882系中仍然存在SALlmRNA，但是存在多個拼接變體，並且alx8變體只有一個。由擬南芥信息資源(TAIR)給出的插入位點如圖9A所示。通過從T-DNA插入的LB單次傳遞測序而建立。給出了互補序列，即朝向基因的5』末端。為了確認插入的位置，從來自一株植物的DNA上插入的LB進行TailPCR。這導致如圖9B所示的插入位點。由兩側獲得的序列表明可能發生雙插入。獲得的序列還表明在插入位點附近缺失Ilbp(參見圖9B，與圖9A相比較)。在alx8和fryl-Ι中不存在SALl蛋白質由融合至多組氨酸標籤泛素而為野生型SALl和突變的ALX8產生重組蛋白質。在大腸桿菌中成功地產生兩個融合蛋白質，並且它們計算所得質量(約52kD)對應於胺基酸序列加14kD標籤的期望大小(未給出數據)。儘管嘗試了很多不同的誘導條件，但是只有SALl(野生型)融合基因成功地從可溶組分中純化得到。這個蛋白質還表現出與先前報導相似的PAP磷酸酶活性(16.6士SE3.65微摩爾PAPPmg蛋白質，η=3)(Xiong等，2001)。進行Western印跡分析，確定野生型和突變植物中SALl蛋白質的豐度。在裂解使多肽具有基於胺基酸序列的期望分子量(37kD)的標籤後，回收真實的SALl重組蛋白質(圖11A，泳道10)。使用這個蛋白質增加多克隆抗體，其針對SALl免疫親和純化。單一的37kD條帶，其大小對應於重組蛋白質，在野生型植物的總可溶蛋白質提取物中檢測得到，但是在突變體中則檢測不到(圖11A)。此外，SALl蛋白質不存在於alx8的總蛋白質提取物中，但是存在於野生型Col-O中(圖11B)。alx8、salk_020882和fryl-1抗乾旱fryl-1突變體是突變擬南芥系，其在正常條件下和低溫、鹽和滲透壓和ABA處理後，脅迫抗性基因RD29A的表達增加。發現這是由於SALl蛋白質(At5g63980)的第六個外顯子中的終止密碼子中產生點突變。這產生了不包含保守α-螺旋的截短型蛋白質，其中所述螺旋包含金屬離子和磷酸鹽的協調以及親核水活化所需的WD-X11-GG基序。結果蛋白質對於IP3或PAP無活性。已報導fryl-Ι突變體對於鹽、低溫和滲透壓的脅迫敏感增加(XiongL.M.等，(2001)，Genes&Development15(15)1971-1984)。這個突變體還與alx8和salk_020882突變體顯示的葉形變化相似。在本研究中，發現fryl-Ι植物同alx8和salk_020882突變體相似，在相似的發育階段(參見圖7)或實齡(圖8A)接受乾旱處理時，與野生型植物比較，具有相似的抗旱性。圖8A顯示，當Col-O和C24野生型植物在脫水21天後表現出萎黃病並且葉片枯萎時，alx8和fryl-Ι植物在25天後僅表現出枯萎的跡象，並且圖15A顯示，alx8、salk_020882和fryl-Ι植物在18天後未出現枯萎或變色跡象，但是野生型植物(Col-O和Col-24植物)在18天後表現出枯萎和變色。如圖15A所示，圖中表示了18天脫水，然後再重新澆灌3天的結果，alx8、salk_020882和fryl-1植物在3天內恢復活力，同時Col-O和C24野生型即使有恢復跡象也很少，大多數葉片變白並枯萎。這種模式在超過10次不同的實驗中重現，每次實驗至少有四株植物。alx8、salk_020882和fryl-1和抗旱性除了alx8和fryl_l丟失功能等位基因(並且推測salk_020882丟失功能等位基因)之外，已經描述了fryl-Ι的幼苗期對乾旱敏感(Xiong等，2001)，同時在土壤上生長的成熟alx8植物可耐受乾旱(Rossel等，2006)，如salk_020882植物一樣。對fryl-Ι的描述基於從1周齡幼苗的離子洩漏向包含PEG溶液中浸入增加。然而未見到fryl-Ι和C24野生型的獨立嫩枝的蒸發率有差別，表明氣孔控制沒有變化。為了研究fryl-Ι和alx8在這方面的差別，通過水分損失而監控alx8、fryl-1、Col-O野生型和C24野生型獨立蓮座的蒸發。在初始階段或二級階段，四種類型之間均未看到顯著差異，表明表皮相似。然後通過成熟植物保水28天而測試fryl-Ι突變體基於土壤的抗旱性。在多次實驗中，fryl-Ι比C24野生型更能耐受乾旱(參見，例如，圖7、8A和15A)。為了確保兩組植物都接觸相同的脅迫條件，通過將盆重量計算為初始盆重量的百分比而近似計算土壤的相對水含量。在實驗過程中，fryl-Ι和C24野生型植物之間土壤水含量沒有顯著差異(圖8B)。將這轉化為土壤水勢，並且土壤水勢之間仍然沒有顯著差異。類似地，在多次實驗中未見到alx8或salk-020882植物和Col-O野生型的土壤水含量之間有顯著差異(圖8B、15B和21C)。為了確保和alx8的耐受結果不僅僅是發育延遲或尺寸更小的結果，測試了在多個發育階段的alx8的抗旱性。在2、4、6和8周齡，alx8比Col-O野生型更耐乾旱。當兩種植物類型都具有六片葉子；都是成熟植物時；和當兩者處於相同發育階段，剛剛開始結花苞時，alx8也比Col-O野生型更耐乾旱(圖21)。當植物剛剛開始開花時(圖21A)，植物基本具有相同的蓮座區域和大小，但是在保水9天後，alx8和salk-020882比野生型Col-O更膨脹並呈現綠色，儘管水損失率相似(圖21C)。類似地，生長至發育的相同成熟綠色階段的alx8和fryl-Ι植物更耐乾旱，在這個階段野生型植物為8周齡，alx8植物為4周齡(圖21B)。測定四種基因型的獨立蓮座水損失，以確定葉片和蓮座形狀是否會改變損失率或水損失，或者它們是否有區別地調節通過氣孔控制的水量(水損失的初始階段)和蒸發(水損失的第二階段)。在任何階段，四系植物之間未見到顯著差異(圖21E)。因此，葉形和蓮座形狀的改變不影響水從獨立植物損失的速率。最後，評價相同年齡植物的抗旱性，其中將1株Col-O植物每盆與2株alx8植物每盆比較，使植物大小之間的差異相等，並且alx8比Col-O更耐乾旱，可保水。這表明不是alx8的發育延遲或土壤水含量的差異導致alx8的抗旱性。此外，從切下蓮座蒸發不總是與土壤中生長的植物的抗旱性相關。為了將alx8植物的耐乾旱程度定量，使用葉綠素螢光測定植物活力。alx8植物表現出的乾旱存活時間比Col-O長40-50%(未給出數據)。在不同的實驗中，在無脅迫條件下和乾旱12天後測定葉片相對水含量(RWC)(圖16A)。如同期望的，alx8的葉片RWC在乾旱期間未顯著改變，而野生型的葉片RWC顯著下降。針對相同的植物，使用熱電偶溼度計計算葉片水勢，或者用水的化學勢除以偏摩爾體積(圖16B)。在乾旱條件下生長的psychrometer植物的水勢更高，與保持的膨脹性相對應，而水脅迫的野生型植物的葉片水勢顯著降低。最後，針對fryl-Ι和alx8突變體和它們各自野生型(C24和Col-O)測定獨立蓮座的水損失，以確定是否差異性調節通過氣孔控制的水量，即初始階段水損失，或蒸發，即第二階段水損失。在任何階段均未見到顯著的差異(數據未給出)。SALl是高度保守的蛋白質SALl在所有生物體之間高度保守。因此同源性存在於所有作物種類中，這些作物種類的基本序列信息可獲得。理想的是，SALl及其同源物存在於所有植物種類中。這可通過植物中已測序的同源蛋白質的圖5中的比對而闡釋。搜索其它植物種類的表達序列標籤(EST)，查找SALlmRNA，並且發現了很多同源序列(圖6A-6C)。擬南芥基因組中也存在幾個同SALl同源的基因。alx8突變的分子效應在fryl-Ι和alx8中測定了13個脅迫響應基因的表達。這些基因中只有有限數量的基因在正常條件下在突變體中的表達增加fryl-l中的C0R47；和alx8中的APX2、RAP2.6、ZAT10、ZAT12和DREB2A。RD29A在fryl_l中的表達增加，但是在alx8中沒有增加。在正常條件下，在fryl-Ι中，脅迫響應基因HSP70、KIN1、C0R15A和ADH基本未上調(Xiong等，2001)。類似地，在正常條件下，在alx8中，脅迫響應基因sHSP、GST6和APXl基本未上調。這令人驚訝地在這些突變體中得到了IP3更高的組成水平，並且表明IP3信號傳導可以僅涉及部分脅迫響應途徑。為了進一步研究脅迫響應途徑的上調，以及其它非脅迫相關途徑，通過微陣列測定了全局表達。在ATHIGeneChip(Affymetrix,SantaClara,Ca,USA)上定量的約24，000個基因產物中，相對於在Col-O野生型中的表達，1414個基因在alx8葉片組織中顯著上調超過2倍。1033個基因顯著下調超過2倍。在正常生長條件系，在fryl-Ι中，相對於C24野生型，1099個基因顯著上調，並且745個下調，超過2倍。這種對上調的偏向性符合SALl作為信號傳導通路的負調節子的推測目的。alx8和fryl-Ι中表達變化之間的重疊令人驚訝地限於上調基因，兩個突變體之間僅有727個基因相同，在下調基因中，僅有395個相同。調節的這些差異不同於C24和Col-O野生型之間的差異。因此，這證明相似突變能在不同生態型中引起多大程度的不同表達模式。alx8中很多脅迫響應基因上調，包括ABA-依賴型途徑中涉及的那些基因，例如-液泡膜水通道蛋白(TIP5；1)的上調，其通常由蔗糖、鹽和H2O2下調，但是由ABA上調；和-開花的負調節子C0NSTANS-LIKE9(C0L9)在alx8中高度上調。C0L9的過量表達導致CO和FTP的下調，和延遲開花，而T-DNA敲除使開花較早(Xiao-FeiCheng,Zeng-YuWang(2005),"OverexpressionofC0L9,aCONSTANS-LIKEgene,delaysfloweringbyreducingexpressionofCOandFTinArabidopsisthaiiana，，ThePlantJournal43(5)=758-768)。這個結果與在這些研究過程中的觀察相對應，表明研究的SALl突變體中開花與野生型植物相比延遲了四到五周。圖15表示在2、3、5和8周齡時的alx8和其相應的Col-O野生型植物。在&118中六乂2(倍數變化=9.3，？值=0.003)；ZATlO(倍數變化=5.00，ρ值=0.028)和RAP2.6(倍數變化=3.1，但是標準偏差較大)的表達增加。有趣的是，在alx8或fryl-Ι中，C0R47和RD29A的表達都沒有顯著增加。通過實時RT-PCR確認了缺乏RD29A的誘導。因此可能是實驗操作過程中環境中生長或幹擾的差異誘導了fryl-Ι中的這兩個基因。在水分充足條件下alx8中針對NCED3、GST6、APXl、RD29A和DREB2A的陣列中沒有任何變化，這與已發表的結果一致(Rossel等，2006)。alx8中很多脅迫響應基因上調，包括轉錄因子如ZAT10、ZAT12、MYC2和HB6。上調的其它脅迫響應因子包括幾個早期光誘導蛋白質，ELIP；水通道蛋白TIP5；1；脅迫信號激酶SnRK2.2；脅迫誘導蛋白質，VSPl和VSP2；和抗氧化酶CSDl和CSD2。為了進一步研究在alx8中組成型上調的途徑的類型，使用Genevestigator，將表達量上調超過25倍的基因與公共資料庫中保存的在其它陣列中的表達比較。除了alx8的ABA含量增加之外，alx8的表達模式和脅迫ABA之間沒有較強的關聯。只有10%的基因也由ABA上調，數目與通常由ABA下調的數目相似。在任何激素處理之間沒有較強的關聯。在alx8的表達模式和對非生物脅迫比如滲透、創傷、熱、氧化、低溫和鹽之間有一些關聯，但不強。alx8中百分之二十的上調基因為ABA誘導的，但是數目和由ABA下調的基因數目相似。相似地，其它激素處理之間沒有較強的關聯，除了與茉莉酸處理之間存在輕微的關聯。SALl對氣孔的作用先前，alx8表現出相對於Col-O野生型在不同的光強度範圍具有較低的氣孔導度(Rossel等，2006)。這種降低可能由多個因素導致，包括植物的形態、生理和分子譜的變化。導度下降可能由於alx8氣孔的密度、大小和/或形態改變。因此用冷凍掃描電子顯微鏡(SEM)觀察氣孔。氣孔外觀正常，並且不像氣孔發育出現突變的其它突變體中見到的聚集現象。氣孔不是位於凹陷中，這會由於邊界層效應而增加阻力，從而降低導度。alx8的大小與Col-O野生型中相似。使用SEM，計算葉側表面上的氣孔密度，發現在alx8中略高於Col-O野生型植物。與突變體如氣孔密度和分布l(ssdl；AT1G04110)相比，這種增加小得多，ssdl葉側氣孔密度提高2.5倍(Schluter等，2003)。此外，alx8和Col-O野生型中表皮細胞數目增加，導致出現相似的氣孔指數。這進一步由不同實驗中生長的alx8和Col-O野生型植物中氣孔的表皮而確認。此時Col-O野生型和alx8之間的氣孔密度沒有顯著差異。再次比較了兩種植物類型之間的氣孔指數。這裡強調了氣孔指數作為氣孔數目的度量值在比較發育發生變化的植物組織中的作用。除了葉片具有相似年齡外，它們的擴展階段可能不同，導致細胞密度更高。如果氣孔數目是alx8耐乾旱性的因子，可以期望alx8比Col-O野生型的氣孔指數低。事實並非如此，並且因此氣孔的功能可能改變。通過降低氣孔開度也可以降低導度。使用碳-13歧視(discrimination)了解植物生命過程中平均氣孔開度是否有差異。當氣孔打開並且氣體自由地在氣孔內外交換時，由於RUBISC0的區別，植物優先固定12CO2,而不是13CO2。然而當氣孔關閉時，氣體路徑受限，並且植物被迫使用13CO2。因此可以使用植物中13CO2對12CO2的比例表明植物的平均氣孔導度。在正常生長條件下，發現在野生型和alx8之間的13CO2利用上沒有差異。這表明在正常生長條件下，野生型和alx8之間的平均氣孔開度可比。通過歷時九小時的葉片表皮剝落而測定氣孔開度，從而確認了這一結果。同樣地，在這個時間段，alx8和Col-O野生型之間未見到開度有顯著差異。為了了解對於乾旱的響應，氣孔開度是否有任何顯著差異，對於已經在乾旱脅迫下20天的植物進行了13CO2歧視研究。只富集了乾旱處理過程中發育的組織。受乾旱影響的植物的S13C高於對照植物，對照植物為Col-O野生型和alx8，表明氣孔開度降低。受乾旱影響的alx8的δ13C未高於受乾旱影響的Col-O野生型，表明在乾旱過程中alx8的氣孔開度未減小。因此可以看出對於alx8，觀察到的導度減小是由於氣孔開度以外的因素引起的。葉形已經確認，形態變化，比如多汁、葉毛增加，能改變抗旱性。alx8的葉形改變成Col-O野生型植物的葉形。葉子更短、更圓，並且淺裂葉緣更多。葉片表面經常有起伏，並且葉柄長度降低，得到萵筍樣外觀的蓮座。SALK_020882突變體的葉形與fryl_l突變體相似(參見，例如，圖7和8A)。葉片表明起伏度增加能增加邊界層效應，減小蒸發。測量了葉片厚度，發現alx8中的葉片厚度顯著大於Col_0野生型植物(圖18A和B)。這個厚度意味著水蒸氣到達氣孔開放處的距離更長，並且可以抑制葉片的水分丟失。葉片厚度的增加還導致表面積對體積的比例下降，這可以降低表皮上的水分丟失。通過光學顯微鏡觀察的葉片橫截面也表明alx8中葉片內部結構有很多變化，包括無序的維管束、細胞形狀改變和葉綠粒更小(圖18B)。表皮是另一個水分從葉片損失的來源。然而與Col-O野生型相比，alx8中的表皮厚度或結構沒有可見的差異。此外，相對於Col-O野生型，在alx8中的表皮合成基因如WAX2(At5g57800)、CUT1/CER6(Atlg68530)和CERl(Atlg02205)沒有顯著變化。儘管發育延遲並且由於葉片和蓮座形態的變化看起來更小，但是alx8植物和野生型通過八周的生長積累了相似的蓮座鮮重和乾重(未給出數據)。細胞形態和滲透勢通過透射式電子顯微鏡更近地觀察了Col-O野生型和alx8的葉綠粒，並且發現alx8葉綠粒缺乏澱粉顆粒。這種澱粉積累的抑制進一步通過碘染色在alx8以及fryl_l中得到確認(圖19)。植物通常在白晝在葉片中積累暫時性澱粉，並在夜間將其分解。如同期望的，野生型葉片在夜晚比早晨的澱粉多。相似地，alx8和fryl-Ι葉片在夜間比早晨積累更多的澱粉。然而，在水分充足的條件下，野生型植物中存在的量基本較少。澱粉的減少與alx8中β-澱粉酶，BMYl和ΒΜΥ8的表達增加有關。這些酶將暫時性澱粉水解成麥芽糖和β-限糊精，其可以增加植物細胞的胞內滲透勢。通過GC-MS分析了alx8、fryl-l和它們各自的野生型在水分充足的生長條件下的代謝譜。所有四個系具有不同的譜，如由主成份分析(PCA)所表明的，C24和Col-O之間有一定程度的重疊(圖20)。兩種突變體由第一主成份(PCl；佔總變異的47.2%)而明顯區別於它們各自的野生型，第一主成份代表由PCA可見的最大分類別。有趣的是，第二主成份(PC2;佔總變異的25.1%)清晰地將alx8和fryl-1區別開來，而兩種野生型則沒有。在SALl突變體中，alx8和fryl-Ι中的多胺、腐胺的水平明顯增加(表2)。這與限速多胺生物合成基因精氨酸羧化酶ADC2表達增加(6.43倍)和可將亞精胺轉化成精胺的酶ACL5的表達下降(-3.90倍)有關。相對於Col-Ο，除了脯氨酸生物合成基因，吡咯啉-5-羧化還原酶增加(3.61倍)外，alx8中的脯氨酸豐度沒有顯著差異。在alx8和fryl_l中，大量糖的豐度有變化，包括果糖、半乳糖、葡萄糖纖維二糖和大量未知糖和糖衍生物的水平極大下降；和大量未知糖/糖衍生物的加大積累，所述未知糖/糖衍生物在野生型植物中的水平檢測不到或幾乎檢測不到(表2)。還令人吃驚的是，有機酸檸檬酸、異檸檬酸、延胡索酸和蘋果酸的極大下降和大量未知類別代謝物的極大增加，其中一些與吲哚相關化合物有特別的同源性(表2)。表2-SAL1突變體的特色代謝譜tableseeoriginaldocumentpage46tableseeoriginaldocumentpage47給出了alx8和fryl-1共有的主要(最大的)代謝物差異的倍數差異和p_值(η=5)。根據質譜與MST05質譜庫中參照譜的相似性對未知代謝物(方括號中的內容)進行了注釋。為未知的代謝物給出了保留指數。RI=「保留指數」。討論alx8突變體的抗旱性表現出是由於在脅迫條件下蒸發的減少，導致葉片和土壤中相對水含量更高。然而，蒸發的減少似乎不是由於乾旱誘導的氣孔關閉引起的。碳歧視和切下蓮座脫水實驗都表明在乾旱條件下，與Col-O野生型相比，alx8中氣孔關閉較少。因此水分損失的減少是由於alx8中其它形態、生理或分子變化，或者它們的組合。alx8的結構形態變化能引起乾旱脅迫下水分損失的減少。葉片厚度增加和無序的維管束可以使水在植物中移動和水蒸氣在氣孔下的擴散減慢。相似地，alx8的根形態發生變化，在水脅迫條件下改變水分攝取和移動。除了缺乏對已知脅迫響應基因的誘導之外，在alx8的代謝譜中仍然有很多變化，這些變化與脅迫響應有關，包括多胺、海藻糖和甘油的增加。alx8和fryl_l中滲透壓保護劑的積累可能是導致它們的抗旱性的因素。alx8中的多胺，腐胺的水平比其相應的野生型Col-O高15.2倍(ρ-值=0.008)。相應地，alx8中多胺生物合成酶ADC2的表達更高，所述酶通常上調而響應滲透壓脅迫(Perez-Amador，Μ.Α.等(2002),PlantPhysiology，130，1454-1463)。在多種耐乾旱小麥和耐氧化脅迫的各種雜草，香絲草中已經報導了組成型的高腐胺水平(Ye等，(1997),PlantPysiology,15,1443-1451)。先前，通過過表達生物合成基因而增加多胺水平已經顯示出可誘導對於各種非生物脅迫的耐受性，包括乾旱(Kur印a等，(1998),PlantCellPhysiology，39，987-992；Kasukabe等，(2004),PlantandCellPhysiology，45，712-722)。儘管腐胺在耐受性中的確切作用尚不確定，已經報導可能的作用是直接或間接的抗氧化防禦(Ye等，1997)和作為乾旱過程中精胺和亞精胺合成的調控子，以全植物水平提供抗衰老作用，得到表型正常的才直·(Capellφ,(2004),ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceUSA,101,9909-9914)。在alx8葉片組織中很多糖的水平也發生了改變，包括很多未鑑別的糖的大幅增加(表2)。這些變化與alx8的葉綠粒中暫時性澱粉的積累下降(圖19)負相關。糖在滲透脅迫響應中可能具有重要作用，作為滲透壓保護劑，保護大分子和防止膜融合(Bartels和Sunkar，(2005),CriticalReviewsinPlantSciences，24，23-58)。因此，alx8葉片組織中糖組分的變化可能與其抗旱性有關。對乾旱條件的預適應和alx8的發育改變不影響植物在水分充足條件下的水分平衡。然而，這可以解釋alx8的暫時生長延遲，因為資源分配給脅迫抗性機制，不能進入生長。這種影響是暫時性的，因為到發育後期，alx8和fryl-Ι的蓮座乾重與其相應的野生型相似。對於alx8和fryl_l突變體，在代謝物中觀察到的差異在正常生長條件下已經存在，表明對乾旱的預適應。突變體的這種預適應不影響植物在水分充足條件下的水分平衡。在葉片水勢或相對水含量上未見到差異。alx8和Col-O野生型之間在這些條件下還存在相似的氣孔開度，如碳歧視和表皮葉片剝落所示。因為在這些條件下alx8和Col_0野生型之間的光合作用速率相似，所以alx8的發育延遲可能是由於資源的重新分配和生長抑制途徑的活化，而不是資源匱乏。SALl中喪失功能的突變導致與野生型植物相比，在無脅迫生長條件下，>1000個基因上調和500-1000個基因下調。SALl作為脅迫和發育中的基因表達調控子的作用再次由其在翻譯後基因沉默中的負作用(Gy等，(2007),PlantCell,tpc.107.055319)和SALl突變體的形態和開花時間變化而得到證實。事實上，在alx8中受到差異調控的2447個基因中只有7.6%劃分為脅迫響應基因(未給出數據)，並且其中大部分都不受ABA的誘導。這表明不是所有的脅迫響應途徑在無脅迫生長條件下在alx8中都是組成型活化的。例如，在無脅迫葉片中，APX2、RAP2.6、sHSP和DREB2A誘導倍數在2和20倍之間，但是高光脅迫(HL)導致相同基因的25至700倍誘導，證明調控這些基因的其它途徑為脅迫誘導型(Rossel等，2006)。第二，脫水響應的RD22的表達由ABA上調(Yamaguchi-Shinozaki等，(1992)，PlantandCellPhysiology，33，217-224)，並且這種誘導部分依賴於轉錄因子MYC2，其過量表達時會導致RD22的組成型誘導(Abe等，(1997)，PlantCell，9，1859-1868；Abe等，(2003),PlantCell，15，63-78)。然而在alx8中，除了MYC2表達增加8.2倍之外，RD22的表達下調3.7倍。相似地，沒有ADHl或KIN2/COR6.6的顯著誘導，其已經表現為ABA響應型和受MYC2調節(Abe等，2003)。這表明為完全活化脅迫響應，除了alx8和fryl中組成型活化的與ABA無關的途徑之外，還需要多個途徑之間的互相作用。在已知的脅迫響應轉錄因子中，在無脅迫條件下alx8中一個小子集顯著上調，包括兩個鋅指轉錄因子，ZATlO和ZAT12。ZATlO和ZAT12都參與非生物脅迫響應途徑比如乾旱和高光(Sakamoto等，(2004)，PlantPhysiology，136，2734-2746;Davletova等，(2005),PlantPhysiology，139，847-856;Rossel等，(2007)，ThePlantCell,10.1105/tpc.1106.045898)。ZAT10的過量表達誘導的APX2表達，並且使HL中18%的基因上調(Rossel等，2007)。相應地，alx8中24.6%的基因也由HL誘導上調，進一步突出了乾旱和HL脅迫響應網絡之間存在重疊。SALl在維管組織中的高水平表達(Xiong等，2001)，表明其在乾旱脅迫過程中具有信號轉導的作用。這種定位和在維管束鞘所見到的H2O2生產與抗氧化酶表達的增加以應對其它非生物脅迫如HL有關(Karpinski等，(1999),Science,284,654-657；Rossel等，2007)。此外，APX2和ZAT10表達主要集中在維管，這可以說明SALl在相似的ROS介導的響應調控中的作用。乾旱誘導ABA的增加，並且通常限速ABA生物合成酶NCED3和NCEDl表達相應增加(Iuchi等，(2001)，PlantJournal，27，325-333)。然而這些基因在alx8中未上調，基因的下調也和ABA分解代謝無關，事實上分解代謝酶CYP707A1-4上調(未給出數據)。因此，alx8中ABA含量的增加(Rossel等2006)未表現出受轉錄調節。與野生型相比，fryl-Ι中大多數上調(66%)和下調(53%)基因在alx8中共表達。然而，alx8和fryl-Ι之間的基因表達和代謝譜有差異，它們都在相同的基因中發生功能喪失的突變，因此這個結果很有趣。C24和Col-O具有獨特儘管相似的代謝譜，並且因此生態型差異微妙地改變SALl的作用和其喪失對每個生態型的影響。在這些研究中另一個有趣的觀察結果是研究的SALl突變體相對於野生型植物的開花時間延遲，並且這與開花的負調控子C0NSTANS-LIKE9(C0L9)的強烈上調相關聯。這可以用於農業的很多方面中，包括牧場植物開花延遲(並且因此，通常衰老)，產生生長期延長的植物，其可以獲得更高產量或者更大的部位(比如花、莖、葉、塊莖等)。增加植物中SALl的表達可以具有相反的作用。結論SALl突變體在長時間乾旱後的存活率比野生型植物高40-50%，並且雖然發育發生了改變，但是完全成熟的植物中葉片和莖的生物量未變。不希望受到理論的束縛，我們假設SALl蛋白質在調控形態、生理和分子變化的途徑中有負調控作用，其獲得導致脅迫網絡誘導加強。結果增強了對乾旱的耐受性而不是不做響應。這可以由一定程度的預適應說明，比如脅迫響應基因如抗氧化APX2的組成型上調，滲透壓保護劑如多胺和糖的積累，和無脅迫條件下脫落酸的積累。因此，SALl表現出可負調節抗旱性並且因此，突變體在水脅迫下保持完全的膨脹和水勢。應理解的是，儘管本文為闡述目的而描述了本發明的特定實施方式，但是在不偏離如下述權利要求所定義的本發明的精神和範圍的情況下可以作出各種修正。權利要求用於獲得相對於野生型植物脅迫抗性提高的植物的方法，其包括(a)將至少一個突變或外源性核酸導入一個或多個植物細胞的基因組中，所述至少一個突變或外源性核酸使所述一個或多個植物細胞中與SAL1或其同源物有關的活性降低；(b)從所述一個或多個植物細胞再生一個或多個植物；和(c)選擇相對於野生型植物脅迫抗性提高的一個或多個植物。2.如權利要求1所述的方法，其中通過使所述一個或多個植物細胞受化學或物理誘變方法或插入突變方法如轉座子或T-DNA的作用而導入所述至少一個突變。3.如權利要求1所述的方法，其中通過重組方法導入所述至少一個突變。4.如權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述方法包括向SALl基因或其同源物中導入至少一個突變，或者抑制或阻抑SALl基因或其同源物的表達。5.如權利要求4所述的方法，其包括向所述一個或多個植物細胞中編碼SALl或其同源物的核苷酸序列中導入突變。6.如權利要求5所述的方法，其中所述突變包括一個或多個核苷酸的插入、缺失或替代。7.如權利要求5所述的方法，其中所述突變包括在SEQIDNO1的核苷酸731至745、1226、1518、1519和1690的區域中，或在SEQIDNO:1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置處的一個或多個核苷酸的插入、缺失或替代。8.如權利要求5或6所述的方法，其中所述突變包括在SEQIDNO=I的位置1226處，或在SEQIDNO:1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置處的由鳥嘌呤至腺嘌呤的突變。9.如權利要求8所述的方法，其中所述突變導致SEQIDNO2的位置217處發生由甘氨酸至天門冬氨酸的胺基酸變化。10.如權利要求5或6所述的方法，其中所述突變包括在SEQIDNO:1的位置734和735之間，或在SEQIDNO=I的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置處插入一個或多個核苷酸。11.如權利要求5或6的方法，其中所述突變包括用一個或多個核苷酸替代SEQIDNO1的核苷酸735-745，或SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同的核苷酸。12.如權利要求5或6的方法，其中所述突變包括在SEQIDNO=I的位置1518和1519之間或包含位置1518和1519，或在SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置處插入一個或多個核苷酸。13.如權利要求10至12中任一項的方法，其中所述一個或多個插入或替代的核苷酸包括T-DNA插入。14.如權利要求5或6所述的方法，其中所述突變包括在SEQIDNO=I的位置731處，或在SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置處由胞嘧啶至胸腺嘧啶的突變。15.如權利要求5或6所述的方法，其中所述突變包括在SEQIDNO=I的位置736處，或在SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置處由鳥嘌呤至腺嘌呤的突變。16.如權利要求5或6所述的方法，其中所述突變包括在SEQIDNO1的位置1690處，或在SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置處由鳥嘌呤至腺嘌呤的突變。17.如權利要求5或6所述的方法，其中所述突變是SALl無效突變。18.如權利要求4所述的方法，其包括向所述一個或多個植物細胞導入阻抑內源性SALl蛋白質或其同源物的表達的外源性核酸。19.如權利要求18所述的方法，其中所述外源性核酸包括與內源性SALl-編碼序列或其同源物的至少一部分同源或互補的核酸序列。20.如權利要求18或19的方法，其中所述外源性核酸與脅迫誘導啟動子可操作地連接。21.如權利要求4所述的方法，其包括向所述一個或多個植物細胞導入用外源蛋白質的表達替代內源性SALl蛋白質或其同源物的表達的外源性核酸。22.如權利要求1至21中任一項所述的方法，其中所得到的植物相對於野生型植物對乾旱、鹽、溫度脅迫或光脅迫、或它們的組合的抗性提高。23.如權利要求22所述的方法，其中所得到的植物相對於野生型植物至少抗旱性提高。24.如權利要求1至23中任一項所述的方法，其中所述植物選自傘形科、紫菀科、十字花科、藜科/莧科、菊科、葫蘆科、蝶形花科、禾本科、豆科、早熟禾科、薔薇科或茄科。25.如權利要求24所述的方法，其中所述植物是十字花科的成員。26.由權利要求1至25中任一項所述的方法獲得的相對於野生型植物脅迫抗性提高的植物。27.如權利要求26所述的植物，其相對於野生型植物對乾旱、鹽、溫度脅迫或光脅迫、或它們的任何組合的抗性提高。28.如權利要求27所述的植物，其相對於野生型植物至少抗旱性提高。29.如權利要求26至28中任一項所述的植物，其中所述植物選自傘形科、紫菀科、十字花科、藜科/莧科、菊科、葫蘆科、蝶形花科、禾本科、豆科、早熟禾科、薔薇科或茄科。30.如權利要求29所述的植物，其中所述植物是十字花科的成員。31.如權利要求1至25中任一項所述的方法，其中得到的植物開花時間延遲。32.用於獲得相對於野生型植物開花時間改變的植物的方法，所述方法包括(a)將至少一個突變或外源性核酸導入一個或多個植物細胞的基因組中，所述至少一個突變或外源性核酸使所述一個或多個植物細胞中與SALl或其同源物有關的活性改變；(b)從所述一個或多個植物細胞再生一個或多個植物；和(c)選擇相對於野生型植物開花時間改變的一個或多個植物。33.如權利要求33的方法，其中所述至少一個突變或外源性核酸導致與SALl或其同源物有關的活性降低，並且所述方法導致植物開花時間延遲。34.如權利要求31至33中任一項所述的方法，其中所述開花時間延遲約7天至約100天。35.由權利要求31至34中任一項所述的方法獲得的相對於野生型植物開花時間改變的植物。36.由權利要求31至34中任一項所述的方法獲得的相對於野生型植物開花時間延遲的植物。37.如權利要求1至25中任一項所述的方法，其中所得到的植物葉片表型發生變化。38.用於獲得相對於野生型植物葉片表型變化的植物的方法，所述方法包括(a)將至少一個突變或外源性核酸導入一個或多個植物細胞的基因組中，所述至少一個突變或外源性核酸使所述一個或多個植物細胞中與SALl或其同源物有關的活性降低；(b)從所述一個或多個植物細胞再生一個或多個植物；和(c)選擇相對於野生型植物葉片表型改變的一個或多個植物。39.如權利要求37或38所述的方法，其中所述改變的葉片表型包括更厚葉、更短葉、更圓葉、具有更多淺裂葉緣的葉子，或具有選自下組的兩種或多種改變的表型變化的葉片更厚葉、更短葉、更圓葉和淺裂葉緣葉。40.如根據權利要求37至39中任一項所述的方法獲得的相對於野生型植物葉片表型發生變化的植物。41.如權利要求26至30、36或40中任一項所述的植物中得到的植物部位或突變/轉基因種子。42.用於篩選植物的方法，所述植物中存在編碼SALl或其同源物的核苷酸序列的至少一個突變等位基因，所述方法包括使用至少一個適合作為探針或引物的核酸分子分析植物DNA，所述探針或引物能在嚴格條件下與SALl基因或其同源物雜交。43.如權利要求42所述的方法，包括使用適於擴增SALl基因或其同源物的區域的至少一個寡核苷酸引物對，所述引物對包括檢測所述區域中是否存在突變的正向引物和反向引物。44.如權利要求43所述的方法，其中所述區域包含完整的SALl基因或其同源物。45.如權利要求43所述的方法，其中所述區域包含SALl基因或其同源物的一部分。46.如權利要求45所述的方法，其中所述區域包含外顯子3、外顯子3和4之間的內含子、外顯子5、外顯子5和6之間的內含子和外顯子6和7之間的內含子、或它們的任何組I=Iο全文摘要本發明提供用於獲得植物的方法，所述植物相對於野生型植物具有更高的脅迫抗性，方法包括(a)將至少一個突變或外源性核酸導入一個或多個植物細胞的基因組中，所述至少一個突變或外源性核酸使所述一個或多個植物細胞中與SAL1或其同源物有關的活性降低；(b)從所述一個或多個植物細胞再生一個或多個植物；和(c)選擇相對於野生型植物的脅迫抗性提高的一個或多個植物。文檔編號C12N15/00GK101802190SQ200880103295公開日2010年8月11日申請日期2008年6月19日優先權日2007年6月20日發明者巴裡·J·波格森,簡·B·羅塞爾,菲利帕·B·威爾遜申請人:澳大利亞國立大學