產表柔紅黴素的天藍淡紅鏈黴菌基因工程菌及其製備方法

2023-05-30 17:53:26

專利名稱：產表柔紅黴素的天藍淡紅鏈黴菌基因工程菌及其製備方法
技術領域：
本發明屬於基因工程技術領域，特別涉及一種高產表柔紅黴素的天藍淡紅鏈黴菌 的基因工程菌及其製備方法和所用的重組載體和轉化體。
背景技術：
柔紅黴素以及以其為原料合成的阿黴素(doxorubin)、表阿黴素(印irubicin)是 目前臨床上十分重要的抗腫瘤蒽環類抗生素。表阿黴素的心臟毒性和骨髓毒性比阿黴素更 低，而抗腫瘤的效果相當或更高。表柔紅黴素(印i-daimorubicin)是工業生產表阿黴素的 重要前體，其與柔紅黴素的差別僅在於分子中脫氧糖C4位羥基構型不同。由化學合成法 從柔紅黴素到表柔紅黴素需要經過多步條件要求苛刻的反應過程，並會造成環境汙染。如 果採用微生物發酵方法直接生產將會大大節約成本，提高效率。若要柔紅黴素的產生菌改 造成可以直接在體內合成表柔紅黴素的菌株，需要改變TDP-L-柔紅糖胺的生物合成過程 中的一個步驟。其中dnmV為TDP-6-脫氧糖C4酮基還原酶，它決定了菌株分子中脫氧糖 C4位羥基構型反應，使其生成柔紅黴素。阿韋菌素酮基還原酶即ave BIV的與dnmV的立 體選擇性正好相反。威斯康辛大學的Hutchinson教授將aveBIV基因，導入柔紅黴素產生 菌(波賽鏈黴菌)，並中斷柔紅糖胺的產生，構建的工程菌產生表柔紅黴素(Krishnamurthy Madduri，Jonathan Kennedy，Giovanni Rivola,et al. Production of the antitumor drug epirubicin(4 ' _epidoxorubicin)and its precursorby a genetically engineered strain of Streptomyces peucetius [J]. NatureBiotechnology, 1998,16 :69_74)。而本申 請人之前在產柔紅黴素天藍色鏈黴菌SIPI-1482中，中斷了柔紅糖胺生物合成基因dnmV， 插入了 aveBIV基因和阿伯拉黴素(又名安普黴素)的抗性基因，構建了表柔紅黴素產生菌 (中國專利申請200610146614. 6)。這種方法構建的工程菌產表柔紅黴素產量較低，經過我 們驗證其發酵產量不超過20mg/L，且不穩定，連續傳代2次以上發酵單位就有明顯的降低。

發明內容
因此，本發明要解決的技術問題就是針對現有的生產表柔紅黴素的天藍淡紅鏈黴 菌的基因工程菌表柔紅黴素產量不高，遺傳穩定性低的不足，提供一種改良的生產表柔紅 黴素的天藍淡紅鏈黴菌基因工程菌，該菌表柔紅黴素產量大大高於現有的表柔紅黴素生產 菌，並且傳代非常穩定。本發明還提供該生產表柔紅黴素的天藍淡紅鏈黴菌的基因工程菌 的製備方法和所用的重組載體和轉化體。本發明人經過仔細研究和反覆試驗發現，生產表柔紅黴素的天藍淡紅鏈黴菌的基 因工程菌中的外來插入基因包括抗生素抗性基因和aveBIV基因。抗生素抗性基因有2kb的 長度，是篩選標記，aveBIV基因是使天藍淡紅鏈黴菌產生表柔紅黴素的基因，外來插入基因 片段過大，影響了工程菌的遺傳穩定性和表柔紅黴素的產量。因此，本發明人將外來基因改 變為僅由aveBIV基因及其啟動子組成，沒有加入抗生素抗性基因，大大減小外來基因的長 度。在此基礎上，本發明還發現，通過接合轉移轉入含有啟動子和aveBIV基因的整合質粒，使紅黴素啟動子和aveBIV基因隨機整合到整個基因組上，倍增了紅黴素啟動子和aveBIV 基因，從而可以篩選到表柔紅黴素產量進一步增高的突變菌株。本發明人還發現，在基因工 程菌的製備中增加同源重組雙交換的交換臂長度可以大大增加雙交換的頻率，篩選雙交換 子的工作量大大減小，從而快速的完成了本發明。本發明解決上述技術問題所採用的技術方案之一是一種生產表柔紅黴素的天藍 淡紅鏈黴菌的基因工程菌，其是一種在天藍淡紅鏈黴菌野生菌株的dnmV基因中插入或者 置換為包含aveBIV基因的第一外源基因，使dnmV基因被阻斷而表達aveBIV(阿維菌素酮 基還原酶)的基因工程菌，其中，該基因工程菌的基因組中還整合著第二外源基因，所述的 第一外源基因和第二外源基因都是啟動子和aveBIV基因的連鎖片段。根據本發明，所述的啟動子較佳的是紅黴素啟動子，更佳的所述的啟動子的核苷 酸序列是序列表中SEQ ID NO. 1的第1525 2198位所示的核苷酸序列。所述的aveBIV基 因又稱阿維菌素酮基還原酶基因。所述的aveBIV基因的核苷酸序列較佳的是如序列表中 SEQ ID NO. 1的第2199 3492位所示。所述的dnmV基因又稱胸腺嘧啶核苷二磷酸_6_脫 氧糖C4酮基還原酶基因。根據本發明，所述的第一外源基因插入於天藍淡紅鏈黴菌野生菌株的dnmV基因 中，或者與dnmV基因中的DNA片段置換。所述的天藍淡紅鏈黴菌野生菌株的dnmV基因序列 被外來基因置換的部分最大長度可以是整個dnmV基因，較佳的是dnmV基因的第273位 675位之間的核苷酸片段被置換掉。因此，dnmV基因被阻斷而不能表達。而插入的第一外 源基因，即啟動子和aveBIV基因的連鎖片段可以表達，從而使該被改造了的天藍淡紅鏈黴 菌可以產生表柔紅黴素。根據本發明，所述的第二外源基因整合於本發明的天藍淡紅鏈黴菌基因工程菌的 基因組中。在基因組中的整合位置是在基因組的任何位置，只要不影響菌株本身的生物合 成，能夠高產表柔紅黴素的情況，都在本發明的保護範圍之內。根據本發明，所述的天藍淡紅鏈黴菌野生菌株較佳的選用國內工業用菌株——天 藍淡紅鏈黴菌(Streptomyces coeruleorubidus) SIPI-1482。本發明先構建了一種重組穿梭質粒，其含有由在天藍淡紅鏈黴菌基因組中與dnmV 基因連鎖的上遊基因或其片段、dnmV基因5』端片段、啟動子、aveBIV基因、dnmV基因3』端 片段、以及在天藍淡紅鏈黴菌基因組中與dnmV基因連鎖的上遊基因或其片段依次連鎖組 成的DNA片段。在野生型天藍淡紅鏈黴菌中，基因dnmZ、dnmU、dnmV、dnmj和dnml依次連 鎖表達，dnmZ和dnmU在dnmV的上遊，dnmj和dnml在dnmV的下遊，該連鎖基因的核苷酸 序列已公開(GenBank登錄號AF006633)。本發明的重組穿梭載體中含有的重組片段較佳 的則是在上述連鎖序列的dnmV基因序列中插入或者由部分dnmV基因序列置換成啟動子 和aveBIV基因的序列。dnmV基因中被置換序列的長度最大可以是整個dnmV基因，較佳的 是dnmV基因中間的核苷酸序列。也就是說，本發明的重組穿梭載體含有的重組DNA序列較 佳的是由dnmZ基因或其片段、dnmU基因、在天藍淡紅鏈黴菌基因組中與dnmU基因連鎖的 dnmV基因片段、啟動子、aveBIV基因、在天藍淡紅鏈黴菌基因組中與dnmj基因連鎖的dnmV 基因片段、dnmj基因和dnml基因或其片段依次連鎖組成的DNA片段。本發明中所述的啟 動子較佳的是紅黴素啟動子。較佳的，所述的重組穿梭載體中含有的重組片段，即所述的依 次連鎖組成的DNA片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示。其中第1 617位核苷酸序列是所述的dnmZ基因片段；第618 1251位核苷酸序列是所述的dnmU基因；第 1252 1524位核苷酸序列是所述的在天藍淡紅鏈黴菌基因組中與dnmU基因連鎖的dnmV 基因片段；第1525 2198位核苷酸序列是所述的紅黴素啟動子；第2199 3492位核苷 酸序列是所述的aveBIV基因；第3493 3741位核苷酸是所述的在天藍淡紅鏈黴菌基因 組中與dnmj基因連鎖的dnmV基因片段；第3742 4855位核苷酸是所述的dnmj基因；第 4856 5028位核苷酸是所述的dnml基因。本發明構建的重組穿梭質粒可用於與天藍淡紅鏈黴菌基因組發生同源雙交換，從 而得到生產表柔紅黴素的天藍淡紅鏈黴菌的基因工程菌。其中，在該重組穿梭載體中，所述 的dnmZ、dnmU和與dnmU連鎖的dnmV片段的部分是發生同源重組雙交換的左臂；與dnmj連 鎖的dnmV片段、dnmj和dnml的部分是發生同源重組雙交換的右臂。啟動子和aveBIV基 因的部分是發生重組雙交換時導入的外來基因。所述的左臂的長度可以是500 2000bp， 較佳的是1525bp，即序列表中SEQ ID NO. 1第1 1524位所示的序列。所述的右臂的長度 可以是500 2000bp，較佳的是1536bp，即序列表中SEQ IDN0. 1第3293 5028位所示的 序列。根據本發明，所述的重組穿梭質粒的骨架較佳的是質粒pKC1139。將所述的重組穿梭質粒轉化宿主細胞，得到轉化子。所述的宿主細胞較佳的是大 腸桿菌ET12567。將該轉化子和天藍淡紅鏈黴菌接合，挑選同源雙交換接合子。所述的天藍 淡紅鏈黴菌較佳的是天藍淡紅鏈黴菌SIPI-1482。該同源雙交換接合子即dnmV基因中插入 了 aveBIV基因的天藍淡紅鏈黴菌突變株。本發明解決上述技術問題所採用的技術方案之二是一種重組載體，其含有啟 動子和aveBIV基因的連鎖片段。根據本發明，所述的重組載體的載體骨架較佳的是質粒 PSET152。所述的啟動子較佳的是紅黴素啟動子(ErmP)。所述的啟動子和aveBIV基因的連 鎖片段的核苷酸序列較佳的如序列表中SEQ ID NO. 1第1525 3492位所示。本發明解決上述技術問題所採用的技術方案之三是一種轉化子，其含有所述的 重組載體。根據本發明，所述的轉化子的宿主細胞較佳的是大腸桿菌ET12567。本發明解決上述技術問題所採用的技術方案之四是一種製備生產表柔紅黴素的 天藍淡紅鏈黴菌的基因工程菌的方法，其中，包括將如上所述的轉化子與產表柔紅黴素的 天藍淡紅鏈黴菌接合，挑選接合子。用阿伯拉黴素篩選，能長出的就是質粒已經整合在基因 組上的接合子。根據本發明，所述的產表柔紅黴素的天藍淡紅鏈黴菌較佳的是基因組中的 dnmV基因中插入了 aveBIV基因的天藍淡紅鏈黴菌突變株。所得的接合子即本發明的生產 表柔紅黴素的天藍淡紅鏈黴菌的基因工程菌，其基因組中整合著2個外源基因，這兩個外 源基因都是啟動子和aveBIV基因的連鎖片段。所述的產柔紅黴素的天藍淡紅鏈黴菌較佳 的是天藍淡紅鏈黴菌(Streptomyces coeruleorubidus) SIPI-1482。本發明所述的天藍淡紅鏈黴菌的基因工程菌可用於生產表柔紅黴素。因此，本發 明還提供一種製備表柔紅黴素的的方法，包括培養本發明上述天藍淡紅鏈黴菌的基因工程 菌，從培養物中獲得表柔紅黴素。本發明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比於現有技術，本發明的有益效果如下本發明將產柔紅黴素的天藍色淡紅鏈 黴菌進行改造，一方面敲除了其中的部分dnmV基因，置換入aveBIV基因，通過基因置換法得到了生產的表柔紅黴素的工程菌；另一方面，通過隨機互補法，將另一個aveBIV基因整 合入基因組中，從而在最低限度影響菌株本身生物合成的情況下2次轉入aveBIV基因，從 而使得表柔紅黴素的產量又有了很大的一個提高。本發明所構建的工程菌，不含有任何抗 性標記，很方便用於進一步的基因工程改造。本發明所構建的工程菌，表柔紅黴素產量遠遠 大於現有的方法，最好可達70mg/L。本發明所構建的工程菌，通過連續傳代，表柔紅黴素產 量非常穩定，重複性好。在本發明的製備方法中，增加了雙交換雙臂的長度。中國專利申請 200610146614. 6公開的方法中，交換雙臂的長度是700bp，本發明的優選方案中交換雙臂 的長度是1500bp，增大了雙交換發生的機率，加快雙交換接合子的篩選。本發明採用PCR來 篩選突變株，解決了插入抗性基因作為篩選標記(例如阿伯拉黴素抗性基因)，插入外來基 因片段過大所帶來的影響上下遊基因的轉錄的問題，從而保持剩下的dnmV基因的兩端的 鹼基和編碼胺基酸不變，最大限度的減少中斷dnmV和插入aveBIV基因對上下遊的基因的 影響，大大增加了菌株的穩定性，提高了表柔紅黴素產量。


以下結合

本發明的特徵和有益效果。圖1是含aveBIV基因的重組質粒的構建示意圖。圖2是定點插入質粒的構建示意圖。圖3是表柔紅黴素生產菌的構建策略示意圖。圖4是PCR驗證的電泳圖。M，marker ;1，雙交換基因型；2，回復基因型。圖5是產表柔紅黴素的工程菌的發酵液的HPLC分析圖譜。圖 6 是 PCR 驗證的電泳圖。M，marker ； 1，ErmP+aveBIV。
具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明並不受其限制。下列實施例中未注 明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例中所述 的「室溫」是指進行試驗的操作間的溫度，一般為25°C。所使用的工具酶和DNA分子量標記均購自寶生物公司(Takara)，具體的反應條件 和使用的方法均參考商品說明書所使用的膠回收試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術有限責任公司，使用方法 參考商品說明書。大腸桿菌E. coli DH5a、ET12567，購自上海鼎國生物技術有限責任公司。天藍淡紅鏈黴菌SIPI-1482可從上海醫藥工業研究院取得。實施例1雙交換左右臂與aveBIV序列的克隆在天藍淡紅鏈黴菌SIPI-1482中，dnmZ和dnmU依次在dnmV的上遊，dnmj和dnml 依次在dnmV的下遊，本發明取dnmZ、dmnU加一部分dmnV作為雙交換的左臂，dnml、dnmj加 一部分dmnV作為雙交換的右臂來構建雙交換質粒。首先根據已經發表的天藍淡紅鏈黴菌 SIPI-1482相應序列(GenBank登錄號AF006633)設計引物左臂上遊引物為5，-AAAAAGCTTCTGGGACGGAATGGGC-3，，左臂下遊引物為5，-AAATTCGAATCGCACCAGTCGCAGATG-3，；
右臂上遊引物為5，-AAATCTAGAGGGCTGGTCGTCAACATC-3，，右臂下遊引物為5，-AAAGGATCCCATCAAACTCCGCAAGACAT-3，。上述引物由上海英駿生物技術有限公司合成。以天藍淡紅鏈黴菌SIPI-1482的 總基因組為模板。使用寶生物公司的primer star高保真DNA聚合酶來進行片段的克隆。 PCR條件為98°C，10s、66°C，15s、72°C，2min。PCR產物上樣電泳後，回收目的條帶。回收 的片段與質粒進行連接，左臂PCR產物聯入質粒PSP72 (購自上海生工生物工程技術服務 有限公司)，接入位點Hindlll和Xbal，命名為pSL-02-3-1並測序；右臂PCR產物聯入質 粒pSP72，接入位點Xbal和EcoRV，命名為pSL_R15，並測序。左臂序列與GenBank登錄號 AF006633中的相應序列比對為97. 4%的同源性，右臂序列與編號AF006633中的相應序列 比對為99. 3%的同源性。在PubMed上查到aveBIV的基因序列，設計相應的引物上遊引物5』-AAAAGATCT GCACGGGTCAACGGGTAA-3，，下遊引物5，-AAAAGATCTTGATGTCGAGCGGCTACG-3，。以阿維鏈黴 菌S. avermitilis (購自ATCC公司)的總DNA為模板，用primer star高保真DNA聚合酶 擴增得到aveBIV的基因。aveBIV基因連入質粒pSP72，連接位點Bglll和Bglll，得到質粒 pSL-02-20-l。以紅黴素生產菌株S. erythraea HL 3168E3 (購自ATCC公司)的基因組為模板，上 遊引物 5，-AAATCTAGAAGCCCGACCCGAGCA-3，，下遊引物 5，-AAAAAGCTTTCCGGAGGTCGCACC-3，， 進行PCR，所得PCR產物純化後連接在質粒pGEM-3zf (購自上海生工)上，得到質粒 pSL-HM-312,即含有紅黴素啟動子的重組載體。用限制性內切酶EcoRI和BamHI從質粒 pSL-HM-312切得紅黴素啟動子，把紅黴素啟動子連入質粒pSET152(購自上海生工生物 工程技術服務有限公司)得到pSL-02-18-1，接入位點為EcoRI和BamHI。用Bglll從 pSL-02-20-1切的aveBIV基因正向連入pSL-02-18-1，此質粒即為插入紅黴素啟動子和 aveBIV結構基因的pSET152隨機整合質粒，命名為pSL-02-22_l。設計併合成PCR引物，上 遊引物為 5，-AAATCTAGAGGTACCAGCCCGACCCGAGC-3，，下遊引物為 5，-AAATCTAGATGATGTCGAG CGGCTACG-3，。以質粒pSL-02-22-l為模板，擴增出紅黴素啟動子和aveBIV基因連鎖的DNA 片段(ErmEP+aveBIV基因)，聯入質粒pSP72，接入位點Xbal和Xbal，得到重組質粒，命名 為pSL-02-26-1，測序，所得aveBIV基因的核苷酸序列見序列表中SEQ ID NO. 1第2199 3492位所示，與NCBI資料庫中的的aveBIV基因序列(序列登錄號AB032523)比對的同源 性為100%，質粒構建過程見圖1。實施例2雙交換定點插入質粒的構建、接合轉移實施例1中的右臂聯入質粒pKC1139(購自上海生工生物工程技術服務有限公 司公司)，接入位點Xbal和EcoRV，得到質粒，命名為pSL-02-7-1。左臂正向聯入質粒 pSL-02-7-1，接入位點Hindi 11和Xbal，得到質粒，命名為pSL-02-12-l。採用限制性內切酶 Xbal從實施例1中的pSL-02-26-1質粒中切出ErmEP+aveBIV基因正向聯入pSL-02_12_l 中，此質粒即為雙交換敲除dmnV，同時定點插入aveBIV的表柔紅黴素表達整合質粒。用此 質粒轉化大腸DH5 a，調取轉化子在LB中培養，提取質粒進行酶切和PCR驗證，最終構建成 雙交換定點插入質粒，命名為pSL-02-30-1。構建策略見圖2。從天藍淡紅鏈黴菌SIPI-1482斜面挑取適量菌體於50ml TSB培養基中培養56小 時左右達到對數生長期，(v/v)接種量轉接於50ml TSB培養基中培養48小時左右使菌體達到對數生長後期，離心倒去上清得到菌絲體，菌絲體用20ml的LB液體培養基洗滌2次 (4000rpm, IOmin, 4°C )，最後重懸於20ml LB培養基中，待用。用pSL-02-30-l轉化感受態 大腸桿菌ET12567，挑轉化子至裝有4ml LB培養基[含阿伯拉黴素(Am) 100 μ g/ml、卡那黴 素(Kn)25yg/ml、氯黴素(Cm) 100 μ g/ml]的小試管中，37°C振蕩培養12小時。大腸桿菌 ET12567接種於裝有50ml LB培養基的250ml三角瓶中，37°C振蕩培養4小時左右，使菌液 OD值在0. 4 0. 6之間，將菌液移入50ml的無菌塑料離心管，離心(4000rpm, IOmin, 4°C )， 倒去上清，菌體用20mlLB培養基洗滌2次(4000rpm，10min,4°C )，最後重懸於1 2ml LB 培養基中。將該大腸菌液與之前待用的天藍淡紅鏈黴菌SIPI-1482菌絲體以1 1(重懸 液體積比)於EP管中混勻。將混合菌液塗MS平板，用塗棒充分混勻菌液，30°C恆溫箱培 養。培養20小時後，取出平板，塗抗生素，用量為每10個平板塗IOml雙蒸水、100 μ 1 Am和 400μ1萘啶酸(NC)的混合液，再於30°C恆溫箱培養。培養一周後出現接合子。表柔紅黴 素產生菌的構建過程見圖3。實施例3雙交換工程菌的篩選挑取實施例2所得的接合子於裝有4ml TSB培養基的小試管中(含Am50 μ g/ml、 試管中加入2 3粒直徑2 5毫米的玻璃珠)，30°C振蕩培養。菌液搖濃後，取1 μ 1菌液 稀釋於Iml無菌水中，混勻後取100 μ 1塗含Am 50 μ g/ml的高氏一號平板，37°C培養。因 為PKC1139質粒是溫敏型質粒，只有整合到染色體上才能存活，所有出來的整合子已經發 生過同源重組交換。4至5天後，挑取整合子於無抗生素的TSB培養基中培養，連續傳代， 促使其發生雙交換。取第3代菌液1 μ 1，稀釋於IOml的無菌水中，混勻後取100 μ 1塗高 氏一號平板(無抗性)，30°C培養。4至5天後，出現單菌落，挑取同一個單菌落分別在有抗 性與無抗性的平板上培養，篩選無抗性平板生長，而抗性平板不生長的菌落，得到30個菌 落。在無抗性平板生長而在抗性平板不生長的克隆就是發生雙交換或者回復的克隆。挑取 菌落在液體TSB培養基中培養，然後抽提其總DNA。在左右臂上設計相應的引物，上遊引物 5，-ACGGGTGGGACGTGCAC-3，，下遊引物5，-CACATGCTGTGGACGGAG-3，，進行 PCR 驗證。PCR 產 物的電泳圖見圖4。擴增出SOObp的片段的是回復型的野生菌株基因組，擴增出2400bp的 片段的是雙交換突變株基因組。我們從30個菌落中篩選到6個雙交換突變株，雙交換發生 機率很高。實施例4產表柔紅黴素的工程菌的發酵驗證挑取實施例3中能擴增出2400bp片段的雙交換突變株於高氏一號斜面30°C培養， 培養15天後，接種於種子培養液(澱粉2. O,玉米粉2. O,葡萄糖1. 0，麩皮1. 0，麩質粉1. 0， MgSO4O. 1，K2HP040. l(g/100ml))。種子培養液培養2天後轉接於發酵培養基(玉米粉7.0，葡 萄糖 1. 0，麩皮 1. 0，麩質粉0. 75，K2HPO4O. 01，(NH4)2SO4O. 1)，接種量 10% (v/v)。30°C，220r/ m培養5天後放瓶，發酵液用草酸調pH值至5左右，再加2倍體積的丙酮混勻浸泡5小時以 上，離心後取上清做HPLC分析。HPLC條件，流動相0. (ν/ν)甲酸的乙腈0.1% (ν/ ν)甲酸的水溶液=72 28，流速lml/min，柱溫35°C，檢測波長254nm，進樣量5μ 1，分 析柱Agilent ClS0 HPLC分析結果見圖5，可見通過雙交換定點插入的工程菌，發酵產物 中已經不存在柔紅黴素組分，而表柔紅黴素的濃度在45mg/L左右。實施例5aveBIV整合質粒轉入aveBIV置換dnmV的表柔突變株(1)用隨機整合質粒pSL-02-22-1轉化大腸桿菌ET12567感受態細胞，挑轉化子至4ml LB (AmlOO u g/ml, Kn25 u g/ml, CmlOO u g/ml)的小試管中 37°C振蕩培養 12 小時，然後 按2% (v/v)的接種量轉接於50ml LB的250ml三角瓶，37°C振蕩培養4小時左右，使菌液 0D值在0. 4 0. 6之間，將菌液移入50ml的無菌塑料離心管，離心(4000rpm, lOmin, 4°C )， 倒去上清，菌體用20ml LB洗滌2次(4000rpm，10min,4°C )，最後重懸於1 2ml LB中，備用。(2)挑取實施例3中所得的能擴增出2400bp片段的雙交換突變株於高氏一號斜 面，30°C培養15天後，從斜面挑取適量菌體於50ml TSB中培養56小時左右達到對數生長 期，按(v/v)的接種量轉接於50ml TSB培養48小時左右使菌液達到對數生長後期，離 心倒去上清得到菌絲體，菌絲體用20ml的LB液體洗滌2次(4000rpm，lOmin, 4°C )，最後重 懸於20ml LB，備用。(3)將步驟(1)中所得備用的大腸菌液與步驟(2)中所得備用的菌絲體按重懸液 體積比1 1於EP管中混勻。將混合菌液塗MS平板，用塗棒充分混勻菌液，30°C恆溫箱培 養。培養20小時後，取出平板，塗抗生素仏11150118/111(奈啶酸)50118/1111)，再於301 恆溫箱培養。培養一周後長出的菌落即為接合子。NC是抗大腸桿菌的，所以所得菌落不可 能是質粒pSL-02-22-1隨機整合大腸桿菌的轉化子，而雙交換突變株是不能在Am抗性下存 活的，所以經過Am和NC的篩選就得到了目的接合子。實施例6突變株總DNA的抽提以及基因型的驗證挑取接合子於液體TSB培養中(Am 50 u g/ml)進行抗性驗證，30°C，220r/m培養2 天后篩選出可以生長的菌株。取上述可以在抗性TSB中培養的菌液1.5ml，離心倒去上清， 用500 ill 31￡重懸菌絲體後，800017/!^11離心2111111，倒掉上清後重複洗滌一次。500111 STE 懸浮菌絲體，加入溶菌酶，終濃度為2mg/L (溶菌酶為固體，可以先加入STE中，配成2mg/L)， 37°C，水浴30min。然後加入250 yl，2% (w/v)的SDS振勻。加入250 yl的酚氯仿(體 積比1 1)振勻，15000r/min，10min，取上清(分界處有白色變性蛋白質，由於整個上清 比較黏稠，需要連著變性蛋白質一起吸入)。重複上一步驟7 8次至上清無明顯黏稠現 象。接著用與上清等體積的氯仿抽提酚，移取上清，加入1/10體積的3M NaAC，加等體積異 丙醇，來回顛倒混勻，室溫放置30min，12000r/min離心5min。最後用70% (v/v)乙醇洗滌 一次，於室溫揮幹，得到的白色固體即總DNA，將其溶於50 yl的雙蒸水。以此總 DNA 作為模板，利用通用引物 M13-47 5' -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3『 和 RV-M:5' -GAGCGGATMCMTTTCACACAGG-3 『進行 PCR。PCR 程序95 °C，3min ;94°C，lmin ； 55°C，lmin ；72°C，lmin (步驟二到步驟四30個循環)；最後72°C，2min。PCR產物電泳圖見圖 6。可見PCR產物是大約2KB左右的片段，就是ErmP+aveBIV的大小，表明ErmP+aveBIV已經 轉入整合質粒。實施例7產表柔紅黴素的工程菌的發酵驗證挑取接合子於含有50mg/L阿伯拉黴素的高氏一號斜面，30°C培養15天後，挑取適 量菌體於種子液中培養，30°C，220r/m培養2天後轉接於發酵培養基，30°C，220r/m培養5 天后放瓶，發酵液用草酸調PH值至pH5，再加2倍體積的丙酮混勻浸泡5小時，離心後取上 清做HPLC分析。HPLC條件，流動相0. (v/v)甲酸的乙腈0.1% (v/v)甲酸的水溶 液=72 28，流速:lml/min，柱溫:35°C，檢測波長:254nm，進樣量:5iil，分析柱:Agilent C18。HPLC分析結果顯示所有通過雙交換定點插入以及倍增aveBIV的工程菌單菌落髮酵產物中都已經沒有柔紅黴素，而表柔紅黴素的濃度都有所提高，最高達70mg/L左右。序列表上海醫藥工業研究院產表柔紅黴素的天藍淡紅鏈黴菌基因工程菌及其製備方法P4-091166C1PatentIn version 3. 415028DNAArtificial 重組 DNAmisc_feature(62). . (62)n is a, c, g, or tpromoter (1525) (2198)紅黴素啟動子gene (2199) (3492)aveBIV 基因1ctgggacggagntggaccggcgccgggcaggaggatcgccggtggccgagcaccgccgacgatgacgccccgactgcctggtaccgcgatctacctgagcggagtcggagagccggaggttcacggccgc
10
atgggcatgcggtcgtcgggcagtgtggacatcgtcttcgacggctgtcc60gaccgggtgctgccgcgacggcgagccgggcgtcgcgacgacgcggcgct120acgtcagctcgtacgcatgctggctatcactcggctacgccgaggcgctc180ctcacggaactgcgcaggcgcggcggggcgccggccggggtgcggaccac240atagacgcccggctgttcgcgctgcacacggcggtggcgagcgcgttgac300cggctcgccg acgacctcagcggcgacctcgccgcccgcggccgcgccat360ttccagtacg ccaagctgctcgtcaaccggcactcggtgggcgtggtgga420atgctcgtgg gaggggccggatacagcaactcccacccgctggcgcgcct480gtccgggcgg gcgggttcatgcatccatacaacttcacggacggcgtcga540gaagtggcgttgggccgatgagcggcgggcgacgcgggaccgggatccct600gacgtggatgaaggcgcgggaactggcggtgcagggggcgtacacgttcg660gtttccggacgagcgggggctgttcgtctcaccgttccgggaggatgcgt720ggtcggccaccccctcttcccggtgcggcagacgaatcacagccggtcgc780
ggcgcggggtggtgcggggcgtgcactaca ccgtgacgccgccgggctcg gccaagtacg840
tgtactgcgcccgtggcaggtcgctggaca tcgtcgtcga cgtgcgggtcggctccccga900
cgtacggccggtgggacgccgtcgagctgg agccgcgtga gttccgggcg gtgtacttcc960
cggtcggggtggggcacgccttcgtggccctggaggacga caccgtcatg tcgtacatgc1020
tgtccggggagtacgtgcaggccaacgaactcgccgtgtcggtgctggacccggccctcg1080
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ccctggagcaggcccgggccgccgggacccttccggagta cgccgcatgccgggcggtcg1200
agtcggagctgtggccgccggccgggtcacgcggagacgg gtgaggcgga catgcgggtc1260
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gggtgggacgtgcacggggtggcccgccgcccggcgccgcacctgagcgg gtgcgggttc1380
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cgctagggggaagggctcaagaagataggggccaccagatggggcggttttcggtgtgcc2220
cgccccggccgaccggaatactgaagagcatgctgacgactgggatgtgcgaccgaccgc2280
tggtcgtcgtactcggagcctccggctatatcgggtcggccgtcgcggcggaactcgccc2340
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gtcgtcctgtgaccgtcccgcacctcttcggtgccatcgccgccggcgtgtccgcccgca3060
ccgggcgccccgcggtgcccgtgaccgcggtggaccctccggcgatggcgacggcggcgg3120
11
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gacggttccacccccagctcgttcaccaatgtcttgcggagtttgatg5028
1權利要求
一種生產表柔紅黴素的天藍淡紅鏈黴菌的基因工程菌，其是一種在天藍淡紅鏈黴菌野生菌株的dnmV基因中插入或者置換為包含aveBIV基因的第一外源基因，使dnmV基因被阻斷而表達aveBIV的基因工程菌，其特徵在於，該基因工程菌的基因組中還整合著第二外源基因，所述的第一外源基因和第二外源基因都是啟動子和aveBIV基因的連鎖片段。
2.如權利要求1所述的基因工程菌，其特徵在於，所述的啟動子的核苷酸序列是序列 表中SEQ ID NO. 1的第1525 2198位所示的核苷酸序列，所述的aveBIV基因的核苷酸序 列是如序列表中SEQ ID NO. 1的第2199 3492位所示。
3.如權利要求1所述的基因工程菌，其特徵在於，所述的天藍淡紅鏈黴菌野生菌株的 dnmV基因的第273位 675位之間的核苷酸片段被所述的第一外源基因置換掉。
4.如權利要求1所述的基因工程菌，其特徵在於，所述的第二外源基因在基因組中的 整合位置是在基因組的任何位置。
5.如權利要求1所述的基因工程菌，其特徵在於，所述的天藍淡紅鏈黴菌野生菌株是 天藍淡紅鏈黴菌 Sti^ptomyces coeruleorubidus SIPI-1482。
6.一種重組載體，其含有啟動子和aveBIV基因的連鎖片段。
7.如權利要求6所述的重組載體，其特徵在於，所述的重組載體的載體骨架是質粒 PSET152，所述的啟動子和aveBIV基因的連鎖片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1 第1525 3492位所示。
8.一種轉化子，其特徵在於，其含有權利要求6 7任一項所述的重組載體。
9.如權利要求8所述的轉化子，其特徵在於，所述的轉化子的宿主細胞是大腸桿菌 ET12567。
10.一種製備生產表柔紅黴素的天藍淡紅鏈黴菌的基因工程菌的方法，其特徵在於，包 括將如權利要求8所述的轉化子與產表柔紅黴素的天藍淡紅鏈黴菌接合，挑選接合子。
11.一種製備表柔紅黴素的的方法，其特徵在於，包括培養如權利要求1 5任一項所 述的天藍淡紅鏈黴菌的基因工程菌，從培養物中獲得表柔紅黴素。
全文摘要
本發明公開了一種高產表柔紅黴素的天藍淡紅鏈黴菌的基因工程菌，其是一種在天藍淡紅鏈黴菌野生菌株的dnmV基因中插入或者置換為包含aveBIV基因的第一外源基因，使dnmV基因被阻斷而表達aveBIV(阿維菌素酮基還原酶)的基因工程菌，其特徵在於，該基因工程菌的基因組中還整合著第二外源基因，所述的第一外源基因和第二外源基因都是啟動子和aveBIV基因的連鎖片段。本發明所構建的基因工程菌，不含有任何抗性標記，很方便用於進一步的基因工程改造；表柔紅黴素產量遠遠大於已有方法，最好可達70mg/L；通過連續傳代，表柔紅黴素產量非常穩定，重複性好。
文檔編號C12N1/21GK101892185SQ200910051619
公開日2010年11月24日 申請日期2009年5月20日 優先權日2009年5月20日
發明者景蘭, 李繼安, 邵雷, 陳代傑, 黃佳 申請人:上海醫藥工業研究院