一種採用共固定化雙酶水解魚鱗膠原蛋白製備抗氧化活性肽的方法
2023-05-31 04:33:36 1
專利名稱：一種採用共固定化雙酶水解魚鱗膠原蛋白製備抗氧化活性肽的方法
一種採用共固定化雙酶水解魚鱗膠原蛋白製備抗氧化活性肽的方法技術領域
本發明屬於食品生物技術領域，涉及製備生物活性肽的方法。
技術背景
我國魚類資源十分豐富，淡水魚養殖量居世界第一位。目前，淡水魚加工主要局限在魚體肌肉加工方面，如魚糜，魚丸等。受傳統觀念和加工技術的制約，在魚肉加工過程中產生的大量下腳料如魚鱗、內臟等很少被利用，而是當作垃圾扔棄。據估計，我國每年廢棄的魚鱗達30萬噸，不僅浪費了資源，還汙染了環境。
魚鱗含有豐富的蛋白質，佔魚鱗總質量的50%_70%，主要是膠原蛋白，其次為角蛋白和其它的粘蛋白等。研究發現魚鱗中膠原蛋白含有豐富的甘氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸，具有低過敏性、分子結構較脆弱、酶解較容易等特點，其水解產物中含有生物活性肽。而膠原蛋白肽具有分子量低、易吸收、低黏度等特性，同時具有免疫調節、抗血栓、降血壓、降膽固醇以及抗氧化等生理功能。因此，膠原蛋白肽已被廣泛應用於醫藥、食品、日用化工等領域。
目前，由膠原蛋白製備生物活性肽的方法有化學法和酶解法，由於酶解法具有作用溫和、高效、易控、安全等優勢，在蛋白質深加工和活性成分提取領域被廣泛應用。特別是利用酶固定化技術可增大酶對溫度和PH的適應範圍，提高了酶的使用效率，且在反應結束後，很容易將酶與反應液分開，簡化了產物的分離純化。近年來，隨著酶工程技術的發展，在單酶固定化技術的基礎上又建立了多酶共固定化技術，多酶共固定化體系擁有固定化酶的高穩定性和連續操作能力，又具有多酶的協同作用，該技術已展現了十分廣闊的應用前景。 根據查閱已有文獻，國內尚未有關利用多酶共固定化技術加工水產品的相關報導。本發明以草魚魚鱗為原料，將其進行浸酸脫鈣、浸鹼脫雜蛋白處理，然後經共固定化雙酶酶解，再通過超濾和真空濃縮等分離純化，最後經冷凍乾燥得到抗氧化活性多肽。本發明對於提高淡水魚加工的附加值，實現魚鱗廢棄物的綜合利用具有重要意義。發明內容
本發明的主要目的在於提供一種共固定化雙酶酶解魚鱗中膠原蛋白製備抗氧化活性肽方法。
本發明為解決其技術問題所採取的技術方案如下。
( 1)交聯法共固定化雙酶。
以木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、Flavourzyme風味蛋白酶、Alcalase鹼性蛋白酶中任意兩種酶組成複合蛋白酶，按照活力比為1:1-1:3將兩種酶溶於磷酸鹽緩衝液中配製成質量濃度為1. 0-5. 0%蛋白酶溶液，取配製的蛋白酶溶液加入PH4-10、質量濃度為 2. 0-6.0%的海藻酸鈉溶液中，蛋白酶溶液與海藻酸鈉溶液體積比為1:1-1:5。待充分攪拌均勻後，加入質量濃度為0. 5-5. 0%的氯化鈣(CaCl2)溶液中，移入4°C冰箱硬化2_6 h，過濾洗滌。然後加入體積分數為0.1-3%戊二醛溶液中，振蕩0.5 h，於4-25°C靜置交聯4-63h，用磷酸鹽緩衝液將殘餘戊二醛和未固定化的酶洗去，用冷風吹乾表面水分得共固定化雙酶。
共固定化酶活力的測定。
在具塞試管中加入固定化酶0. 3 g，3 mL酶激活劑(0. lmol/ L，pH7. 2的磷酸緩衝液中含20 mmol/L半胱氨酸和1 mmol/ LEDTA，現配)，37°C水浴中預熱10 min，加入酪蛋白溶液10 mL，攪勻後在37°C水浴中精確反應10 min，然後加入10 mL三氯醋酸溶液，劇烈搖動後，37°C水浴放置30 min，在275 nm處測定吸光度。
(2)魚鱗預處理。
將新鮮魚鱗浸泡洗淨其表面粘附物，烘乾，然後粉碎並過篩網。稱取魚鱗粉放入酸溶液中勻速攪拌脫鈣，然後用鹼浸泡處理，脫除附著在魚鱗表面的魚銀、色素物質和可溶性雜蛋白。
( 3 )共固定化酶定向水解魚鱗蛋白。
控制溫度為40_60°C，pH在6-10，按魚鱗質量比1_5%加入固定化雙酶酶解，酶解時間為2-6 h，期間不斷攪拌並加入酸液或鹼液使反應體系維持在初始值pH值，酶水解反應結束後升溫至100°C，保持10 min滅活，快速冷卻反應液，然後採用離心機轉速5000 r/ min，離心分離15-20 min，得到上層的酶解液。
(4)脫色脫腥採用粉狀活性炭吸附脫色脫腥，在酶解液中加入質量比為0. 5-3%食品級粉狀活性炭， 將水解液置於50°C的水浴鍋內處理60 min,然後經5000 r/min離心獲得上清液(即魚鱗蛋白酶解液)。
(5)魚鱗多肽超濾分離。
脫色脫腥後的魚鱗蛋白酶解液經10 kDa超濾膜截流分離，保留濃縮液；將濾液再經3kDa超濾膜截流分離，保留濃縮液和濾液。超濾過程中組件最大工作壓力不超過0. 15 MPa，依次得到分子量為10 kDa以上、3_10 kDa,3 kDa以下的魚鱗多肽溶液。
(6)真空濃縮。
將超濾得到的各部分溶液在真空度為0. 08 MPa、溫度為50°C進行真空濃縮，濃縮至固形物在60%以上，分別測定各濃縮物抗氧化活性。
多肽抗氧化活性評價。
本發明多肽抗氧化活性通過鄰苯三酚氧化法測定超氧陰離子自由基清除率進行評價。
(7)冷凍乾燥。
高抗氧化活性組分在-40 °C預凍12 h，冷阱溫度為_65°C，真空度100 Pa,加熱板溫度50 °C，真空冷凍乾燥M h，水分含量在5%以下，乾燥後所得粉末即為魚鱗蛋白抗氧化活性肽。
本發明的優點是1、本發明所製備的抗氧化活性肽是魚鱗蛋白經共固定化雙酶酶解後產生的小分子肽，可作為天然抗氧化劑用於食品抗氧化保鮮中，且無毒副作用，安全性高；2、雙酶共固定化體系擁有固定化酶的高穩定性和連續操作能力，又具有多酶的協同作用，因此其酶解效率高，酶可以多次利用，酶解產物易於純化。3、本發明原料是魚鱗蛋白，是淡水魚加工的廢棄物，本發明的技術轉化為淡水魚廢棄物的有效利用提供了一條新途徑；4、本發明所得產品可用於藥品、食品和化妝品加工中。
具體實施方式
本發明將通過以下具體實施例作進一步說明。
實施例1。
(1)按照活力比為1:1的比例將木瓜蛋白酶和Alcalase鹼性蛋白酶溶於磷酸鹽緩衝液中，配製質量濃度為1. 0%蛋白酶溶液；同時，配製pH7. 0質量濃度為2. 0%海藻酸鈉溶液，取配製的蛋白酶溶液加入海藻酸鈉溶液中，蛋白酶溶液與海藻酸鈉溶液體積比為1:1。 待充分攪拌均勻後，加入質量濃度為0. 5%的CaCl2溶液中，移入4°C冰箱硬化6 h，過濾洗滌。然後加入體積分數為0.1%戊二醛溶液中，振蕩0.5 h，於25°C靜置交聯4 h，用磷酸鹽緩衝液將殘餘戊二醛和未固定化的酶洗去，用冷風吹乾表面水分得共固定化雙酶。
(2)以新鮮草魚魚鱗為原料，通過浸泡洗淨魚鱗表面粘附物，40°C烘乾，然後將洗淨乾燥後的魚鱗粉碎成細粉，並過60目的篩網。稱取500 g魚鱗，放入4%鹽酸溶液中勻速攪拌脫鈣12 h後，棄去溶液，用水衝洗固形物。
將脫鈣後的魚鱗用3% Ca(OH)2溶液浸泡處理12 h，使膠原分子得以釋放，同時脫除附著在魚鱗表面的魚銀、色素物質和可溶性雜蛋白。
(3)按魚鱗質量比為1. 0%加入固定化雙酶進行酶解，酶解溫度為60°C，pH為7. 0， 期間不斷攪拌並加入酸液或鹼液以使反應體系PH值維持在7. 0左右，酶解時間2 h後，升溫至100°C，保持10 min滅活，採用離心機於5000 r/min，離心分離15-20 min，得到上層的酶解液。
(4)在酶解液中加入質量比為3%粉狀活性炭，將水解液置於50°C的水浴鍋內處理 60 min，然後經5000 r/min離心獲得清液。
(5)脫色脫腥後的魚鱗蛋白酶解液經10 kDa超濾膜截流分離，保留濃縮液；將濾液再經3kDa超濾膜截流分離，保留濃縮液和濾液。超濾過程中組件最大工作壓力不超過 0. 15 MPa，依次製備分子量為10 kDa以上、3_10 kDa,3 kDa以下的魚鱗多肽溶液。
(6)真空濃縮。
將超濾得到的各部分溶液在真空度為0. 08 MPa、溫度為50°C進行真空濃縮，濃縮至固形物在60%以上，分別檢測各濃縮物抗氧化活性。
(7)高抗氧化活性組分在-40 °C預凍12 h，冷阱溫度為_65°C，真空度100 Pa,加熱板溫度50 °C，真空冷凍乾燥M h，水分含量在5%以下，乾燥後所得粉末即為魚鱗膠原蛋白抗氧化活性肽。
實施例2。
(1)按照活力比為1:2的比例將中性蛋白酶和Alcalase鹼性蛋白酶溶於磷酸鹽緩衝液中，配製質量濃度為3. 0%蛋白酶溶液；同時，配製pH9. 0質量濃度為4. 0%海藻酸鈉溶液，取配製的蛋白酶溶液加入海藻酸鈉溶液中，蛋白酶溶液與海藻酸鈉溶液體積比為1:3。 待充分攪拌均勻後，加入質量濃度為2. 5%的CaCl2溶液中，移入4°C冰箱硬化4 h，過濾洗滌。然後加入體積分數為1.5%戊二醛溶液中，振蕩0.5 h，於15°C靜置交聯5 h，用磷酸鹽緩衝液將殘餘戊二醛和未固定化的酶洗去，用冷風吹乾表面水分得共固定化雙酶。
(2)以新鮮草魚魚鱗為原料，通過浸泡洗淨魚鱗表面粘附物，40°C烘乾，然後將洗淨乾燥後的魚鱗粉碎成細粉，並過60目的篩網。稱取500 g魚鱗，放入4%鹽酸溶液中勻速攪拌脫鈣12 h後，棄去溶液，用水衝洗固形物。
將脫鈣後的魚鱗用3% Ca(OH)2溶液浸泡處理12 h，使膠原分子得以釋放，同時脫除附著在魚鱗表面的魚銀、色素物質和可溶性雜蛋白。
(3)按魚鱗質量比為2. 5%加入固定化雙酶進行酶解，酶解溫度為50°C，pH為9. 0， 期間不斷攪拌並加入酸液或鹼液以使反應體系PH值維持在9. 0左右，酶解時間4 h後，升溫至100°C，保持10 min滅活，採用離心機於5000 r/min，離心分離15-20 min，得到上層的酶解液。
(4)在酶解液中加入質量比為洲粉狀活性炭，將水解液置於50°C的水浴鍋內處理 60 min，然後經5000 r/min離心獲得清液。
(5)脫色脫腥後的魚鱗蛋白酶解液經10 kDa超濾膜截流分離，保留濃縮液；將濾液再經3kDa超濾膜截流分離，保留濃縮液和濾液。超濾過程中組件最大工作壓力不超過 0. 15 MPa，依次製備分子量為10 kDa以上、3_10 kDa,3 kDa以下的魚鱗多肽溶液。
(6)真空濃縮。
將超濾得到的各部分溶液在真空度為0. 08 MPa、溫度為50°C進行真空濃縮，濃縮至固形物在60%以上，分別檢測各濃縮物抗氧化活性。
(7)高抗氧化活性組分在-40 °C預凍12 h，冷阱溫度為_65°C，真空度100 Pa,加熱板溫度50 °C，真空冷凍乾燥M h，水分含量在5%以下，乾燥後所得粉末即為魚鱗膠原蛋白抗氧化活性肽。
實施例3。
(1)按照活力比為1:3的比例將中性蛋白酶和木瓜蛋白酶溶於磷酸鹽緩衝液中， 配製質量濃度為5. 0%蛋白酶溶液；同時，配製pH6. 0質量濃度為6. 0%海藻酸鈉溶液，取配製的蛋白酶溶液加入海藻酸鈉溶液中，蛋白酶溶液與海藻酸鈉溶液體積比為1 5。待充分攪拌均勻後，加入質量濃度為5.0%的CaCl2溶液中，移入4°C冰箱硬化2 h，過濾洗滌。然後加入體積分數為3.0%戊二醛溶液中，振蕩0.5 h，於4°C靜置交聯6 h，用磷酸鹽緩衝液將殘餘戊二醛和未固定化的酶洗去，用冷風吹乾表面水分得共固定化雙酶。
(2)以新鮮草魚魚鱗為原料，通過浸泡洗淨魚鱗表面粘附物，40°C烘乾，然後將洗淨乾燥後的魚鱗粉碎成細粉，並過60目的篩網。稱取500 g魚鱗，放入4%鹽酸溶液中勻速攪拌脫鈣12 h後，棄去溶液，用水衝洗固形物。
將脫鈣後的魚鱗用3% Ca(OH)2溶液浸泡處理12 h，使膠原分子得以釋放，同時脫除附著在魚鱗表面的魚銀、色素物質和可溶性雜蛋白。
(3)按魚鱗質量比為5. 0%加入固定化雙酶進行酶解，酶解溫度為40°C，pH為6. 0， 期間不斷攪拌並加入酸液或鹼液以使反應體系PH值維持在6. 0左右，酶解時間6 h後，升溫至100°C，保持10 min滅活，採用離心機於5000 r/min，離心分離15-20 min，得到上層的酶解液。
(4)在酶解液中加入質量比為1%粉狀活性炭，將水解液置於50°C的水浴鍋內處理 60 min，然後經5000 r/min離心獲得清液。
(5)脫色脫腥後的魚鱗蛋白酶解液經10 kDa超濾膜截流分離，保留濃縮液；將濾液再經3kDa超濾膜截流分離，保留濃縮液和濾液。超濾過程中組件最大工作壓力不超過0. 15 MPa，依次製備分子量為10 kDa以上、3_10 kDa、3 kDa以下的魚鱗多肽溶液。
(6)真空濃縮。
將超濾得到的各部分溶液在真空度為0. 08 MPa、溫度為50°C進行真空濃縮，濃縮至固形物在60%以上，分別檢測各濃縮物抗氧化活性。
(7)高抗氧化活性組分在-40 °C預凍12 h，冷阱溫度為_65°C，真空度100 Pa,加熱板溫度50 °C，真空冷凍乾燥M h，水分含量在5%以下，乾燥後所得粉末即為魚鱗膠原蛋白抗氧化活性肽。
本發明多肽抗氧化活性採用超氧陰離子自由基清除率評價，通過鄰苯三酚氧化法測定超氧陰離子自由基清除率。
權利要求
1. 一種採用共固定化雙酶水解魚鱗膠原蛋白製備抗氧化活性肽的方法，其特徵是按以下步驟(1)以木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、Flavourzyme風味蛋白酶、Alcalase鹼性蛋白酶中任意兩種酶組成複合蛋白酶，按照活力比為1:1-1:3將兩種酶溶於磷酸鹽緩衝液中配製成質量濃度為1. 0-5. 0%蛋白酶溶液，取配製的蛋白酶溶液加入PH4-10、質量濃度為 2. 0-6. 0%的海藻酸鈉溶液中，蛋白酶溶液與海藻酸鈉溶液體積比為1 1-1 5 ；待充分攪拌均勻後，加入質量濃度為0. 5-5. 0%的氯化鈣溶液中，移入4°C冰箱硬化2-6 h，過濾洗滌；然後加入體積分數為0. 1-3%戊二醛溶液中，振蕩0.5 h，於4-25°C靜置交聯4-6 h，用磷酸鹽緩衝液將殘餘戊二醛和未固定化的酶洗去，用冷風吹乾表面水分得共固定化雙酶；(2)將新鮮魚鱗浸泡洗淨、烘乾、粉碎、篩網、脫鈣，脫除魚銀、色素物質和可溶性雜蛋白；(3)控制溫度為40-60°C，pH在6-10，按魚鱗重量比1_5%加入固定化雙酶酶解，酶解時間為2-6 h，期間不斷攪拌並加入酸液或鹼液使反應體系維持在初始值pH值，酶水解反應結束後升溫至100°C，保持10 min滅活，快速冷卻反應液，然後採用離心機轉速5000 r/ min，離心分離15-20 min，得到上層的酶解液；(4)在酶解液中加入質量比為0.5-3%食品級粉狀活性炭，將水解液置於50°C的水浴鍋內處理60 min，然後經5000 r/min離心獲得上清液，即魚鱗蛋白酶解液；(5)魚鱗蛋白酶解液經10kDa超濾膜截流分離，保留濃縮液；將濾液再經3kDa超濾膜截流分離，保留濃縮液和濾液；超濾過程中組件最大工作壓力不超過0. 15 MPa，依次得到分子量為10 kDa以上、3-10 kDa,3 kDa以下的魚鱗多肽溶液；(6)真空濃縮；(7)冷凍乾燥。
全文摘要
一種採用共固定化雙酶水解魚鱗膠原蛋白製備抗氧化活性肽的方法，包括以下步驟(1)交聯法共固定化雙酶；(2)魚鱗預處理；(3)共固定化酶定向水解魚鱗蛋白；(4)脫色脫腥；(5)魚鱗多肽超濾分離；(6)真空濃縮；(7)冷凍乾燥。本發明所製備的抗氧化活性肽可作為天然抗氧化劑用於食品抗氧化保鮮中，且無毒副作用，安全性高；所用方法酶解效率高，酶可以多次利用，酶解產物易於純化；為淡水魚廢棄物的有效利用提供了一條新途徑；產品可用於藥品、食品和化妝品。
文檔編號C07K1/34GK102533913SQ201110435489
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月23日 優先權日2011年12月23日
發明者吳志華, 李欣, 楊安樹, 陳紅兵 申請人:南昌大學