利用粗毛韌革菌菌體作為催化劑製備銀杏內酯b的方法

2023-05-31 02:00:51

利用粗毛韌革菌菌體作為催化劑製備銀杏內酯b的方法
【專利摘要】本發明公開了利用粗毛韌革菌(Stereum?hirsutum)菌體作為催化劑轉化銀杏內酯混合物合成銀杏內酯B的方法，屬於生物【技術領域】。本發明通過對粗毛韌革菌菌種進行擴大培養，從試管斜面、液體搖瓶、種子培養和菌體分離，利用菌體作為催化劑，轉化銀杏內酯合成銀杏內酯B，轉化液經過離心、乙酸乙酯萃取、無水酒精結晶把銀杏內酯B從發酵液分離出來。利用該方法所得到的銀杏內酯B的純度≥99％，銀杏內酯轉化率＞90％。
【專利說明】利用粗毛韌革菌菌體作為催化劑製備銀杏內酯B的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物工程【技術領域】，通過粗毛韌革菌菌種液體培養，同時轉化銀杏葉提取物製備銀杏內酯B的一種新工藝。
【背景技術】
[0002]研究證明銀杏內酯是銀杏葉中主要的活性成分之一，是一類特異有效的血小板活化因子(Platelet activating factor PAF)受體拮抗劑。血小板活化因子是由血小板和多種炎症組織分泌產生的一種內源性磷酯，是目前發現的最有效的血小板聚集誘導劑，與許多疾病的產生、發展密切相關。銀杏內酯作為PAF受體特異性拮抗劑，具有廣泛的藥理作用。研究發現銀杏內酯B對中樞神經系統與缺血損傷有保護作用，抗休克、抗過敏、抗菌抗炎作用，以及抗器官移植中的排斥反應。同時還發現銀杏內酯B可降低肝門靜脈壓提高全身血管耐受性，說明它對肝硬化有一定的療效。銀杏內酯對於腎損傷有治療作用。這些作用都與銀杏內酯B作為PAF受體拮抗劑有關，並且它目前被認為是作用最強的、最有臨床應用前景的天然血小板活化因子(PAF)受體拮抗劑。
[0003]目前國內外生產銀杏內酯B的方法主要是從銀杏葉提取物，已見報導的銀杏內酯B的專利共有51篇，其中一部分是關於銀杏內酯B的製劑的製備(如:一種銀杏內酯B固體分散體及其製備方法，申請號:CN200910204198.4)，三篇關於銀杏內酯B及其衍生物的生理學功能(銀杏內酯B的一種新用途；申請號:CN200910092750.5 ;銀杏內酯B衍生物在製藥中的新用途，申請號:CN200910234319.X ;銀杏內酯B水解衍生物及其用途，申請號:CN201010122039.2)。而關於銀杏內酯B的製備只有九篇(一種從銀杏葉或銀杏葉提取物中提取銀杏內酯B的新方法，申請 號200510063407.X ;—種從銀杏內酯混合物中分離銀杏內酯B的方法，申請號:CN201010608847.X，等等)，銀杏內酯中含有銀杏內酯A、B、C、M等同系物，這些專利是採用分離技術從銀杏內酯混合物中分離銀杏內酯B，難以在工業上大批量生產銀杏內酯B。

【發明內容】

[0004]本發明提供的是一種銀杏內酯B的生產技術，該技術不是單純的利用分離提純方法獲得大量的銀杏內酯B，而是在培養基中添加銀杏內酯，以粗毛韌革菌(Stereumhirsutum)為菌種通過液體培養技術得到菌體，菌體作為催化劑，轉化銀杏內酯A、C和M生成銀杏內酯B，以及通過提取步驟獲得銀杏內酯B製品。
[0005]本發明一方面涉及一種銀杏內酯B的生產技術，其特徵在於包括如下步驟:
[0006]在銀杏內酯(包括銀杏內酯A、B、C和M)加入蒸餾水和酸，調節ρΗ6.0-7.0，配成20-30克銀杏內酯/升的反應液，將粗毛韌革菌和反應液按照重量/體積1:20-30混合，在溫度20-30°C，攪拌速率100-150轉/分鐘，反應10小時以上；
[0007]反應之後的反應液按照4000-6000轉/分鐘離心10_20分鐘去除菌體，濾液用鹽酸或硫酸調節PH2.0-3.0,連續用乙酸乙酯萃取2-4次，合併乙酸乙酯萃取液，真空濃縮至幹，殘渣用無水乙醇溶解，過濾，濾液至於_20°C以下結晶70小時以上，過濾，濾渣水洗，乾燥得到銀杏內酯B。
[0008]在本發明的一個優選實施方式中，所述的粗毛韌革菌通過如下方式獲得:以粗毛韌革菌為出發菌株，進行試管菌種傳代、液體搖瓶菌種、種子罐菌種、催化轉化等步驟製得含有銀杏內酯B的轉化液，含有銀杏內酯B的轉化液經過離心、乙酸乙酯萃取、濃縮、酒精復溶，_20°C結晶、過濾、烘乾等提取工藝得到銀杏內酯B晶體。其中所述的試管菌種的培養基為馬鈴薯葡萄糖液體培養基(葛健，王正祥，工業微生物實驗技術手冊，1994:P367);其中所述的試管斜面菌種培養工藝為斜面菌種切成4X4mm小塊菌種，挑取一小塊轉接含有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基的試管中，20-32°C培養5-20天，製得試管斜面菌種，該試管斜面4°C保存備用；其中所述的液體搖瓶培養基組成為(單位為克/升):葡萄糖5-40，玉米粉5-25，蛋白腖I-20，KH2PO4 I-6，MgSO4 I-4，加水至適當體積，起始pH值為
5.0-8.0，100-140°C滅菌20-60分鐘；其中所述的搖瓶培養的培養條件是:250mL三角瓶裝液量為60-150mL，接種3-4塊4X4mm小塊菌種，置於溫度22-30°C，轉速120-160轉/分鐘，培養時間24-48小時；其中所述的種子罐培養的培養基組成為(單位為克/升):葡萄糖5-40，玉米粉5-25，蛋白腖I-10，KH2PO4I-6，MgSO4I-4，消泡劑0.1-0.8，加水至適當體積，起始pH值為5.0-8.0，100-140°C滅菌20-60分鐘；其中所述種子罐的培養條件是:接種量5-10% (種子液體積/接種後體積)，培養溫度22-300C，攪拌速率90-150轉/分鐘，通風量1:0.3-Iv / V / m，培養時間80-90小時；其中所述轉化反應液為(單位為克/升):銀杏內酯10-50，起始pH值為5.0-8.0 ;其中所述的轉化工藝條件是:種子液4000-6000轉/分鐘，離心5-20分鐘，收集菌體，菌體與反應液按1:5-50 (重量:體積)混勻，在溫度22-30°C，攪拌速率90-150轉/分鐘，通風量1:0.3-Iv / V / m，反應6-18小時；其中所述的銀杏內酯B提取工藝為，轉化液4000-6000轉/分鐘離心10-20分鐘去除菌體，濾液用鹽酸或硫酸調節pHl.0-
4.0，連續用0.3-3倍發酵液體積的乙酸乙酯萃取2-4次，合併乙酸乙酯萃取液，真空濃縮至幹，殘渣用無水乙醇溶解，過濾，濾液至於_20°C結晶24-120小時，過濾，濾渣水洗，80 0C乾燥得到銀杏內酯B純品。`
[0009]本發明所使用的粗毛韌革菌菌種為金耳的伴生菌，可選任意一種金耳子實體，例如雲南、西藏或山西的金耳子實體，通過組織分離即可得到野粗毛韌革菌菌種。該菌不形成或很難形成子實體，菌絲體遇氫氧化鉀溶液變暗或變黑。生殖菌絲疏鬆地交織在一起，分枝，有鎖狀聯合，近無色。
[0010]本發明所述的工藝銀杏內酯B白色，純度> 99%，銀杏內酯轉化率> 90%。
[0011]根據此工藝採用的銀杏內酯測定方法為:精密稱取銀杏內酯B對照品10mg，溶於ImL色譜級甲醇中，配製成IOmg / mL的標準液。0.2 μ m微孔濾膜過濾，控制進樣量為1，2，3，4，5，6，7和8μ 1，利用高效液相色譜儀(HIMADZU (島津)LC-20AT)測定銀杏內酯B含量。色譜柱為矽膠柱(4.6mmX 250mm，5 μ m)。測定條件為流動相:甲醇:0.I %磷酸溶液=10:90 ；柱溫:30°C，流速:0.8mL / min，檢測波長:270nm。以進樣量為橫坐標(X)，以相應的峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸，求得銀杏內酯濃度與峰面積的線性回歸方程。吸取樣品液(發酵過程中和發酵後)的上清液少量，用0.45 μ m微孔濾膜過濾，按上述色譜條件分別測定峰面積，採用外標峰面積根據上述求得的銀杏內酯B濃度與峰面積的回歸方程計算銀杏內酯B含量。
[0012]銀杏內酯B轉化率按下列公式⑴計算:
【權利要求】
1.粗毛韌革菌轉化銀杏內酯生產銀杏內酯B的方法，其特徵在於以粗毛韌革菌為出發菌株,通過試管斜面菌種、液體搖瓶菌種、種子罐菌種、離心獲得菌體,菌體催化銀杏內酯合成含有銀杏內酯B的反應液，含有銀杏內酯B的反應液經過離心、乙酸乙酯萃取、濃縮、酒精復溶，_20°C結晶、過濾、烘乾等提取工藝得到銀杏內酯B晶體。
2.根據權利要求書I所述的方法，其中所述的粗毛韌革菌菌種為從雲南、山西和西藏的任意一種金耳子實體中分離出的金耳伴生菌菌種。
3.根據權利要求書I所述的方法，其特徵在於粗毛韌革菌通過液體搖瓶、種子罐和菌體轉化銀杏內酯，分離提取得到銀杏內酯B。其中所述的液體搖瓶種子培養基組成為(單位為克/升):葡萄糖5-40，玉米粉5-25，蛋白腖I-20，KH2PO4 I-6，MgSO4 I-4，加水至適當體積，起始pH值為5.0-8.0,100-140°C滅菌20-60分鐘；其中所述的種子罐培養基組成為(單位為克/升):葡萄糖5-40，玉米粉5-25，蛋白腖I-10，KH2PO4I-6，MgSO4I-4，消泡劑0.1-0.8，加水至適當體積，起始pH值為5.0-8.0,100-140°C滅菌20-60分鐘；其中所述轉化銀杏內酯反應液組成為(單位為克/升):銀杏內酯10-50，起始PH值為5.0-8.0 ;其中所述的搖瓶培養的培養條件是:250mL三角瓶裝液量為60-150mL，接種3-4塊4X4mm小塊菌種，置於溫度22-30°C，轉速120-160轉/分鐘，培養時間24-48小時；其中所述種子罐的培養條件是:接種量5-10% (種子液體積/接種後體積)，培養溫度22-30°C，攪拌速率90-150轉/分鐘，通風量1:0.3-Iv / v / m，培養時間80-90小時；其中所述的轉化工藝條件是:種子液4000-6000轉/分鐘，離心5-20分鐘，收集菌體，菌體與反應液按1:5-50 (重量:體積)混勻，在溫度22-30°C，攪拌速率90-15 0轉/分鐘，通風量1:0.3-Iv / V / m，轉化6-18小時；按照該轉化工藝，其中在進行搖瓶培養之前，首先將粗毛韌革菌的斜面菌種接入新配製的馬鈴薯葡萄糖培養基中進行傳代培養，培養溫度22-30°C，培養時間24-248小時。
4.根據權利要求1所述的銀杏內酯B的方法，轉化液4000-6000轉/分鐘離心，濾液用鹽酸或硫酸調節pHl.0-4.0，連續用0.3-3倍發酵液體積的乙酸乙酯萃取2-4次，合併乙酸乙酯萃取液，真空濃縮至幹，殘渣用無水乙醇溶解，過濾，濾液至於-20°C結晶24-120小時，過濾，濾渣水洗，80°C乾燥得到銀杏內酯B純品。
5.根據權利要求1所述的轉化提取工藝所製得的銀杏內酯B白色，純度>99%，銀杏內酯轉化率> 90%。
6.一種銀杏內酯B的生產技術，其特徵在於包括如下步驟: 在銀杏內酯(包括銀杏內酯A、B、C和M)加入蒸餾水和酸，調節pH6.0-7.0，配成20-30克銀杏內酯/升的反應液，將粗毛韌革菌和反應液按照重量/體積1:20-30混合，在溫度20-30°C，攪拌速率100-150轉/分鐘，反應10小時以上； 反應之後的反應液按照4000-6000轉/分鐘離心10-20分鐘去除菌體，濾液用鹽酸或硫酸調節PH2.0-3.0，連續用乙酸乙酯萃取2-4次，合併乙酸乙酯萃取液，真空濃縮至幹，殘渣用無水乙醇溶解，過濾，濾液至於_20°C以下結晶70小時以上，過濾，濾渣水洗，乾燥得到銀杏內酯B。
【文檔編號】C12P17/18GK103451251SQ201310393203
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月2日 優先權日:2013年9月2日
【發明者】張志才 申請人:張志才