樣品製備用澆鑄膜結構物的製作方法

2023-05-30 16:10:21 2

專利名稱：樣品製備用澆鑄膜結構物的製作方法
背景技術：
在生物化學技術方面已經開發了許多分析程序，其中要求去除肽溶液中的溶劑，以期得到可以有效地進行分析的更高濃度肽樣品，或要求去除低分子量離子或溶質。也已經開發了很多不僅涉及肽而且也涉及一般大分子物種的其它分析程序，其中有必要使液體樣品中的大分子成分濃縮和/或「脫鹽」，因為生物化學/醫藥化學中通常需要沒有鹽類、洗滌劑及其它汙染物的純分析物。這些物質的存在可能是有害的，原因在於它們往往幹擾隨後的化學分析。環境技術上和化學分析中存在類似情況。
美國專利No.4,755,301公開了一種無需過濾至幹的大分子濃縮用離心方法和裝置。一張半透過性超濾膜將樣品池與濾液杯隔離開，該膜下面的濾液導管從該膜外沿向裡被充分抵銷，因此，當該裝置在一個固定角離心轉子上使用時，一旦滯留物彎液面達到最外濾液導管的最外沿的離心徑向水平，過濾就停止。
這樣的超濾裝置通常用於生物分子和天然產品的「純化」和/或樣品製備。為了使這樣一種工藝能夠成功，膜必須加以選擇，使之能截留有益的分子但能讓雜質通過。儘管這種情景對於大於約10,000分子量的分析物來說是相當直截了當的，但對於小於約5000分子量的物質來說問題就越來越多。理由是由於如下事實截留約5000分子量分析物所需要的膜孔率是如此低，以致透水性(流量率)變得不良且加工時間太長。例如，使用了適合於30,000或更大的分子量的分析物的膜的裝置，其典型的離心「自旋時間」是大約1小時，而對於約1000分子量的分析物則可能需要多達6小時。進而，對高g力的如此長期暴露經常導致設備損壞。
目前技術上常見的樣品量在0.01～10μg範圍。在如此低的負荷時，高效率樣品處理對於避免損失來說是重要的。慣用的樣品製備方法與裝置對於處理如此小樣品體積的「微量分離」來說是不實用的。此外，超濾只能有效地濃縮和脫鹽，因而，這種規模的吸附技術的應用是微質量樣品製備的一種全新思路。
製作樣品製備裝置的一種慣用方法，是首先把一個從諸如一種纖維性玻璃或纖維素片材得到的預開多孔塞插入一支移液管的尖端部，隨後添加鬆散顆粒和第二個多孔塞，如

圖1中所示。這些塞子用來把這些顆粒保持固定在該移液管尖端部。然而，這些塞子也截留過量液體，從而造成死空間或體積(即未被介質或聚合物佔據的空間，這會導致不良樣品回收率、諸如樣品帶出引起的汙染等)。然而，對於像移液管尖端部這樣極小的液體輸送裝置無法使用這些程序，因為沒有任何一種實用方法可用來要麼裝填塞子要麼裝填顆粒，以獲得一種要用於以上提到的極小樣品負荷的、含有10毫克或更少吸附劑的微量吸附裝置。
此外，也可以通過把介質裝入並固定於毛細管式移液管中來製作一種微量樣品製備裝置。然而，通過此類裝置的流動通常是緩慢的。
進而，儘管從質量吸附觀點來看，吸收性粉末提供最高的能力，但它們難以或確實不可能以毫克量操作。儘管基於聚合物的吸附膜片材相對容易操作，但它們的能力作為相對低的亞結構表面積的結果是較差的。
因此，本發明的一個目的是提供一種能使樣品溶液中的分子濃縮、純化和/或脫鹽的樣品製備裝置。
本發明的另一個目的是提供一種能使非常少量樣品溶液中的分子濃縮，純化和/或脫鹽的樣品製備裝置。
本發明的又一個目的是提供一種能使樣品溶液中的分子濃縮、純化和/或脫鹽、呈各種各樣幾何形狀的樣品製備裝置。
本發明的一個進一步目的是提供一種能使非常少量樣品溶液中的分子濃縮、純化和/或脫鹽、呈各種各樣幾何形狀的樣品製備裝置。
本發明的一個更進一步目的是提供一種製造起來簡單而經濟的樣品製備裝置。
本發明還有一個進一步目的是提供一種在一種有各種各樣殼體尺寸或幾何形狀的殼體中澆鑄顆粒的方法。
本發明的又一個進一步目的是提供一種呈現它澆鑄於其中的殼體的形狀而且不使用多孔塞就能保持在該殼體中的可澆鑄膜。
本發明的再一個目的是提供有支撐體或基質的可澆鑄膜。
發明概述本發明克服了先有技術的問題，它提供可用作吸附性或反應性介質或用於基於尺寸的分離的複合型(有填料)和/或非填充型結構的一種就地澆鑄方法。在一種實施方案中，這些結構是整體式的和/或連續式的。本發明適用於各種各樣特定殼體尺寸和構型，並提供一種在各種各樣體積的殼體中添加介質的手段。本發明使得大量介質(相對於所析出結構的表面積增加而言)能包含在該聚合物中，同時仍保持三維聚合物結構。
在第一種較好實施方案中，該複合結構包含截留於象圖2B中所示那樣的一種多孔聚合物基質內的顆粒，並就地澆鑄到諸如圖2A中所示的移液管尖端部等各種各樣尺寸的殼體中，從而提供一種有效的微質量操作平臺。隨著顆粒化學的適當選擇，實際上可以對少數幾微升體積中小於1微米的樣品質量負荷以及更大的質量負荷和體積進行任何分離或純化操作，包括選擇性結合/洗脫色譜法操作。本發明也涵蓋複合結構，以及含有該複合結構的樣品製備裝置。
在第二種較好實施方案中，可以自保持和/或自支撐的無填充結構就地澆鑄在一個適用殼體中，而且可以用於基於尺寸的分離，其中該澆鑄結構充當一種半滲透阻擋層或用於吸附。本發明也涵蓋這些結構以及含有這些結構的殼體，例如圖3中所示那種。圖3中的裝置是一種離心裝置，有一個液池、一個基礎和一個密封於該液池與基礎之間的多孔性織物。本發明的結構是就地澆鑄在該多孔性織物上的。該裝置在操作期間置於一個適用管形瓶中，該裝置的通量受離心力驅動。
附圖簡要說明圖1是在兩個多孔塞之間裝配了顆粒的一種吸附性移液管尖端部的示意圖；圖2A是按照本發明用一種就地澆鑄工藝製備的一種吸附性移液管尖端部的示意圖；圖2B是一種填充了顆粒的就地澆鑄結構的掃描電鏡微觀照片；圖3是一種向其中添加了就地澆鑄結構的殼體的一種進一步實施方案；圖4是一種用球形矽膠和聚礬粘結劑製備的顆粒填充膜的掃描電鏡微觀照片；
圖5A說明作為本發明就地澆鑄結構的一種適用殼體的一種多孔陣列；圖5B是一種可以與圖5A的多孔陣列一起使用的集水系統的側視圖；圖5C是圖5A多孔陣列的一個單孔的頂視圖；圖5D是圖5B集水系統的一個孔的橫截面視圖；圖6是一種5肽混合物的逆相色譜圖；圖7是一種結合於含有就地澆鑄C18二氧化矽的移液管尖端部並洗脫下來的5肽混合物的逆相色譜圖；圖8是一種結合於含有就地澆鑄塗有苯乙烯磺鹽的二氧化矽的移液管尖端部並洗脫下來的5肽混合物的逆相色譜圖；圖9是細胞色素C的逆相色譜圖；圖10是對一種含有就地澆鑄固定的胰蛋白酶珠的移液管尖端部暴露15分鐘後細胞色素C的逆相色譜圖；圖11是一種結合於含有就地澆鑄固定的蛋白A珠的移液管端部並洗脫下來的兔免疫球蛋白-g樣品的電泳凝膠；圖12是結合於含有就地澆鑄二氧化矽的1000μl移液管尖端部並洗脫下來的超捲曲質粒DNA的電泳凝膠；圖13是結合於含有就地澆鑄二氧化矽的200μl移液管尖端部並洗脫下來的、範圍為200～1000bp的線型DNA碎片的電泳凝膠；圖14是結合於含有就地澆鑄超微細二氧化矽的200μl移液管尖端部並洗脫下來的PCR放大DNA的電泳凝膠；圖15是結合於含有鬆散二氧化矽和就地澆鑄膜阻擋層的200μl移液管尖端部並洗脫下來的線型DNA碎片的電泳凝膠；圖16A是一種含有用球形矽膠和聚碸粘結劑製備的就地澆鑄填充顆粒的膜的移液管尖端部的一個縱向剖面的掃描電鏡微觀照片；圖16B是一種含有用球形矽膠和聚碸粘結劑製備的就地澆鑄填充顆粒的膜的移液管尖端部的一個橫截面的掃描電鏡微觀照片；圖17是一種含有就地澆鑄無填充未切割膜的移液管尖端部的一個縱向剖面的掃描電鏡微觀照片。
本發明的詳細說明本文中使用的「膜」這一術語包括有適合於預期用途的孔率、有或無顆粒的透過性和半透過性三維結構物。本文中使用的「複合結構」這一術語包括填充膜。
在本發明的第一種較好實施方案中，熟悉本門技術的人員將認識到，很多不同的顆粒可以用於複合結構，這取決於所得到裝置的預期目標。在吸收性裝置的情況下，理想的裝置將有迅速的吸附動力學、與用途相稱的容量和選擇性，而且能用適當脫附劑洗脫所結合的分析物。適用的吸附性複合結構是用聚合物粘結、填充了顆粒的吸附性膜結構，例如，那些包含用一種粘結劑粘合在一起的色譜珠的膜結構。圖4中說明了一種適用的、用聚合物粘結、填充了顆粒的吸附膜。這種膜包含約80％(重量)二氧化矽和20％(重量)聚礬粘結劑，而且是Millipore公司生產的。圖16A中顯示一種就地澆鑄於移液管尖端部50的類似膜。包含用其它官能團衍生的其它微米級(例如1～30微米)樹脂顆粒的功能性複合結構也是有益的，其中包括基於苯乙烯-二乙烯基苯的介質(不改性或用諸如磺酸、季胺等衍生)；基於二氧化矽的介質(不改性或用C2、C4、C6、C8或C18或離子交換官能團衍生)，以容納對肽、蛋白質、核酸及其它有機化合物的各種各樣應用。熟悉本門技術的人員將認識到，也可以使用有替代選擇性(例如疏水相互作用、親合力等)的其它基體，尤其用於除肽以外的分子類別。本文中使用的「顆粒」這一術語意在涵蓋有規則形狀(如球形)或無規則形狀的顆粒，以及碎片、纖維和粉末，包括金屬粉、塑料粉(如粉末狀聚苯乙烯)、正相二氧化矽、氣相法二氧化矽和活性炭。例如，氣相二氧化矽向聚碸聚合物中的添加導致增加活性表面積，而且適合於各種應用。Amoco公司以UDEL P3500和P1700名稱銷售的聚礬，從所形成複合結構對包括聚丙烯、聚乙烯及其混合物在內的聚烯烴殼體的粘合程度這一點來看，是特別好的。其它適用的聚合物粘結劑包括聚醚礬、乙酸纖維素、乙酸丁酸纖維素、丙烯腈PVC共聚物(商業上以「DYNEL」名稱銷售)、聚偏二氟乙烯(PVDF，商業上以「KYNAR」名稱銷售)、聚苯乙烯和聚苯乙烯/丙烯腈共聚物等。對殼體的粘合可以用熟悉本門技術的人員已知的手段來加強，或用這些複合結構達到類似效果，所述手段包括殼體刻蝕，例如用等離子體處理或化學氧化；殼體內部的環等機械輔助手段；以及把能促進這樣的粘合的添加劑摻入殼體中。粘合使得在澆鑄期間能均勻沉降。
按照本發明的裝置可以包含多種有不同官能團的樹脂材料的複合材料，以便對因電荷、尺寸、親合力和/或疏水性而異的分析物進行分級；此外，還可以組合使用多種含有不同個體功能膜的裝置來達到類似結果。類似地，可以在一種適用殼體中澆鑄一種或多種膜，而且可以在澆鑄前後增加官能度。
按照本發明，本發明的結構物可以用聚合物換相(phase inversion)工藝、空氣澆鑄(蒸發)和熱反轉(thermal inversion)來成形。對於那些只有微小粘合力或無粘合力的系統，所形成的結構物可以單獨製備、插入適當殼體中、用機械手段固定。在較好的方法中，所形成的結構物就地澆鑄於合意的殼體中。這導致在聚合物基體中既能包含大量介質又能依舊保持三維多孔結構。這種膜亞結構充當一種兜住顆粒的支撐網絡，從而消除對玻璃料或多孔塞的需要，因而最大限度減少或甚至消除死體積(該膜的吸附性可以或可不參與吸附過程)。然而，如果合意，也可以加多孔玻璃料塞子。較好的是，所形成的膜或複合結構的形態比(平均直徑與平均厚度之比)為小於約20、更好的是小於約10、特別是小於1。例如，對於吸附性移液管尖端部來說，較好的是形態比為2或更小、更好的是小於1、特別是約0.005～0.5之間。這一範圍內的形態比能提供操作期間樣品在複合結構中的適用滯留時間。
在聚合物換相工藝中，該聚合物的溶劑必須能與驟冷相或反轉相混溶。例如，N-甲基吡咯烷酮是聚碸、聚醚礬和聚苯乙烯的一種適用溶劑。在後一種情況下，聚苯乙烯粒料可以溶於N-甲基吡咯烷酮中和就地澆鑄。所形成的結構顯示出對聚烯烴基殼體的壁的良好粘合力，而且有類似於聚礬的吸附特徵。二甲基亞碸(DMSO)、二甲基甲醯胺、丁酸丙酯和環丁碸也是適用溶劑。N，N-二甲基乙醯胺(DMAC)是PVDF的適用溶劑。水是較好的沉澱劑。聚合物換相工藝一般來說導致該結構膨脹到它在該殼體中的澆鑄溶液體積的大約2～3倍。
在空氣澆鑄工藝中，使用了聚合物粘結劑的揮發性溶劑。例如，在乙酸纖維素的情況下，丙酮是一種適用的揮發性溶劑。空氣澆鑄一般來說導致一種比澆鑄溶液體積小的結構。用這種方法，填充結構中的顆粒應當是至少約30μm，以便不必施加較高的推動力就能流過收縮後的間隙空間。
顆粒數量的上限受澆鑄溶液粘度制約。因顆粒類型而異，可以向該聚合物中添加多達40％(重量)的顆粒而不導致澆鑄溶液太粘，以致無法抽進該殼體中。用較高的溫度，可以達到較高的顆粒添加量。適用的粒度包括有或無孔率、平均直徑範圍為約100納米到約100微米的顆粒。
適用的殼體材料沒有特別限定，而且包括塑料(例如聚乙烯和聚丙烯)、玻璃和不鏽鋼。當含有聚碸、尤其可購自Amoco公司的UDELP3500和P1700聚碸的複合材料就地澆鑄於其中時，從與該複合結構產生的化學粘合力的觀點來看，聚烯烴、尤其聚丙烯是較好的殼體材料。圖16B用一種具有用球形矽膠和聚碸製備的、就地澆鑄於其中的膜的聚丙烯移液管尖端部說明了這樣的粘合力。
適用的殼體構型也沒有特別加以限制，而且包括移液管尖端部、孔、多孔陣列、塑料和玻璃空腔、樣品製備器具，例如可購自Millipore公司的MICROCON微量濃縮器，等。較好的殼體構型是大體上圓柱形的，因為操作期間的流動向量大體上是直的，類似於色譜法，因而最大限度減少或避免對於非圓形構型可能發生的稀釋性衝洗。雖然體積介於約0.1μl與約5ml之間的殼體可以用於就地澆鑄，但較好的是小於約100μl的體積，更好的是約0.1～50μl的體積，特別好的是約0.2～20μl的體積。可以使用體積小至約5微升的移液管尖端部幾何形狀。當複合結構對殼體壁的化學粘合是合意的但不顯著或不存在時，可以用機械手段來把該複合結構保持在殼體中，例如使殼體或其一部分壓扁、壓裝、熱收縮，對殼體或其一部分進行等離子體處理，或者對殼體或其一部分進行化學處理，例如刻蝕，以促進粘合。與殼體壁粘合的一個優點是無需機械手段就能使該複合結構與殼體「密封」。這樣的密封(無論用哪種方法)能防止樣品在操作期間形成溝流或繞過該複合材料。較好的是，本發明的結構物的最終床高為約0.05～約5mm。這考慮了良好洗滌、每單位體積的良好密度、和導致塞子形成期間的均勻沉澱。
本發明的結構物也可以就地澆鑄於有適用幾何形狀的慣用多孔陣列中。此外，如同圖5A～5D中所示，多孔陣列10可以用來作為殼體，例如，通過在孔12中就地澆鑄本發明的結構物11這樣進行。此外，圖5B顯示一個集水系統亞組件13，後者有多個孔12(圖5D中予以放大)，以及其中包含的就地澆鑄結構物。集水系統13可以進行適配，以通過任何適用手段永久性地或可拆卸地耦合到液池陣列10上，例如通過快速裝卸設計，從而形成含有本發明結構物的可脫下「靴子」組件。為方便起見，每個集水系統13都可以含有一種有不同化學性質的顆粒的聚合物基體，從而用戶可因用途而異來選擇適當集水系統13。替而代之或除此之外，填充了顆粒的聚合物基體可以因孔而異。液池殼體10可以是多個開口孔，也可以包括一種膜。
複合結構物和含有複合結構物的本發明微量樣品製備裝置有種類繁多的應用，這取決於顆粒選擇。例如，用途包括肽和蛋白質分析前樣品製備，碳水化合物中肽的脫除，胺基酸分析前淨化，微體積反應用固定酶，微親合力色譜法用固定配體，超捲曲和切割質粒的分離，PCR和DNA產物的淨化，RNA分離用固定寡dT，染料終止區脫除，元素分析用樣品製備等。熟悉本門技術的人員將能困所希望的用途而異來選擇適當顆粒、聚合物粘結劑、顆粒化學性質和幾何形態。在一些情況下，可以在相同的裝置中使用顆粒混合物。替而代之或除此之外，多孔裝置中每個獨立的孔都可以有不同的化學性質。
在本發明結構物沒有填充顆粒的實施方案中，對稱或不對稱的半滲透結構物，或者對稱和不對稱的半滲透結構物的組合，均可形成。在這種實施方案中，較好的成形方法是就地澆鑄於適當殼體中，形成一種適用於基於尺寸或吸附作用的分離(取決於聚合物同一性)的自保持、自支撐結構。可以給這樣一種膜加上官能度，從而不使用顆粒就能執行吸附分離。例如，乙酸纖維素可以用鹼處理以形成纖維素，隨後用一種氧化劑處理以使之有反應性。
在就地成形工藝(要麼有填充要麼無填充的結構)中，較好的成形方法包括藉助於溶劑交換的沉澱，例如，利用任何適用手段(例如在壓力是推動力的情況下利用毛細管作用或利用真空源)把澆鑄溶液引進殼體中。在殼體是移液管尖端部的實施方案中，較好的推動力是一種手持移液管管理器。一旦殼體中所希望的體積充滿了澆鑄溶液，就讓殼體中的澆鑄溶液接觸一種聚合物不溶於其中的液體、較好是水，從而使該聚合物在殼體中析出。這可以通過把該殼體浸入該液體中，和/或用一種推動力例如藉助於真空把該液體吸進該殼體中來實現。通過用水交換出溶劑，該結構物便析出。熟悉本門技術的人員將會知道，用來製備澆鑄溶液的溶劑和非溶劑可以含有各種各樣的添加劑。
在聚合物與沉澱劑剛一接觸時，實際上有瞬時沉澱，從而形成一種半滲透屏障或「皮層」。圖17中把這樣一種屏障圖示為殼體62中的元件60。這一屏障減慢了該亞結構進一步沉澱的速度。一旦沉澱完成，就可以諸如通過在該屏障以上的一點切斷該殼體或通過磨蝕露出的聚合物，取下最初的半滲透屏障60。該半滲透屏障60可以任選地留在原位，以便用無填充結構進行基於尺寸的分離，因為該屏障層起到一種微濾膜的作用。
這種就地澆鑄結構取該殼體的形狀，而且導致一種類似於色譜柱的自保持均勻結構，提供適用於結合/洗脫色譜法(例如，當聚合物基體中包括顆粒時)或適用於其它分析技術或生物化學技術的大表面積。適用的推動力包括離心作用、重力、壓力或真空。
下列實例非限制性地說明本發明的目的和優點。
實例120μl移液管尖端部中的強陽離子交換(SCX)二氧化矽在一個適用小容器中，用N，N-二甲基乙醯胺製備5克7％(重量)PVDF溶液(Pennwalt公司，KYNAR 761)。向此溶液中添加1克SCX、200、15μl(Millipore，PN 85864)球形二氧化矽，用刮鏟充分混合。讓混合物在室溫平衡2小時，然後再次混合。把一支20μl有槽紋的聚丙烯一次性移液管尖端部插入一個常用P-20 Pipetman(Gilson，Ranin等)中，把體積調整設定到20μl。將活塞推到底，把該移液管的尖端部放進澆鑄溶液中。一邊仔細觀察，一邊緩緩提升活塞，以使尖端部充滿約0.5～1μl澆鑄溶液。一旦該尖端部含有足夠液體，就保持等壓，並將移液管尖端部取下、在60℃的去離子水浴中浸漬約5秒鐘。在這個短暫時期之後，釋放活塞上壓力，讓水吸進尖端部中以使聚合物沉澱。當水位達到聚合物高度以上約0.5cm處時，把該尖端部推入該浴中，並使溶劑交換能進行約5分鐘。從水浴中取出該尖端部，磨去位於外部的任何沉澱聚合物。把該尖端部重新插入吸移管管理器中，排出液體。如果流動差，就用一把鋒利的剃刀片切掉端部約0.25mm。為了確保除去所有溶劑，把約5～20μl去離子水吸進和排出若干次。
實例2普通200μl移液管尖端部中的C18二氧化矽在一種適用小容器中，用N-甲基-2-吡咯烷酮製備5克6％(重量)聚碸溶液(Amoco，P3500)。向此溶液中添加2克C18、200、15μm球形二氧化矽(Millipore，PN 85058)，用刮鏟充分混合。讓混合物在室溫平衡2小時，然後再次混合。把一支200μl有槽紋的聚丙烯一次性移液管插入一個普通P-200 Pipetman(Gilson，Ranin等)中，並將體積調整設定到200μl。把活塞推到底部，把移液管端部放進澆鑄溶液中。一邊仔細觀察一邊緩緩提升活塞，使該尖端部充滿約2～5μl澆鑄溶液。一旦尖端部含有足夠液體，就保持等壓，並把尖端部取出、浸入處於室溫的去離子水浴中約5秒鐘。在這一短暫時期之後，釋放活塞上的壓力，將水抽進該尖端部分中使聚合物沉澱。當水位達到該聚合物高度以上約0.5～1cm時，把該尖端部推入該浴中，使溶劑交換能進行約5分鐘。把尖端部從水浴中取出，擰掉位於外部的任何沉澱聚合物。把尖端部重新插入吸移管管理器中、排出液體。如果流動差，則可以用一把鋒利的剃 刀片切掉端部約0.5mm。為確保除去所有溶劑，把約50～200μl去離子水吸進、排出若干次。
實例3大膛孔1000μl移液管尖端部中的60、10μm正相二氧化矽在一個適用的小容器中，用N-甲基-2-吡咯烷酮製備6克6％(重量)乙酸纖維素溶液(伊斯門·柯達公司，398-60)。向此溶液中添加1克60、10μl粒狀矽膠(Davison，Grade 710)，用一把刮鏟充分混合。讓混合物在室溫平衡2小時，然後再次混合。把一支大膛孔1000μl聚丙烯移液管插入一個常用P-1000 Pipetman(Gilson，Ranin等)中並將體積調整設定到1000μl。把活塞壓到底，將移液管端部放進澆鑄溶液中。一邊仔細觀察，一邊緩緩提升活塞，以使該尖端部充滿約10～25μl澆鑄溶液。一旦該尖端部含有足夠的液體，就保持等壓力，並將尖端部移出、浸入去離子水浴中約5秒鐘。在這個短暫時期之後，釋放活塞上的壓力，使水吸進該尖端部以使該聚合物沉澱。當水位達到聚合物高度以上約1cm處時，把尖端部推入水浴中，使溶劑交換能進行約5分鐘。把尖端部從水浴中取出，擦掉位於外部的任何沉澱聚合物。把尖端部重新插入吸移管管理器中，排出液體。如果流動差，就用一把鋒利的剃刀片切掉端部約0.5mm。為確保除去所有溶劑，要吸進、排出約200～1000μl去離子水。
實例4大膛孔200μl移液管尖端部中的氣相法二氧化矽在一個適用的小容器中，用N-甲基-2-吡咯烷酮製備8克7.5％(重量)聚碸溶液(Amoco，P3500)。向此溶液中添加0.5克氣相法二氧化矽(Degussa，Aerosil 200)，用一把刮鏟充分混合。讓混合物在室溫平衡2小時，然後再次混合。把一支200μl大膛孔聚丙烯移液管插入一個常用P-200 Pipetman(Gilson，Ranin，等)中並將體積調整設定到200μl。把活塞壓到底，將移液管端部放進澆鑄溶液中。一邊仔細觀察一邊緩緩提升活塞，使該尖端部充滿約10～25μl澆鑄溶液。一旦該尖端部含有足夠液體，就保持等壓，並將該尖端部移出、浸入去離子水浴中約5秒鐘。在這一短暫時期之後，釋放活塞上的壓力，讓水吸進該尖端部以使該聚合物沉澱。當水位達到聚合物高度以上約1cm處時，把該尖端部推進水浴中，讓溶劑交換進行約5分鐘。把該尖端部從水浴中取出，擦掉位於外部的任何沉澱聚合物。把該尖端部重新插入吸移管管理器上，將液體排出。如果流動差，就用一把鋒利的剃刀片切掉端部約0.5mm。為了確保除去所有溶劑，吸進、排出了約200～1000μl去離子水。
實例5填充了C18、15μm二氧化矽顆粒的就地澆鑄膜在一個小容器中，用N-甲基-2-吡咯烷酮製備5克6％(重量)聚礬溶液(Amoco，P3500)。向此溶液中添加2克C18、200、15μm二氧化矽(Millipore，PN 85864)，用一把刮鏟充分混合。讓混合物在室溫平衡2小時，然後再次混合。用一支移液管或眼藥水滴管，把25～50μl澆鑄溶液分配到適用的器具中。這樣的器具實例包括(但不限於)Millipore Microcon或96孔過濾板的孔。當用這種方法製備器具時，每個室都必須含有一個能截留溶液的半滲透阻擋層(例如聚丙烯纖維、膜等)。一旦添加，該單元就會緩緩排液，以確保該溶液覆蓋整個阻擋層表面。該器具浸入水中約2小時，而且每15分鐘輕輕攪拌一次，以促進溶劑交換。在這一時期之後，把這些單元取下來，視情況而定，或者放進離心機中或者放進抽真空裝置中。這種就地澆鑄結構物用500～1000μl去離子水衝洗，以確保溶劑脫除。
實例6含有鬆散30μl二氧化矽的大膛孔1000μl移液管尖端部中的澆鑄多孔端塞在一個適用小容器中，用N-甲基-2-吡咯烷酮製備5克7.5％(重量)聚礬溶液(Amoco，P3500)。讓混合物在室溫平衡2小時，然後再次混合。把一支1000μl大膛孔聚丙烯移液管插入一個常用P-1000 Pipetman(Gilson，Ranin等)中並將體積調整設定到1000μl。把活塞壓到底，並將移液管端部放進澆鑄溶液中。一邊仔細觀察一邊緩緩提升活塞，使其尖端部充滿約2～10μl澆鑄溶液。一旦尖端部含有足夠液體，就保持等壓，將該尖端部移出、浸入去離子水浴中約5秒鐘。在這一短暫時期之後，釋放活塞上的壓力，讓水吸進該尖端部中以使聚合物沉澱。當水位達到聚合物高度以上約0.5cm處時，將該尖端部推入水浴中，讓溶劑交換能進行約5分鐘。把該尖端部從水浴中取出，擦掉位於外表的任何沉澱聚合物。該尖端部再次插入吸移管管理器中，將液體排出。如果流動差，則用一把鋒利的剃刀片切掉端部約0.5mm。為確保去除所有溶劑，吸進、排出約100～500μl去離子水。撥下移液管，用棉籤除去上室中任何過量的水。稱取5～10mg(250)30μm矽膠，小心添加到該移液管的後端中。讓移液管放流，從而使二氧化矽停留在就地澆鑄阻擋層頂上。如有必要，在上室中配一個適用多孔塞(棉花或聚丙烯)，以防顆粒損失。
實例7過濾用澆鑄半滲透膜塞在一個適用容器中，用N-甲基-2-吡咯烷酮製備5克7.5％(重量)聚碸溶液(Amoco，P3500)。讓混合物在室溫平衡2小時，然後再次混合。把一支1000μl大膛孔聚丙烯移液管插入一個常用P-1000Pipetman吸移管管理器(Gilson，Ranin等)中並將體積調整設定到1000μl。把活塞壓到底，並將移液管端部放進澆鑄溶液中。一邊仔細觀察一邊緩緩提升活塞，使該尖端部充滿約2～10μl澆鑄溶液。一旦該尖端部含有足夠的液體，就保持等壓，並把該尖端部移出、拭去過量聚合物溶液，再把該尖端部浸入去離子水浴中約5秒鐘。在這一短暫時期之後，釋放活塞上的壓力，讓水吸進該尖端部中以使聚合物沉澱。當水位達到聚合物高度以上約0.5cm處時，把該尖端部推入水浴中，讓溶劑交換進行約5分鐘。將該尖端部再次插入吸移管管理器中，把液體排出、用100～200μl去離子水洗滌。當以這種方式澆鑄時，沉澱的聚合物在移液管出口處形成一個半滲透皮膜，這可以用來作為過濾介質。
實例8蒸發法製備的多孔30μl二氧化矽塞子在一個適用容器中，用丙酮製備5克10％(重量)乙酸纖維素溶液(伊斯門·柯達，398-60)。向此溶液中添加1克甲醇、0.5克去離子水和1克250、30μm二氧化矽。讓該混合物在室溫平衡2小時，然後再次混合。把一支1000μl大膛孔聚丙烯移液管插入一個常用P-1000 Pipetman吸移管管理器(Gilson)中並將體積調整設定到1000μl。把活塞壓到底，將移液管端部放進澆鑄溶液中。然後緩緩提升活塞，使該尖端部充滿約5～10μl澆鑄溶液。一旦該尖端部含有足夠液體，就保持等壓，並將該尖端部移去、拭去過量流體、把該尖端部放到一個支架上，使溶劑蒸發約16小時。在這段時間之後，該尖端部用約10μl蒸餾水洗滌。
實例9熱換相法製備的多孔聚乙烯中30μl二氧化矽端塞在一個適用容器中，添加5克珠狀聚乙烯和100克礦物油。混合物在一塊加熱板上攪拌加熱到250℃。當該塑料液化時，添加4克250、30μm二氧化矽，充分混合。用一支有填料泡的1ml刻度玻璃移液管吸進50～100μl該熔體。一旦該尖端部含有足夠液體，就保持等壓，並將該尖端部移出、拭去過量塑料、讓該尖端部冷卻到室溫。把移液管轉移到二氯甲烷浴中1小時，以提取礦物油。然後將其移出、把二氯甲烷排出、使之風乾。
實例10肽樣品製備用C18二氧化矽200μl移液管尖端部由GlyTyr(1)、ValTyrVal(2)、甲硫氨酸腦啡肽(3)、亮氨酸腦啡肽(4)和血管緊張素II(5)組成的混合物(在100μl 0.1％TFA中)中每種肽各約2.5μg吸附到一支含有約5μl澆鑄C18、200、15μm球狀二氧化矽的P200移液管尖端部。將該溶液吸進、排出4次。然後，該尖端部用200μl 0.1％TFA洗滌。結合的肽用80％乙腈的0.1％TFA/水溶液洗脫。洗脫的肽用4份0.1％TFA稀釋，用逆相HPLC(20分鐘時間的線性乙腈梯度為5～30％)分析。然後，把得到的色譜圖與原混合物的色譜圖比較(見圖6和7)。如所預料的，較小且相對親水的GlyTyr、ValTyrVal並沒有結構到C18上。其餘3種(吸附)肽洗脫後的回收率範圍為70～85％。
實例11強陽離子交換二氧化矽200μl移液管尖端部由5種肽(見實例10)組成的混合物(100μl 10％冰醋酸溶液)中每種溶質各約2.5μg吸附到一支含有約5μl澆鑄、包覆了苯乙烯磺酸鹽、300、15μm球形二氧化矽的P 200移液管尖端部上。吸附是在4個完整的吸進-退出循環期間進行的，隨後用100μl 20％甲醇/10mMHCl衝洗。結合的樣品用2×25μl體積的1.4N氫氧化銨/50％甲醇洗脫。洗脫的樣品用逆相HPLC分析，得到的色譜圖與原混合物的色譜圖加以比較(見圖6和8)。強陽離子交換的尖端部結合了除GlyTyr外的所有樣品成分。這樣的表現是與磺酸離子交換樹脂的選擇性一致的。
實例12200μl移液管尖端部中的固定酶胰蛋白酶以共價方式偶合到一種醛活化的300、15μm球形二氧化矽上，並就地澆鑄(20μl)到蛋白質消解用P 200尖端部中。該尖端部內的胰蛋白酶活性是通過用HPLC監測細胞色素的消解來評價的。在15分鐘內使細胞色素C的樣品(100μl 100mM Tris、1mMCaCl2、37℃pH8溶液中10μg)吸收到該尖端部中，利用對一支Eppendorf管的排出/吸進循環，使反應物混合4次。消解物用HPLC分析，採用了在30分鐘內5～45％乙腈的線性梯度(見圖10)。得到的色譜圖顯示，15分鐘後消解了細胞色素C的90％以上(未消解細胞色素C的情況見圖9)。
實例13200μl移液管尖端部中的固定蛋白質A將重組體蛋白質A偶合到預澆鑄的、含有醛活化的300、15μm球形二氧化矽、兔免疫球蛋白(IgG)分離用的P 200尖端部中。RIP緩衝劑(150mM NaCl，1％NP-40，0.5％DOC，0.1％SDS，50mMTris，pH8.0)中1mg/ml IgG和BSA的樣品100μl，通過一支含有40μl含有蛋白質A固定珠的澆鑄體積的尖端部循環6次。然後，該尖端部在洗脫前用4倍體積的RIP緩衝劑洗滌。結合的IgG的脫附是用(2×25μl體積)的6M脲進行的。脫附的樣品用50μl 2×SDS Laemmli樣品緩衝劑稀釋，並在電泳分析之前煮沸3分鐘。這個實驗方案也對只含有聚碸而不含有珠子、起背景對照作用的空白尖端部進行。電泳是在所示的10～16％丙烯醯胺凝膠(見圖11)進行的。樣品如下道9(分子量刻度)；道1～4蛋白質A尖端部洗脫樣品的數量遞增；和道5～8從空白聚礬尖端部洗脫的IgG/BSA的數量遞增。這些結果表明IgG對蛋白質A尖端部的選擇性結合有微不足道的非專一性吸附。進而，在洗滌劑(RIP緩衝劑)的存在下，空白尖端部(道5～8)無論對IgG還是對BSA都不顯示吸附作用。
實例14超捲曲DNA用60、10μm 1000μl移液管尖端部含有質粒pUC 19的大腸桿菌株JM 109在3～5ml含有100μg/ml氨苄青黴素的Luria液體培養基中在37℃生長12～16小時。1.5ml過夜培養物在室溫下在以最大g力旋轉的微型離心分離管中沉降30秒鐘。除去殘餘生長介質，而保持細菌性片狀沉澱物原封不動。然後，利用改進的Birnboim和Doly的鹼性溶菌程序(Birnboim，H.C.and Doly，J.(1979)，Nucleic Acids Res 7.，1513)分離質粒DNA。簡而言之，這種細菌性片狀沉澱物通過渦旋重新懸浮於50μl 50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA和10μg/ml核糖核酸酶A中。其次添加100μl 0.2N NaOH、1％硫酸十二烷酯鈉。得到的懸浮液在室溫下溫育2小時。在添加100μl 3M乙酸鈉溶液(pH4.8)之後，懸浮液通過渦旋混合，然後在微型離心分離管中以最大g力旋轉2分鐘。把清澈的溶菌產物轉移到一支新的微型離心管中，向其中添加pH5.6、在200mM 2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸(MES)中的7M鹽酸胍(GuHCl)，使最終濃度和體積分別為4.4M和700μl。把所得到的溶液用吸移管管理器吸進一支有約60μl含有約60、10μm矽膠的澆鑄膜的1000μl聚丙烯移液管尖端部中。用2～2.5分鐘時間將該溶液吸進-排出，以使DNA溶液與二氧化矽膜基體之間有長時間相互作用。然後，該尖端部用400μl 80％試劑級醇衝洗一次。殘留的醇通過重複驅趕到紙巾上來去除。用100μl 10mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mMEDTA(TE)，通過吸進-排出三遍，從該尖端部上洗脫質粒DNA。洗脫液級分用TE調整到最終體積為100μl。評估了6個尖端部。為了定量質粒DNA回收率，用瓊脂糖凝膠電泳(見圖12)分析了20％的洗脫液以及20％的未結合濾液。該凝膠上包括的是已知濃度的pUC 19質粒DNA樣品(道1～4)。這些實驗的結果表明，平均回收了2.5mg超捲曲質粒(道5、7、9、11)。
實例15線型DNA用大膛孔200μl移液管尖端部中的60、10μm二氧化矽評價了含有約20μl澆鑄的、填充了60、10μm二氧化矽的膜的200μl聚丙烯大膛孔移液管尖端部結合線性化DNA碎片(pBR 322或者用BstNI或者用MspI消解，以產生DNA碎片梯子)或者用PstI和HamHI限制的質粒pBR 322 DNA(產生大的線性限制碎片)的能力。5μg線性化質粒DNA與MES中的GuHCl，pH5.6合併，達到最終濃度為0.5M，體積為150μl。使用前，含有二氧化矽膜的P-200尖端部用(2％)200μl MES中0.5M GuHCl，pH5.6預平衡。把DNA/GuHCl溶液吸進移液管尖端部，並且吸進-排出循環1.5～2.0分鐘，使得在DNA結合混合物與二氧化矽填充膜基體之間能長時間相互作用。然後，這些尖端部用125μl 80％試劑級醇洗滌，以除去鹽及其它汙染物。結合的DNA是用100μl TE通過吸進-排出3遍而從尖端部基體洗脫下來的。為了測定DNA回收率，用瓊脂糖凝膠電泳(見圖13)分析洗脫液和濾液。為了定量DNA的回收量，在道1～4中測定了代表起始原料的100％、75％、50％和25％的樣品。道5、7、9和11是洗脫液。帶強度的估計值表明回收率超過95％。
實例16PCR放大DNA用大膛孔200μl移液管尖端部中的氣相法二氧化矽評價了PCR放大的DNA(500bp)純化用的、含有約20μl固定於聚碸基體中的氣相法二氧化矽的200μl大膛孔聚丙烯移液管尖端部的能力。使用前，尖端部用100μl TE緩衝劑衝洗2遍，然後與500μl200mM MES緩衝劑(pH6.4)中的3M NaI平衡。然後，把取自所收集的PCR料液的50μl樣品(約3μg DNA)與7M NaI合併，使最終NaI濃度為3.0M。添加NaI溶液後的總體積是150μl。用2～3分鐘時間，將此樣品吸進和排出含有填充了氣相法二氧化矽的澆鑄膜的P-200尖端部，使得能與該基體長時間接觸。然後，每個尖端部用125μl80％試劑級醇洗滌，以除去鹽及其它汙染物。通過把尖端部內容物排到紙巾上，除去殘留的醇。結合的PCR產物用50μl TE(pH8.0)洗脫。為了估計DNA回收率，用瓊脂糖凝膠電泳(見圖14)分析了洗脫液和濾液。作為對照，在道1～4中顯示了代表起始原料的100％、75％、50％生25％的負荷。請注意，較低帶的存在表明輕微的引物二聚體汙染。固定的氣相法二氧化矽與NaI一起使用顯然使放大的DNA回收率超過90％。此外，顯然引物二聚體汙染物也減少了(見道5、7、9、11)。
實例17DNA分離用200μl移液管尖端部中含有鬆散30μl二氧化矽的澆鑄多孔端塞含有約5～10μl澆鑄(7.5％)聚碸作為多孔端塞和2～4mg鬆散250、30μm二氧化矽的200μl移液管尖端部，進行了其結合線型和超捲曲質粒DNA的能力的試驗。關於線型DNA，大約5μg pBR 322首先在45μl TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA)、pH8.0溶液中用MspI消解，然後與100μl 200mM MES緩衝劑(pH5.6)中的7M鹽酸胍(GuHCl)合併。該溶液中GuHCl的最終濃度是4.7M。所得到的溶液(一次)吸進200μl移液管尖端部中，通過使吸移管管理器與插入的尖端部顛倒約2分鐘，使之能長時間接觸二氧化矽。然後，如同實施例15中所述，使吸附到尖端部上的DNA洗滌和洗脫下來。作為對照，在道1～4中做了代表起始原料的100％、75％、50％和25％的負荷。利用這種格式的實驗結果表明可以達到75％以上的DNA回收率(見圖15道5和7)。
權利要求
1.一種界定某一體積的殼體，所述殼體在所述體積的一部分中含有一種三維結構，其中包含許多截留在一種多孔聚合物基體中的吸附性顆粒，所述結構的形態比小於約10。
2.權利要求1的殼體，其中所述殼體有第一個開口端和與所述第一個開口端隔開的第二個開口端，且其中所述三維結構是與所述第二開口端鄰接的。
3.權利要求1的殼體，其中所述形態比小於5。
4.權利要求1的殼體，其中含有所述結構的所述體積的所述部分是約0.1微升～約10毫升。
5.權利要求1的殼體，其中所述殼體是一支移液管尖端部，該端部有一個第一端和一個與所述第一端隔開的第二端以及介於兩者之間的所述結構。
6.權利要求5的殼體，其中所述第一端的內徑大於所述第二端的內徑。
7.權利要求1的殼體，其中所述聚合物是從聚碸、聚醚碸、聚四氟乙烯、乙酸纖維素、聚苯乙烯、聚苯乙烯/丙烯腈共聚物和PVDF組成的一組中選擇的。
8.權利要求7的殼體，其中所述聚合物是聚碸、且其中所述殼體包含一種聚烯烴。
9.權利要求8的殼體，其中所述聚烯烴是聚丙烯。
10.權利要求1的殼體，其中所述顆粒是從聚苯乙烯-二乙烯基苯珠、官能化聚乙烯-二乙烯基苯珠、二氧化矽、氣相法二氧化矽、衍生化二氧化矽和活性炭組成的一組中選擇的。
11.權利要求1的殼體，其中所述三維結構包含一個半滲透阻擋層(屏障)。
12.在一個殼體中澆鑄一種複合結構的方法，所述方法包括形成一種聚合物溶液；把顆粒添加到所述溶液中，形成一種澆鑄溶液；把所述澆鑄溶液引進所述殼體中；和使所述澆鑄溶液發生換相，從而使所述聚合物形成一種包含所述顆粒的多孔聚合物基體。
13.權利要求12的方法，其中所述溶液是通過使所述聚合物溶解在一種溶劑中形成的。
14.權利要求12的方法，其中所述溶液是通過使所述聚合物溶解在所述聚合物的一種溶劑和非溶劑的混合物中形成的。
15.權利要求12的方法，其中所述換相是通過使所述殼體中的所述澆鑄溶液接觸一種所述聚合物不溶於其中的液體引起的。
16.權利要求12的方法，其中所述換相是通過所述溶劑的蒸發引起的。
17.權利要求12的方法，進一步包括人所述殼中取出所述多孔聚合物基體，並將所述多孔聚合物基體引進到第二個殼體中。
18.在一個殼體中澆鑄一種膜的方法，所述方法包括形成一種聚合物溶液；把所述溶液引進所述殼體中；和使所述溶液發生換相，從而使所述聚合物在所述殼體中沉澱。
19.權利要求18的方法，其中所述溶液是通過使所述聚合物溶解在一種溶劑中形成的。
20.權利要求18的方法，其中所述換相是通過使所述殼體中的所述溶液接觸一種所述聚合物不溶於其中的液體引起的。
21.權利要求18的方法，進一步包括取出在所述沉澱期間形成的任何半滲透阻擋層。
22.一種界定某一體積的殼體，所述殼體在所述體積的一部分中含有一種三維結構，該結構包含一種多孔聚合物基體，所述結構的形態比小於約10。
23.權利要求22的殼體，其中所述殼體有一個第一開口端和一個與所述第一開口端隔開的第二開口端，且其中所述結構是與所述第二開口端鄰接的。
24.權利要求22的殼體，其中所述形態比小於5。
25.權利要求22的殼體，其中含有所述結構的所述體積的所述部分是約0.1微升～約10毫升。
26.權利要求22的殼體，其中所述殼體是一支移液管尖端部，該端部有一個第一端和一個與所述第一端隔開的第二端以及介於兩者之間的所述結構。
27.權利要求26的殼體，其中所述第一端的內徑大於所述第二端的內徑。
28.權利要求22的殼體，其中所述聚合物是從聚碸、聚醚礬、聚四氟乙烯、乙酸纖維素、聚苯乙烯、聚苯乙烯/丙烯腈共聚物和PVDF組成的一組中選擇的。
29.權利要求28的殼體，其中所述聚合物是聚碸，且其中所述殼體包含一種聚烯烴。
30.權利要求29的殼體，其中所述聚烯烴是聚丙烯。
31.權利要求22的殼體，其中所述三維結構包含一種半滲透阻擋層。
全文摘要
可用作吸附性介質或反應性介質或者用於基於尺寸的分離的複合結構和/或非填充結構(11)的就地澆鑄方法。可使用任何特定的殼體尺寸或構型,而且在實現在聚合物中包含大量吸附性顆粒的同時仍能保持膜三維結構。在第一較好的實施方案中,該複合結構包含截留於一種多孔聚合物基質內的顆粒,而且就地澆鑄到一種殼體例如移液管尖端部中,從而提供一種有效的微質量操作平臺。隨著顆粒化學的適當選擇,實際上可以對各體積中低於1微克的樣品質量負荷進行任何分離或純化操作,包括選擇性結合/洗脫色譜法操作。本發明也涵蓋這些複合結構以及含有這些複合結構的樣品製備裝置。在第二較好實施方案中,自保持、自支撐的結構就地澆鑄於適用殼體(12)中,而且可用於基於尺寸的分離,其中澆鑄結構(11)起到一種半滲透膜阻擋層的作用。本發明也涵蓋這些結構以及含有這些結構的殼體。
文檔編號G01N35/10GK1248926SQ98802852
公開日2000年3月29日 申請日期1998年2月25日 優先權日1997年2月26日
發明者W·科普斯維茨, D·G·舍爾, T·E·阿諾德, V·戈爾 申請人:米利波爾有限公司