大鼠真皮間質幹細胞的培養方法
2023-05-30 15:55:41
大鼠真皮間質幹細胞的培養方法
【專利摘要】本發明公開了一種大鼠真皮間質幹細胞的分離培養方法，此方法是將皮膚組織先消化過夜，再將皮膚組織的真皮和表皮分開，再將真皮組織塊貼於細胞培養皿中倒置37℃培養箱中貼壁半小時，後應用低糖DMEM，10%FBS進行組織塊的培養；真皮組織塊培養至爬出細胞長滿小皿即進行胰酶常規消化傳代培養得到真皮間質幹細胞。本發明方法採用皮膚組織塊貼壁法和酶消化法相結合的新方法，既能夠有效地避免皮膚組織塊貼壁法造成表皮角質細胞汙染又可以避免酶消化法中長時間胰酶作用對細胞生長狀態的影響。本發明為進一步深入研究皮膚組織中間質幹細胞在皮膚發育、生長及損傷修復中的作用提供了可能。
【專利說明】大鼠真皮間質幹細胞的培養方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於細胞的體外培養領域，更具體的，本發明涉及一種大鼠真皮間質幹細胞的分離培養方法。
【背景技術】
[0002]真皮間質幹細胞(dermal fibroblasts)作為皮膚的組織細胞,具有十分重要的生物學功能，主要體現在以下幾個方面:①作為皮膚真皮的基質細胞對維持細胞外基質的平衡和穩定具有重要作用通過分泌細胞因子影響表皮的發育及生長；③調控毛囊等皮膚附屬結構生長和再生；④可以作為間質幹細胞的重要來源，移植修復其他組織器官。體外培養的真皮間質幹細胞對研究皮膚發育過程中真皮和表皮間的相互作用及皮膚損傷再生具有重要意義。
[0003]現有的真皮間質幹細胞細胞培養方法主要有兩種:組織塊的直接貼壁法和Dispase (中性蛋白酶)與胰酶消化法。
[0004]組織塊貼壁法主要是通過將皮膚組織剪成Imm3的組織塊，然後將組織塊貼於培養皿中應用低糖DMEM，10%FBS培養液進行培養一定時間(有成纖維狀細胞爬出生長即可)，將生長的細胞進行消化，由於原代真皮胰酶消化時間比表皮角質細胞短，加入胰酶後先消化下來的細胞即為真皮間質幹細胞，進行傳代即可。此種方法是通過胰酶消化時間的不同區分真皮間質幹細胞和角質細胞，分離培養得到的真皮間質幹細胞混有表皮角質細胞，影響後續的實驗研究。Dispase (中性蛋白酶)與胰酶消化法是將皮膚組織剪成細條狀(寬度大約為:2mm，長約為:1cm)，將剪好的皮膚組織先用Dispase酶4°C消化過夜，將分離好的真皮組織剪碎後應用0.25%的胰酶消化30分鐘，後將消化後的細胞800轉每分鐘離心5分鐘，加入培養液種瓶傳代。由於此種方法經過長時間的胰酶消化，使得到的真皮細胞的生長狀態受到極大的影響，這樣的細胞用於後續的實驗研究得到的數據就會不穩定。
`[0005]由此可見，目前真皮間質幹細胞的培養方法存在弊端，而真皮間質幹細胞在皮膚組織的發育和組織修復再生中具有重要作用，因此獲得表皮細胞汙染少狀態又好的真皮間質幹細胞培養方法的確立是非常必要的。
【發明內容】
[0006]基於此本專利提供了一種新的大鼠真皮間質幹細胞的分離培養方法。
[0007]—種培養大鼠真皮間質幹細胞的分離培養方法，包括取大鼠背部皮膚組織剪成細條狀的步驟，然後將剪好的皮膚組織用0.25%的Dispase酶4°C冰箱中消化過夜；用含有雙抗的PBS洗滌一遍，再將皮膚組織的真皮和表皮分開，將真皮組織放入含有雙抗的PBS中洗滌一次後剪成Imm3的組織塊；真皮組織塊貼於細胞培養皿中倒置37°C培養箱中貼壁半小時，後應用低糖DMEM，10%FBS進行組織塊的培養；真皮組織塊培養48h到96h後即有成纖維狀細胞爬出，當爬出細胞長滿小皿即可進行胰酶常規消化傳代培養得到真皮間質幹細胞。
作為具體的實例，本發明包括以下步驟:[0008](I)將出生1-2天的大鼠乳鼠斷頸處死，放入消毒酒精中浸泡5分鐘，後在超淨工作檯中取出，無菌IOcm大皿中PBS洗滌三次；
[0009](2)將消毒酒精洗淨的乳鼠背頸部的皮膚剪開，用眼科鑷拽住頭部和背部皮膚用力將皮膚組織撕下，將取好的背部皮膚放入含有青黴素和鏈黴素雙抗的PBS中浸泡5分鐘；
[0010](3)將取好的背部皮膚組織剪成細條狀(寬度大約為:2mm，長約為:1cm)，將剪好的皮膚組織用0.25%的Dispase酶4°C冰箱中消化過夜；
[0011](4)將0.25%的Dispase酶消化過夜的皮膚組織塊用含有雙抗的PBS洗滌一遍，用眼科鑷分別夾住皮膚組織的真皮和表皮(表皮相對較薄並成毛玻璃樣)將兩者分開，將真皮組織放入含有雙抗的PBS中洗滌一次後剪成Imm3的組織塊；
[0012](5)，將此步驟(4)中獲得的真皮組織塊貼於細胞培養皿(3.5cm小皿)中倒置37°C培養箱中貼壁半小時，後應用低糖DMEM，10%FBS進行組織塊的培養；
[0013](6)真皮組織塊培養48h到96h後即有成纖維狀細胞爬出，當爬出細胞長滿小皿即可進行胰酶常規消化傳代培養得到真皮間質幹細胞。
[0014]在其中一個實例中，步驟(1)中應用乳鼠作為分離真皮間質幹細胞的皮膚來源，利用乳鼠培養的原代的細胞狀態和傳代數量明顯增加。
[0015]在其中一個實例中，步驟(3)中將皮膚組織剪成細條狀(寬度大約為:2mm，長約為:1cm),並且Dispase酶的濃度為0.25%, 4°C冰箱中消化過夜效果最佳。
[0016]在其中一個實例中，步驟(3)中將皮膚組織應用Dispase酶消化以分離表皮和真皮，本發明採取了酶消化法和組織塊培養法相結合新的真皮間質幹細胞的培養方法，這種新方法經過Dispase酶的消化，將表皮分離掉能夠有效的避免表皮角質細胞對真皮間質幹細胞的汙染。`
[0017]在其中一個實例中，步驟(5)中Dispase酶消化將分離表皮之後的真皮組織剪成Imm3的組織塊再進行組織塊的培養，本發明採取了酶消化法和組織塊培養法相結合的真皮間質幹細胞分離培養方法，這種方法把真皮組織剪成Imm3的組織塊進行貼壁培養，避免了胰酶的長時間消化對原代細胞狀態的影響。
[0018]在其中一個實例中，步驟(5)中真皮Imm3組織塊倒置培養箱中貼壁應在30min左右，時間過短貼壁不牢固，貼壁時間過長組織塊易乾燥影響細胞爬出效率；
[0019]在其中一個實例中，步驟(6)中真皮組織塊培養48h到96h後即有成纖維狀細胞爬出即可對組織塊中周圍的細胞進行消化，此段時間角質細胞等雜細胞生長的可能性很低，這樣此種新方法在保證原代細胞培養數量的同時避免其他細胞的汙染。
[0020]本發明在原有的大鼠真皮間質幹細胞的分離培養方法上做了重要改進，將直接的組織塊培養法和雙酶(Dispase酶和胰酶)消化法相結合，分別利用兩種方法的優點，先用Dispase進行消化，將表皮組織進行剝離，能夠有效的避免表皮角質細胞的汙染，後將分離表皮的皮膚組織進行組織塊貼壁培養就避免了胰酶長時間消化對細胞的損傷，使細胞的狀態更佳。
[0021]本發明建立了一套分離、培養及鑑定大鼠真皮間質幹的新方法，證實該方法獲得了活性更高純度更高的真皮間質幹細胞，同時對本發明所得細胞的表面標記、成骨成脂分化能力的檢測證實本發明所得細胞為間質幹細胞，從而為進一步深入研究真皮間質幹細胞增殖、分化及皮膚組織發育，損傷修復中病理生理情況下的功能變化提供了可能。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1為本分離培養大鼠真皮間質幹細胞的方法示意圖。
[0023]圖2為倒置相差顯微鏡觀察真皮組織塊中爬出成纖維狀細胞(40倍)。
[0024]圖3為倒置相差顯微鏡觀察本發明分離培養的細胞和酶消化法得到的細胞狀態的比較(40倍)；其中A-本發明獲得真皮間質幹細胞，B-酶消化法獲得真皮間質幹細胞。
[0025]圖4為RT-PCR檢測本發明分離培養細胞及直接組織塊培養法獲得細胞中表皮標記CK19的表達情況。其中1-本發明獲得細胞；2_直接組織塊貼壁法獲得細胞。
[0026]圖5為流失細胞儀對本發明分離培養真皮間質幹細胞細胞乾性表面標記的檢測(CD29，CD44, CD90 及 CD45)。
[0027]圖6為成骨誘導檢測發明分離培養真皮間質幹細胞細胞的成骨能力(100倍)。
[0028]圖7為成脂誘導檢測發明分離培養真皮間質幹細胞細胞的成脂能力(400倍)。 具體實施實例
[0029]以下實例所使用的主要材料和來源分別如下:
[0030]SD大鼠的I天齡乳鼠(江蘇大學動物實驗中心，此實驗由江蘇大學倫理委員會批准)；
[0031]0.25%膜蛋白酶(Amresco) ；0.25%Dispase中性蛋白酶(Gibco)；自配憐酸緩衝液PBS ;低糖 DMEM (Gibco); 胎牛血清 FBS (Gibco)；
[0032]細胞培養皿(3.5cm小皿)(corning);細胞培養瓶(corning);
[0033]CD44，CD29，CD90，CD45 及 IgG-FITC 對照的流失抗體；
[0034]間質幹細胞成脂誘導液(cyagen);間質幹細胞成骨誘導液(自行配置)；
[0035]以下結合附圖和實例詳細說明本發明。
[0036]實施例1，結合技術路線圖1，對本發明具體實施步驟描述如下:
[0037](I)於江蘇大學實驗動物中心購買於當天出生SD大鼠乳鼠6隻進行斷頸處死，放入消毒酒精中浸泡5分鐘，後在超淨工作檯中取出，放入無菌IOcm大皿中PBS洗滌三次；
[0038](2)將消毒酒精浸泡並經PBS洗淨的乳鼠背頸部的皮膚剪開，用眼科鑷拽住頭部和背部皮膚稍用力將背部皮膚組織撕下，將取好的背部皮膚放入含有青黴素和鏈黴素雙抗的PBS中浸泡5分鐘；
[0039](3)將取好的背部皮膚組織的皮下脂肪和血管等皮下組織剔除乾淨(皮下組織剔除乾淨的皮膚組織無明顯的紅色血管)，後將皮膚組織剪成細條狀(寬度大約為:2_，長約為:1cm)，將剪好的皮膚組織浸入0.25%的Dispase酶4°C冰箱中消化過夜；同時也將皮下組織剔除乾淨的皮膚組織剪成Imm3的組織塊，貼於細胞培養皿(3.5cm小皿)中作為皮膚組織塊貼壁法的對照；
[0040](4)將0.25%的Dispase酶消化過夜的皮膚組織塊用含有雙抗的PBS洗滌一遍，用眼科鑷分別夾住皮膚組織的真皮和表皮(表皮相對較薄並成毛玻璃樣)將兩者分開，把分離表皮的真皮組織放入含有雙抗的PBS中洗滌一次；
[0041](5)把分離得到的真皮 組織剪成Imm3的組織塊，然後將此組織塊貼於細胞培養皿(3.5cm小皿)中倒置37°C培養箱中貼壁半小時，後應用低糖DMEM，10%FBS進行組織塊的培養；與此同時應用0.25%的胰酶對真皮組織消化30min，收集細胞800轉每分鐘離心5分鐘，將離心後得到細胞種瓶作為酶消化法的對照；
[0042](6)真皮組織塊培養48h到96h後即有成纖維狀細胞爬出，當爬出細胞生長到一定密度後即可進行胰酶消化傳代培養做下一步的鑑定(圖2)。
[0043]實施例2，將本發明所得真皮間質幹細胞與對照方法(直接皮膚組織塊貼壁法和酶消化法)所得細胞進行比較:
[0044]應用倒置顯微鏡對本發明方法與酶消化法所得P2代真皮間質幹細胞的生長狀態進行觀察比較，結果顯示本發明方法所得細胞的生長狀態明顯優於酶消化法，能夠有效地的避免長時間的酶消化對細胞造成的損傷(圖3)；
[0045]應用RT-PCR技術對本發明方法與皮膚組織塊直接貼壁法所得P2代真皮間質幹細胞中表皮指標CK19的檢測(內參基因為:β -actin),結果顯示由於本發明方法是先用Dispase酶將表皮組織剝離，所以本發明所得真皮間質幹細胞中表皮角質細胞的汙染明顯少於皮膚組織塊直接貼壁法，有效地避免了皮膚組織塊直接貼壁法角質細胞汙染嚴重的弊立而(圖4)；
[0046]CK19及β -actin的引物序列如下如表1，
[0047]表1
【權利要求】
1.一種大鼠真皮間質幹細胞的分離培養方法，包括取大鼠背部皮膚組織剪成細條狀的步驟，其特徵在於將剪好的皮膚組織用0.25%的Dispase酶4°C冰箱中消化過夜，用含有雙抗的PBS洗滌一遍，再將皮膚組織的真皮和表皮分開，將真皮組織放入含有雙抗的PBS中洗滌一次後剪成Imm3的組織塊；真皮組織塊貼於細胞培養皿中倒置37°C培養箱中貼壁半小時，後應用低糖DMEM，10%FBS進行組織塊的培養；真皮組織塊培養48h到96h後即有成纖維狀細胞爬出，當爬出細胞長滿小皿即可進行胰酶常規消化傳代培養得到真皮間質幹細胞。
2.根據權利要求1所述的大鼠真皮間質幹細胞的分離培養方法，其特徵在於大鼠背部皮膚組織來源於乳鼠。
3.根據權利要求1所述的大鼠真皮間質幹細胞的分離培養方法，其特徵在於細條狀為寬度2臟,長1 cm。
【文檔編號】C12N5/077GK103881970SQ201410085659
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月10日 優先權日:2014年3月10日
【發明者】張斌, 許文榮, 錢暉, 朱偉, 張徐, 王梅, 吳曉丹, 朱豔華, 史惠 申請人:江蘇大學