一種檢測pik3ca基因突變的試劑盒的製作方法

2023-05-31 06:15:16 2

一種檢測pik3ca基因突變的試劑盒的製作方法
【技術領域】
[0001 ] 本發明設及一種檢測PIK3CA基因突變的試劑盒。
【背景技術】
[0002] PIK3CA基因是由Volinia在1994年利用原位雜交技術檢測到的，編碼I類憐脂酷肌 醇-3-激酶(911〇3911日1:1(171;[]1〇-3；[1:013-4;[]1日36 3，？131(3)的9110催化亞單位。第9外顯子和 第20外顯子的突變不僅可W減少細胞的調亡還可W促進腫瘤的浸潤、提高其下遊激酶 PI3KS的活性。其突變提高其下遊激酶PI3KS的活性，可W減少細胞的調亡還可W促進腫瘤 的浸潤。目前，臨床上的檢測方法需要先進行基因片段擴增，然後利用測序的方法檢測基因 突變。該方法成本較高，檢測費用昂貴。而且，由於在基因片段擴增過程中，對突變基因和野 生基因都進行了同等程度的擴增，因此在測序檢測時靈敏度不高，僅有10%左右，且操作比 較繁瑣，耗時較長。此外，對於血液標本，由於靈敏度低，所W很難從中檢測到突變。

【發明內容】

[0003] 針對上述現有技術，本發明提供了一種檢測PIK3CA基因突變的試劑盒，其具有靈 敏度高、檢測結果準確可靠等優點。
[0004] 本發明是通過W下技術方案實現的：
[0005] -種檢測PIK3CA基因突變的試劑盒，包括W下序列的膚核酸和特異性引物：
[0006] (1)針對PIK3CA基因第9外顯子的膚核酸和特異性引物：
[0007] 所述膚核酸的序列為:5'-1'口'64441'〔4口'646〔46-3'；如沈9 10備.1所示；
[000引所述特異性引物的序列為：
[0009] 正向引物:5'-GAGACAATGAATTAAGGGAAAATGA-3' ；如沈Q ID NO.2所示；
[0010] 反向引物：5'-口'〇：414644441'口'1'1'口'(：口'6口'-3'；如沈9 10備.3所示；
[0011] (2)針對PIK3CA基因第20外顯子的膚核酸和特異性引物： [001^所述膚核酸的序列為:5'-16416〔4〔41'〔416616-3'；如沈9 10^).4所示；
[0013] 所述特異性引物的序列為：
[0014] 正向引物：5'-16〔414〔47^644464〔(：口'46-3'；如沈9 10備.5所示；
[0015] 反向引物：5'-441〇：41'1'1'1761761〇：46〇：4-3'；如沈9 10備.6所示；。
[0016] 進一步地，所述試劑盒中還包括PCR反應所必需的反應原料和試劑。
[0017]所述PCR反應所必需的反應原料和試劑包括:PCR緩衝液，Mg2+和dNTPs的反應混合 物，Taq酶，SuperGreen染料，超純水。
[0018] -種利用上述試劑盒檢測PIK3CA基因突變的方法，包括W下步驟：
[0019] (1)提取待檢測樣本(包括各種臨床標本，尤其適用於血液標本）的DNA(按照常規 的DNA提取試劑盒說明書進行操作即可）；
[0020] (2) W上述提取的DNA為模板，利用上述檢測PIK3CA基因突變的試劑盒進行定量 PCR擴增，檢測A Ct值（A Ct = Sample+pNA-Sample-pNA)，設立質控對照（質控品必須添加，陽性 質控品為經測序證實PIK3CA基因突變陽性的細胞株DNA;陰性質控品為經測序證實PIK3CA 基因突變陰性的細胞株DNA);
[0021] 所述PCR擴增程序為:95 °C 5分鐘;95 °C 10秒，70 °C 20秒，58 °C 20秒，70 °C 20秒，重複 45個循環；
[0022] (3)判斷:若ACt>8,則待檢測樣本的PIK3CA基因的基因型為野生型;若ACt別寸，標本為野生型；ACt A;p.E545K突變細胞系： 化D-1;第20外顯子c.3140A>G;p.化047R突變細胞系：肥T116)及陰性細胞系A549【均購買 自美國模式培養物研究所(American Type Qilture Collection)(Manassas,VA，USA)】。提 取其DM,定量。將最終濃度稀釋到25ng/ul。
[0046] (2)將陰性細胞系DNA按不同比例滲入陽性細胞系DNA中，最終製備出陽性DNA比率 不同的樣品（50% ,25% ,12.5% ,6.25% ,3.125% ,1.5% ,0.75% ,0.38% ,0.19%，0%)。
[0047] (3)分別取化1不同陽性比率的DNA直接進行加與不力昨NA的定量PCR擴增，PCR體系 共20ul，包括化 1 10XPNA;正反向引物各0.加 l;lu]_Taq酶；Iul SuperGreen染料；IOul PCR 反應液;4ul出0或6ul出0(不加 PNA)。使用ROCHE Li曲t切cler480定量PCR儀。95°C5分鐘；95 °C 10秒，70 °C 20秒，58 °C 20秒，72 °C 20秒，重複45個循環。
[004引結果如圖l~10，W及表l所示。若WACt>別寸，標本為野生型；ACt 8，則待檢測樣本的PIK3CA基因的基因型為野生型;若Δ Ct <8，則待 檢測樣本的PIK3CA基因的基因型為突變型。5. 根據權利要求4所述的方法，其特徵在於:所述所述PCR擴增程序為:95 °C 5分鐘;95 °C 10秒，70 °C 20秒，58 °C 20秒，70 °C 20秒，重複45個循環。
【專利摘要】本發明公開了一種檢測PIK3CA基因突變的試劑盒，包括以下序列的肽核酸和特異性引物：(1)針對PIK3CA基因第9外顯子的肽核酸和特異性引物：如SEQ ID NO.1～3所示；(2)針對PIK3CA基因第20外顯子的肽核酸和特異性引物：如SEQ ID NO.4～6所示。利用上述試劑盒檢測PIK3CA基因突變的方法，包括以下步驟：(1)提取待檢測樣本的DNA；(2)以上述提取的DNA為模板，利用上述檢測PIK3CA基因突變的試劑盒進行定量PCR擴增，檢測ΔCt值；(3)判斷：若ΔCt＞8，則待檢測樣本的PIK3CA基因的基因型為野生型；若ΔCt＜8，則待檢測樣本的PIK3CA基因的基因型為突變型，具有操作簡便，耗時短，靈敏度高，檢測結果準確可靠等優點。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105713965
【申請號】CN201510836702
【發明人】宋現讓, 曾倩
【申請人】宋現讓