長鏈扣手探針的生物合成方法
2023-04-26 16:52:26
專利名稱：長鏈扣手探針的生物合成方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，尤其涉及ー種長鏈扣手探針的生物合成方法。
背景技術：
扣手探針(Padlockprobes)又稱為開環探針(Open circle probes),其與 生物晶片技術結合，現在已發展出一種高通量的單核苷酸多態性(Single nucleotidepolymorphisms SNP)分型技術。SNP是人類遺傳多樣性中最廣泛存在的多樣性,這些分子遺傳上的變化與人類的健康和疾病密切相關。開環探針就是沒有閉合的環形探針，是一條5』末端被磷酸化的寡聚核苷酸，其5』末端和3』末端各有長度為15-20nt (核苷酸)的序列與模板序列互補配對，3』末端帶有ー個等位基因特異的鹼基，當與互補序列完美配對後，在T4DNA連接酶的作用下，其5』末端與3』末端被連接形成環形的分子，不能與互補序列完美配對的開環探針不能環化，依然保持開環狀態。目前，扣手探針的合成主要有兩種方法ー種是化學合成，另ー種是基於PCR(Polymerase chain reaction)的酶法合成。基於扣手探針與生物晶片的SNP分型技術要求高質量的扣手探針，這種扣手探針除了序列沒有錯誤之外，還要求完整的5』末端與3』末端，並且扣手探針長度在IOOnt以上。化學合成5』端磷酸化的長鏈扣手探針所面臨的障礙主要是第一，化學合成的質量與產量隨著扣手探針的長度的增加而降低，在化學合成中，每ー步的合成效率大約是99%，因此，對於含有150個核苷酸的扣手探針，總的合成效率大約是0. 99149 = 0. 22 ;第二，隨著扣手探針長度的増加，其純化的難度也上升。現有的PAGE與HPLC純化方法是根據寡核苷酸的長度來純化的，隨著寡核苷酸長度的増加，全長寡核苷酸與缺失1-2個核苷酸的非全長的寡核苷酸通過PAGE或者HPLC純化方法很難完全分開，同時也不能區分出現合成錯誤的全長的寡核苷；第三，隨著扣手探針長度的増加，其出現的ニ級結構可能性也加大，而ニ級結構也降低PAGE和HPLC的純化效率；第四，化學合成長鏈扣手探針的成本很高。而基於PCR法合成的扣手探針，其主要缺點是合成量小，大量合成成本極高，同時，部分探針的3』末端不完整。因此，尋求新的合成長鏈扣手探針是ー種必然。
發明內容
本發明的ー個目的是提供長鏈扣手探針生物合成方法。本發明提供的方法，包括如下步驟A、在扣手探針主體片段兩端分別添加與待測基因5』端互補的DNA片段I和與待測基因3』端互補的DNA片段2，得到探針前體；所述DNA片段I的5'末端含有雙鏈DNA限制性內切酶MlyI識別位點，所述DNA片段2的3'末端含有雙鏈DNA單鏈切刻酶Nb. Bts I識別位點；所述扣手探針主體片段為如下I或II :
I的核苷酸序列 為序列表中序列I自5』末端第24-125位寡核苷酸；II的核苷酸序列為序列表中序列2自5』末端第24-125位寡核苷酸；B、將步驟A)得到的探針前體插入pOCP載體的多克隆位點間，得到重組載體；C、用雙鏈DNA限制性內切酶MlyI和雙鏈DNA單鏈切刻酶Nb. Bts I酶切步驟B)得到的重組載體，即得到扣手探針。步驟A)中，所述在扣手探針主體片段兩端分別添加與待測基因5』端互補的DNA片段I和與待測基因3』端互補的DNA片段2的方法包括如下步驟I)將探針主體片段拆分成如下24nt-52nt的小片段，人工合成所述各小片段Aspl_Com CTCGTGTATGTCACGTGGCTAACTGGTCCAGTAGAGGTGGTCAGGCAATG ；Link_Aspl GACATACACGAGCTCCCTTTGTAG ；Tag_7897 TGCGTCGGTAGAATGAGGTATTGTGGGTACTGGGTCTGAACTACAAAGGGAG ；Asp2_Com GCAGGATCTTACTCCGCAATAACTGGTCCAGTAGAGGTGGTCAGGCAATG ；Link_Asp2 GTAAGATCCTGCCTCCCTTTGTAG ；2)連接Aspl_Com、Link_Aspl、Tag_7897，得到探針主體片段I的互補片段(探針主體片段I的互補片段與探針主體片段I反向互補)；或連接Asp2_Com、Link_Asp2、Tag_7897，得到探針主體片段II的互補片段(探針主體片段II的互補片段與探針主體片段II反向互補);3)以探針主體片段I的互補片段為模板，7897A_F1和7897A_R1為引物，進行PCR擴增，得到第一輪PCR產物，以第一輪PCR產物為模板，7897A_F2和7897A_R2為引物，進行PCR擴增，得到PCR產物1，即為探針前體I ;或以探針主體片段II的互補片段為模板，7897A_F1和7897A_R1為引物，進行PCR擴增，得到第一輪PCR產物，以第一輪PCR產物為模板，7897A_F2和7897G_R2為引物，進行PCR擴增，得到PCR產物2，即為探針前體2 ；所述7897A_F1 的核苷酸序列如下所示CTCGITCTGGCTTAGGCAITGCCTGACCACC ；所述7897A_R1 的核苷酸序列如下所示GAAAGCTGTGAAAGGTGCGTCGGTAGAATG ；所述7897A_F2 的核苷酸序列如下所示GAGTCTTCCTAGTCTITCTCGITCTGGCTTAG ；所述7897A_R2 的核苷酸序列如下所示GCAGTGAGAGCGGAAAGCTGTGAAAGG ；所述7897G_R2 的核苷酸序列如下所示GCAGTGGGAGCGGAAAGCTGTGAAAGG ；步驟B)中，所述多克隆位點為EcoRI識別位點； 所述pOCP載體的核苷酸序列為序列表中的序列5 ；步驟C)中，還包括如下步驟4)將所述酶切得到的酶切產物凝膠電泳分離，回收146nt的片段；5)將步驟4)得到的146nt的片段，進行反向層析，收集層析洗脫液，凍幹，即為扣手探針。步驟B)中，所述凝膠電泳採用5% (質量百分含量)尿素變性聚丙烯醯胺凝膠；步驟C)中，所述反向層析中採用如下溶液進行洗脫將30ml己腈和70ml去離子水混合得到的溶液；所述反向層析中採用的層析柱為Sep_PakC18柱。上述的方法製備得到的扣手探針也是本發明保護的範圍。
上述的方法在合成5』端磷酸化的長寡聚核苷酸中的應用也是本發明保護的範圍，所述長寡聚核苷酸為大於IOOnt的寡聚核苷酸。本發明的另ー個目的是提供一種扣手探針。本發明提供的探針，從5』至3』依次為與待測基因5』端互補的左側寡核苷酸、探針主體片段和與待測基因3』端互補的右側寡核苷酸；所述探針主體片段為序列表中序列I自5』末端的第24-125位寡核苷酸或序列表中序列2自5』末端的第24-125位寡核苷酸。所述與待測基因5』端互補的左側寡核苷酸為序列表中序列I自5』末端的第1-23位寡核苷酸或序列2自5』末端的第1-23位寡核苷酸；所述與待測基因3』端互補的右側寡核苷酸為序列表中序列I自5』末端的第126-146位寡核苷酸或序列表中序列2自5』末端的第126-146位寡核苷酸；所述扣手探針的5』末端磷酸化，具體為所述左側寡核苷酸自5』末端起第一位核苷酸的第5位C上連接磷酸基團。含有所述扣手探針的試劑盒也是本發明保護的範圍。含有所述扣手探針及其互補鏈的重組載體或重組菌也是本發明保護的範圍，所述重組載體為將所述扣手探針及其互補鏈插入到pOCP的EcoRI酶切位點處得到的載體；所述質粒POCP的核苷酸序列為序列表中的序列5。所述扣手探針在生物SNP鑑定中的應用；或所述試劑盒在生物SNP鑑定中的應用；或所述重組載體或重組菌在生物SNP鑑定中的應用；以上應用均是本發明保護的範圍。所述生物為植物，所述植物具體為擬南芥；所述擬南芥SNP為擬南芥第4號染色體的第1055234位核苷酸的多態性；所述擬南芥第4號染色體的第1055234位核苷酸的多態性具體為擬南芥第4號染色體的第1055234位核苷酸為A或G。本發明的實驗證明，扣手探針的生物合成，首先通過PCR方法產生扣手探針前體，將扣手探針前體與載體pGEM-T Easy Vector (Promega)連接得到重組載體,酶切後將帶有扣手探針前體的片段與純化扣手探針專用的載體POCP連接，經酶切後通過凝膠電泳分離扣手探針，凝膠分離的扣手探針溶液通過Sep-Pak C18反相層析柱純化，經凍幹脫水後得到聞質量的扣手探針。
圖I為pGEM-7897A物理圖譜圖2為質粒pGEM-7897A與pGEM_7897G的酶切產物圖3為pOCP的物理圖譜圖4為p0CP-7897A的物理圖譜圖5為質粒p0CP-7897A的酶切產物
圖6為合成的扣手探針BKN000007897A的鑑定圖7 為合成的扣手探針 PR0BE_BKN000007897A 與 PR0BE_BKN000007897G 的特異連接圖8為滾環擴增(RCA)反應進行SNP鑑定
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
實施例I、長鏈扣手探針BKN000007897A和BKN000007897G的獲得I、扣手探針 BKN000007897A 和 BKN000007897G 的結構與設計BKN000007897 為擬南芥(Arabidopsis thaliana) (genbank accessionnumber AF069298中第55730位核苷酸的多態性)的ー個SNP，位於第4號染色體的 1055234_1055234bp,其中 Columbia(Col)野生型的純合子基因型為 AA, Landsbergerecta(Ler)野生型的純合子基因型為GG，其旁側序列分別為左側序列5』 -CCTAAGCCAGAACGAGAAAGACT-3，右側序列5，-G (A) GAGCGGAAAGCTGTGAAAGG-3 』扣手探針BKN000007897A特異識別等位基因A，扣手探針BKN000007897G特異識別等位基因G，兩條扣手探針的長度均為146nt，且5』末端磷酸化，設計序列和結構說明見表
Io表I.扣手探針BKN000007897A和BKN000007897G的設計序列與結構說明
權利要求
1.一種長鏈扣手探針的生物合成方法，包括如下步驟 A、在扣手探針主體片段兩端分別添加與待測基因5』端互補的DNA片段I和與待測基因3』端互補的DNA片段2，得到探針前體； 所述DNA片段I的5'末端含有雙鏈DNA限制性內切酶MlyI識別位點，所述DNA片段2的3'末端含有雙鏈DNA單鏈切刻酶Nb. Bts I識別位點； 所述扣手探針主體片段為如下I或II : I的核苷酸序列為序列表中序列I自5』末端第24-125位寡核苷酸； II的核苷酸序列為序列表中序列2自5』末端第24-125位寡核苷酸； B、將步驟A)得到的探針前體插入pOCP載體的多克隆位點間，得到重組載體； C、用雙鏈DNA限制性內切酶MlyI和雙鏈DNA單鏈切刻酶Nb.Bts I酶切步驟B)得到的重組載體，即得到扣手探針。
2.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於 步驟A)中，所述在扣手探針主體片段兩端分別添加與待測基因5』端互補的DNA片段I和與待測基因3』端互補的DNA片段2的方法包括如下步驟 1)將探針主體片段拆分成如下24nt-52nt的小片段，人工合成所述各小片段 Aspl_Com CTCGTGTATGTCACGTGGCTAACTGGTCCAGTAGAGGTGGTCAGGCAATG ；Link_Aspl GACATACACGAGCTCCCTTTGTAG ；Tag_7897 TGCGTCGGTAGAATGAGGTATTGTGGGTACTGGGTCTGAACTACAAAGGGAG ；Asp2_Com GCAGGATCTTACTCCGCAATAACTGGTCCAGTAGAGGTGGTCAGGCAATG ；Link_Asp2 GTAAGATCCTGCCTCCCTTTGTAG ； 2)連接Aspl_Com、Link_Aspl、Tag_7897,得到探針主體片段I的互補片段； 或連接Asp2_Com、Link_Asp2、Tag_7897,得到探針主體片段II的互補片段； 3)以探針主體片段I的互補片段為模板，7897A_F1和7897A_R1為引物，進行PCR擴增，得到第一輪PCR產物，以第一輪PCR產物為模板，7897A_F2和7897A_R2為引物，進行PCR擴增，得到PCR產物1，即為探針前體I ; 或以探針主體片段II的互補片段為模板，7897A_F1和7897A_R1為引物，進行PCR擴增，得到第一輪PCR產物，以第一輪PCR產物為模板，7897A_F2和7897G_R2為引物，進行PCR擴增，得到PCR產物2，即為探針前體2 ； 所述 7897A_F1 的核苷酸序列如下所示CTCGTTCTGGCTTAGGCATTGCCTGACCACC ； 所述 7897A_R1 的核苷酸序列如下所示GAAAGCTGTGAAAGGTGCGTCGGTAGAATG ； 所述 7897A_F2 的核苷酸序列如下所示GAGTCTTCCTAGTCTTTCTCGTTCTGGCTTAG ； 所述 7897A_R2 的核苷酸序列如下所示GCAGTGAGAGCGGAAAGCTGTGAAAGG ； 所述 7897G_R2 的核苷酸序列如下所示GCAGTGGGAGCGGAAAGCTGTGAAAGG ； 步驟B)中，所述多克隆位點為EcoRI識別位點； 所述pOCP載體的核苷酸序列為序列表中的序列5 ； 步驟C)中，還包括如下步驟 4)將所述酶切得到的酶切產物凝膠電泳分離，回收146nt的片段； 5)將步驟4)得到的146nt的片段，進行反向層析，收集層析洗脫液，凍幹脫水，即為扣手探針。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其特徵在於 步驟B)中，所述凝膠電泳採用5% (質量百分含量)尿素變性聚丙烯醯胺凝膠； 步驟C)中，所述反向層析中採用如下溶液進行洗脫將30ml己腈和70ml去離子水混合得到的溶液； 所述反向層析中採用的層析柱為Sep_PakC18柱。
4.權利要求1-3任一所述的方法製備得到的扣手探針。
5.權利要求1-3任一所述的方法在合成5』端磷酸化的長寡聚核苷酸中的應用，所述長寡聚核苷酸為大於IOOnt的寡聚核苷酸。
6.一種扣手探針，從5』至3』依次為與待測基因5』端互補的左側寡核苷酸、探針主體片段和與待測基因3』端互補的右側寡核苷酸； 所述探針主體片段為序列表中序列I自5』末端的第24-125位寡核苷酸或序列表中序列2自5』末端的第24-125位寡核苷酸。
7.根據權利要求6所述的扣手探針，其特徵在於 所述與待測基因5』端互補的左側寡核苷酸為序列表中序列I自5』末端的第1-23位寡核苷酸或序列2自5』末端的第1-23位寡核苷酸； 所述與待測基因3』端互補的右側寡核苷酸為序列表中序列I自5』末端的第126-146位寡核苷酸或序列表中序列2自5』末端的第126-146位寡核苷酸； 所述扣手探針的5』末端磷酸化，具體為所述左側寡核苷酸自5』末端起第一位核苷酸的第5位C上連接磷酸基團。
8.含有權利要求4或6所述扣手探針的試劑盒；或含有權利要求4或6所述扣手探針及其互補鏈的重組載體或重組菌， 所述重組載體為將所述扣手探針及其互補鏈插入到POCP的EcoRI酶切位點間得到的載體；所述質粒POCP的核苷酸序列為序列表中的序列5。
9.權利要求4或6所述的扣手探針在生物SNP鑑定中的應用； 或權利要求7所述試劑盒在生物SNP鑑定中的應用； 或權利要求8所述重組載體或重組菌在生物SNP鑑定中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特徵在於 所述生物為植物，所述植物具體為擬南芥； 所述擬南芥SNP為擬南芥第4號染色體的第1055234位核苷酸的多態性； 所述擬南芥第4號染色體的第1055234位核苷酸的多態性具體為擬南芥第4號染色體的第1055234位核苷酸為A或G。
全文摘要
本發明公開了長鏈扣手探針的生物合成方法。該生物合成的基本方法是首先根據設計的扣手探針序列，應用PCR法合成扣手探針前體。扣手探針前體的5』端帶有雙鏈DNA限制性內切酶識別序列，而扣手探針前體的3』端帶有雙鏈DNA單鏈切刻酶的識別序列。然後將該前體連接到用於純化扣手探針的專用載體pOCP中，轉化大腸桿菌並繁殖該質粒，質粒經過酶切、聚丙烯醯胺凝膠電泳、回收、純化、凍幹脫水等步驟，最後得到高質量的長鏈扣手探針。
文檔編號C12Q1/68GK102618529SQ201110028208
公開日2012年8月1日 申請日期2011年1月26日 優先權日2011年1月26日
發明者曹曉花, 漆小泉, 趙松子 申請人:中國科學院植物研究所