一種直投式枯草芽孢桿菌發酵劑及其製備方法

2023-05-31 06:46:11 1

專利名稱：一種直投式枯草芽孢桿菌發酵劑及其製備方法
技術領域：
本發明屬於生物製劑領域，尤其是一種直投式枯草芽孢桿菌發酵劑及其製備方法。
背景技術：
直投式發酵劑是指一系列高度濃縮和標準化的冷凍乾燥發酵劑菌種，可直接加入熱處理的原料進行發酵，而無需對其進行活化、擴培等其他預處理工作。目前直投式枯草芽孢桿菌發酵劑的應用國內外未見報導。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的不足之處，提供一種操作簡單、活菌含量很高， 活力高，接種量小的直投式枯草芽孢桿菌發酵劑及其製備方法。本發明實現目的的技術方案如下一種直投式枯草芽孢桿菌發酵劑的製備方法，包括枯草芽孢桿菌種子培養、枯草芽孢桿菌高密度放大培養、菌體濃縮、加入保護劑、冷凍乾燥法製備菌體發酵劑，最後得到直投式枯草芽孢桿菌發酵劑，所述枯草芽孢桿菌種子培養及高密度放大培養的培養基重量百分比為蔗糖2，豆粕1，磷酸二氫鉀0. 1，硫酸鎂0. 05，加水至100%, ρΗ7· 0-7. 2，冷凍乾燥法製備菌體發酵劑濃縮條件為離心轉速5000r/min，離心lOmin，離心溫度為4°C，所採用的保護劑為含有5%麥芽糊精、4%蔗糖、0. 8%海藻糖和0. 2%吐溫的水溶液。而且，所述枯草芽孢桿菌的名稱為TK-1，分類名稱Bacillus subtilis，保藏編號為CGMCC No. 4731，保藏日期2011年4月2日，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。而且，所述種子培養條件為37士 1°C進行培養，培養時間為20h。而且，所述直投式枯草芽孢桿菌發酵劑中枯草芽孢桿菌的存活率為95. 3%，活菌數為 2. 69X1010cfu/go而且，所述直投式枯草芽孢桿菌發酵劑按1%。的接種量應用於液態發酵，最高活菌數為 1. 03X1010cfu/mLo而且，直投式枯草芽孢桿菌發酵劑按1%。的接種量應用於固態發酵，最高活菌數為 0. 985X 1010cfu/go一種直投式枯草芽孢桿菌發酵劑，其特徵在於包括凍幹保護劑和枯草芽孢桿菌， 所述凍幹保護劑為5%麥芽糊精、4%蔗糖、0. 8%海藻糖、0. 2%吐溫。而且，所述枯草芽孢桿菌的名稱為TK-1，分類名稱Bacillus subtilis，保藏編號為CGMCC No. 4731，保藏日期2011年4月2日，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。本發明的優點和積極效果是1、本發明中枯草芽孢桿菌TK-I菌株通過補料分批發酵高密度放大培養後，採用冷凍乾燥法製備菌體發酵劑，用本方法生產的直投式枯草芽孢桿菌發酵劑的存活率為 95.3%，活菌數為2. 69X101(lCfU/g，按照1%。的接種量便可達到理想的液態和固態發酵效^ ο2、本發明首次採用冷凍乾燥法製備直投式枯草芽孢桿菌發酵劑，與原液態種子接種相比，發酵劑接種量小，直接使用，節約勞動力，縮短生產周期，又可有效地防止菌種汙染及退化；保存管理方便，產品品質穩定等優勢。3、本發明確定了枯草芽孢桿菌在濃縮過程中採用離心轉速5000r/min，4°C下離心 lOmin，離心得率為98. 83%。4、本發明確定了菌體冷凍乾燥過程中保護劑為5%麥芽糊精、4%蔗糖、0. 8%海藻糖、0. 2%吐溫，最終枯草芽孢桿菌凍幹存活率為93%，活菌數為2. 69X 101(lCfU/g。5、採用本發明方法製備的直投式枯草芽孢桿菌發酵劑按1%。的接種量應用於液態發酵，最高活菌數為ι. 03X IOltlCfuAiL,採用本發明方法製備的直投式枯草芽孢桿菌發酵劑按1%。的接種量應用於固態發酵，最高活菌數為0. 985X101(lCfU/g。6、本發明製備的枯草芽孢桿菌發酵劑具有以下優點活菌含量很高，活力高，因而接種量小；能直接使用，避免了繁冗的擴大培養過程，既節約勞動力，縮短生產周期，又可有效地防止菌種汙染及退化；保存管理方便；易於控制生產工藝，產品品質穩定；經簡單復水處理後可直接作為種子菌株應用。


圖1為本發明進行菌體收集時間對發酵劑活菌數的影響；圖2為凍幹保護劑對發酵劑活菌數的影響，注1號10%麥芽糊精；2號10%蔗糖；3號10%海藻糖；4號10%吐溫；5號5%麥芽糖+5%蔗糖；6號5%麥芽糊精+4%蔗糖 +0. 8 %海藻糖+0. 2 %吐溫；7號5 %麥芽糊精+4 %蔗糖+1 %吐溫；8號5 %麥芽糊精+4 %蔗糖+1%海藻糖；圖3為枯草芽孢桿菌發酵劑與發酵液接種在液態培養基的效果比較。圖4為枯草芽孢桿菌發酵劑與發酵液接種在固態培養基的效果比較。
具體實施例方式下面結合實施例，對本發明進一步說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的， 不能以下述實施例來限定本發明的保護範圍。1.菌體的種子液製備將甘油管凍藏的菌種接到裝有液體種子培養基的試管中，在溫度為37°C、轉速為 150r/min的條件下培養。其中液體種子培養基(g/L)為蛋白腖10g，Nacl 10g，酵母浸粉5g，pH7. O 7. 2， 在搖床中培養，其溫度為37°C，轉速為150r/min。3.菌體的高密度放大培養以5 %的接種量將枯草芽孢桿菌接種於200L罐進行發酵培養，裝液量160L，於 37士 1°C培養20h。採用蠕動泵添加2mol/L的NaOH溶液調節pH，使之維持在6. 8左右，發酵採用靜置補料分批發酵，補料後進行輕微攪拌，添加0. 3%的豆油作消泡劑。
4.菌種收集菌種收集是整個工藝關鍵的一步，目前較為合適的方法是採用高速離心機進行離心分離然後進行真空冷凍乾燥，它可以完全適應工業化生產要求，所以大都採用離心和真空乾燥冷凍乾燥的辦法。5.菌體保護劑的選擇在收集了大量的枯草芽孢桿菌菌體後必須添加菌種保護劑以使枯草芽孢桿菌免受外界有害因素的損傷。添加保護劑可以有效地提高枯草芽孢桿菌的存活率、存活時間、以及保持枯草芽孢桿菌原有的特性。6.冷凍乾燥將收集的菌體與保護劑進行充分混合後進行預凍，預凍溫度控制在_20°C -30°C，預凍時間隨菌體量表面積而定，乾燥溫度大都在-20°C -30°C之間，乾燥後的發酵劑水分含量低於3%為宜。7.測定活菌數—般採用平板計數法，操作步驟為稱取製備好的發酵劑lg，溶於9ml的無菌生理鹽水中，搖勻後用移液槍取Iml的菌液加進另一個9ml的無菌生理鹽水中，進行稀釋，依次做十倍梯度稀釋。稀釋完後，用移液槍分別取合適的稀釋度Iml打進平板，倒入培養基混勻，依次做三個平行，放進38 V培養箱倒置靜置培養。8.發酵劑的包裝發酵劑活菌數需大於101(lCfU/g，最終粉末製劑產品必須進行真空封口包裝，並於低溫保藏，保質期大約為la。以下是對直投式枯草芽孢桿菌製備劑的生產方法的一些參數的確定，以及一些培養條件的優化。直投式枯草芽孢桿菌發酵劑製備條件的篩選1.枯草芽孢桿菌菌種收集時間的確定細菌生長分別經歷了延滯期、對數生長期、平衡期和衰退期，在不同時期，生長情況不同，分別對其取樣進行活菌計數。篩選實例一液態發酵培養基蔗糖2g，豆粕lg，磷酸氫二鉀0. Ig,硫酸鎂0. 05g, pH7. 0 7. 2 接種與培養條件接種量5% (v/w)，培養溫度37士 1°C，培養時間18h。測得的活菌數為 3. 01X1010cfu/mL·篩選實例二液態發酵培養基蔗糖2g，豆粕lg，磷酸二氫鉀0. Ig,硫酸鎂0. 05g, pH7. 0 7. 2 接種與培養條件接種量5% (v/w)，培養溫度37士 1°C，培養時間20h。測得的活菌數為 3. 43X1010cfu/mL·篩選實例三液態發酵培養基蔗糖2g，豆粕lg，磷酸二氫鉀0. Ig,硫酸鎂0. 05g, pH7. 0 7. 2接種與培養條件接種量5% (v/w)，培養溫度37士 1°C，培養時間22h。測得的活菌數為 3. 36X1010cfu/mL·結果
5
液態種子發酵液的最適培養時間為20h(見附圖1)。2.液體菌劑收集時的離心轉速與時間的確定將增菌培養後的枯草芽孢桿菌通過離心機收集的液體菌劑，離心時的轉數和時間對菌體的影響較大，同等條件下，隨著離心轉數的增加，離心後菌的存活率降低，篩選實例1將發酵好的菌體液，在4000r/min的條件下，離心lOmin，離心前活菌數 3. 43X101QCfu/ml，離心後沉降液中活菌數為3. 25X 101(lCfu/ml，離心後沉降液菌體存活率為 94. 75%。篩選實例2將發酵好的菌體液，在4000r/min的條件下，離心15min，離心前活菌數 3. 43X101QCfu/ml，離心後沉降液中活菌數為3. 34X 101(lCfu/ml，離心後沉降液菌體存活率為 97. 38%。篩選實例3將發酵好的菌體液，在5000r/min的條件下，離心lOmin，離心前活菌數 3. 43X101QCfu/ml，離心後沉降液中活菌數為3. 39X 101(lCfu/ml，離心後沉降液菌體存活率為 98. 83%。結果離心的最適條件為5000r/min，離心時間為IOmin (見表1)。3.凍幹保護劑的確定以下提及的保護劑的濃度均為對應物質的水溶液的重量百分比濃度。將菌體與滅好的凍幹保護劑混勻後，使其完全凍結，然後進行真空冷凍乾燥。須對樣品進行預凍，本研究預凍的溫度_25°C -30°C，預凍時間4hr，凍結厚度為0. 5mm,再進行冷凍乾燥，條件為冷井溫度_30°C、板溫50°C、凍幹時間20h。篩選實例1將菌體與凍幹保護劑按一定比例混合，條件如上述，凍幹保護劑成分為10%麥芽糊精，測得冷凍存活率為51. 3 %，凍幹存活率為46. 1%，凍乾粉活菌數為0. 83X1010cfu/go篩選實例2將菌體與凍幹保護劑按一定比例混合，條件如上述，凍幹劑保護成分為5%麥芽糊精、4%蔗糖、海藻糖，測得冷凍存活率為90. 1%，凍幹存活率88.7%，凍乾粉活菌數為 1. 22X1010cfu/go篩選實例3將菌體與凍幹保護劑按一定比例混合，條件如上述，凍幹劑保護成分為5%麥芽糊精、4%蔗糖、0.8%海藻糖、0.2%吐溫，測得冷凍存活率為89.6%，凍幹存活率為 88.4%，凍乾粉活菌數為2. 69X1010cfu/go結果應採用的凍幹劑保護成分為5%麥芽糊精、4%蔗糖、0.8%海藻糖、0.2%吐溫 (見附圖2)。結論本實驗採用此方法生產直投式枯草芽孢桿菌發酵劑，此發酵劑含菌量高，活力強，活菌數達到2. 69X101QCfU/g。4.枯草芽孢桿菌發酵劑在液態發酵中的應用
6
篩選實例1將枯草芽孢桿菌發酵劑加入已滅菌的0. 85%生理鹽水中，常溫復水20min，然後按0.1%的接種量接入滅過菌的液態發酵培養基，組成(％)蔗糖2，豆粕1，磷酸氫二鉀 0. 1，硫酸鎂0. 05，pH7.0 7.2，在37°C條件下進行發酵培養18h，測活菌數，測得活菌數為 9. 96X 109cfu/mL。篩選實例2將經液體活化後的枯草芽孢桿菌按5%的接種量接入滅過菌的液態發酵培養基， 組成(％)蔗糖2，豆粕1，磷酸氫二鉀0. 1，硫酸鎂0.05，pH7.0 7.2，在37°C條件下進行發酵培養18h，測活菌數。測得活菌數為8.53 X 109cfu/mL。結果使用直投式地衣芽胞桿菌發酵劑按接種量0. 與接種量5%液體接種於液態發酵培養基中對比，最高活菌數分別為1. 03X 101(lCfu/mL和0. 903X 109Cfu/mL(附圖3)。明顯降低接種量，並可達到更好的發酵效果。五、直投式枯草芽孢桿菌發酵劑在固態發酵中的應用篩選實例1將枯草芽孢桿菌發酵劑加入已滅菌的0. 85%生理鹽水中，常溫復水20min，然後按0. 的接種接入滅過菌的以豆粕為主的固態發酵培養基，組成豆粕麩皮玉米粉 =3:1: 1，在37°C恆溫培養箱靜置培養18h，測活菌數。測得活菌數為8.21 X 109cfu/g。篩選實例2將經液體活化後的枯草芽孢桿菌按5% (v/w)的接種量接入滅過菌的以豆粕為主的固態發酵培養基，組成豆粕麩皮玉米粉=3 1 1，在37°C恆溫培養箱靜置培養 18h，測活菌數。測得活菌數為7.4X 109cfu/g。結果使用直投式枯草芽孢桿菌發酵劑按接種量0. 與接種量5%液體接種於固態發酵培養基中對比，最高活菌數分別為9. 85X 109cfu/g和8. 43X 109cfu/g(附圖4)。發酵劑接種後菌體存在約12h的遲滯期，而後生長快速，最終發酵效果理想，可明顯降低接種量。結論通過對直投式枯草芽孢桿菌發酵劑生產工藝的研究，枯草芽孢桿菌濃縮採用最終枯草芽孢桿菌存活率達93.2%，發酵劑的活菌數為2. 69X101(lCfU/g，按1%。的接種量便可達到理想的液態或固態發酵效果，最高活菌數分別為1. 03X1010cfu/mL,9. 85X 109cfu/g。表1本發明離心時間與轉速對發酵劑活菌數的影響
權利要求
1.一種直投式枯草芽孢桿菌發酵劑的製備方法，其特徵在於包括枯草芽孢桿菌種子培養、枯草芽孢桿菌高密度放大培養、菌體濃縮、加入保護劑、冷凍乾燥法製備菌體發酵劑，最後得到直投式枯草芽孢桿菌發酵劑，所述枯草芽孢桿菌種子培養及高密度放大培養的培養基重量百分比為蔗糖2，豆粕1，磷酸二氫鉀0. 1，硫酸鎂0. 05，加水至100%，PH 7. 0-7. 2，冷凍乾燥法製備菌體發酵劑濃縮條件為離心轉速5000r/min，離心lOmin，離心溫度為4°C，所採用的保護劑為含有5%麥芽糊精、4%蔗糖、0. 8%海藻糖和0. 2%吐溫的水溶液。
2.根據權利要求1所述的直投式枯草芽孢桿菌發酵劑的製備方法，其特徵在於所述枯草芽孢桿菌的名稱為TK-1，分類名稱枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，保藏編號為 CGMCC No. 4731，保藏日期2011年4月2日，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3 號，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
3.根據權利要求1所述的直投式枯草芽孢桿菌發酵劑的製備方法，其特徵在於所述種子培養條件為37士 1°C進行培養，培養時間為20h。
4.根據權利要求1所述的直投式枯草芽孢桿菌發酵劑的製備方法，其特徵在於所述直投式枯草芽孢桿菌發酵劑中枯草芽孢桿菌的存活率為95. 3%，活菌數為2. 69X IO10Cfu/ g°
5.根據權利要求5所述的直投式枯草芽孢桿菌發酵劑的製備方法，其特徵在於所述直投式枯草芽孢桿菌發酵劑按1%。的接種量應用於液態發酵，最高活菌數為 1. 03X10lclcfu/mL。
6.根據權利要求5所述的直投式枯草芽孢桿菌發酵劑的製備方法，其特徵在於直投式枯草芽孢桿菌發酵劑按1%。的接種量應用於固態發酵，最高活菌數為0. 985X 1010cfu/go
7.一種直投式枯草芽孢桿菌發酵劑，其特徵在於包括凍幹保護劑和枯草芽孢桿菌， 所述凍幹保護劑為5%麥芽糊精、4%蔗糖、0. 8%海藻糖、0. 2%吐溫。
8.根據權利要求7所述的直投式枯草芽孢桿菌發酵劑，其特徵在於所述枯草芽孢桿菌的名稱為TK-1，分類名稱Bacillus subtilis，保藏編號為CGMCC No. 4731，保藏日期 2011年4月2日，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
全文摘要
本發明涉及一種直投式枯草芽孢桿菌發酵劑及其製備方法，包括枯草芽孢桿菌種子培養、枯草芽孢桿菌高密度放大培養、冷凍乾燥法製備菌體發酵劑，最後得到直投式枯草芽孢桿菌發酵劑，所述枯草芽孢桿菌種子培養及高密度放大培養的培養基重量百分比為蔗糖2，豆粕1，磷酸二氫鉀0.1，硫酸鎂0.05，加水至100％，pH7.0-7.2。冷凍乾燥法製備菌體發酵劑濃縮條件為離心轉速5000r/min，離心10min，離心溫度為4℃，凍幹保護劑為5％麥芽糊精、4％蔗糖、0.8％海藻糖、0.2％吐溫。用本方法生產的直投式枯草芽孢桿菌發酵劑的存活率為95.3％，活菌數為2.69×1010cfu/g，按照1‰的接種量便可達到理想的液態和固態發酵效果。基於本菌株開發了一種新型高活性的直投式枯草芽孢桿菌發酵劑的製備方法應用於枯草芽孢桿菌相關產品的液態發酵和固態發酵。
文檔編號C12N1/04GK102433287SQ20111044672
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月28日 優先權日2011年12月28日
發明者孫巖, 尚瑋, 王建玲, 王海寬 申請人:天津科技大學