一種IgA1酶及其製備方法和應用的製作方法

2023-05-31 06:57:56 4

一種IgA1酶及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種製備IgA1酶的方法，包括以下步驟：1)以細菌作為發酵菌株，發酵完成後，得到發酵液；所述的細菌為淋球菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎球菌或變異鏈球菌；2)分離純化發酵液，得IgA1酶。本發明提供的IgA1酶在模型小鼠體內對IgA1及含IgA1免疫複合物有顯著的分解效果，並且效果明顯好於商品化IgA1酶，為IgAN的臨床治療提供了一種和藥物篩選提供重要參考。
【專利說明】—種IgAI酶及其製備方法和應用

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種酶，特別是IgAl酶及其製備方法，以及其在製備治療IgA腎病的藥物中的應用。

【背景技術】
[0002]IgA腎病(IgAN)是全球範圍內最為常見的原發性腎小球疾病，大約25%~50%的患者在疾病診斷後25年內發展到終末期腎衰竭(ESRD);患者即使接受腎移植，仍有超過50%的患者在腎移植術後兩年內IgAN復發。因此，對IgAN的發病機制及其防治研究具有重要的臨床價值和社會意義。
[0003]現有研究表明，IgAN作為一種自身免疫性疾病，是以IgA或以IgA為主的免疫球蛋白在腎小球繫膜區及毛細血管袢呈瀰漫顆粒狀或團塊狀沉積所引起一系列臨床及病理改變。半乳糖缺失的IgA暴露其鉸鏈區抗原決定簇，使得針對異常IgA的自身IgG和IgA抗體產生，形成的免疫複合物沉積於繫膜區，激活繫膜細胞及補體系統導致腎臟損傷。
[0004]目前，在原治療基礎上從自身免疫發病機制角度出發，探索新的IgAN治療思路成為了研究熱點。現有研究發現(IgAl蛋白酶的生物學作用，生物醫學工程學雜誌，2011年4月第28卷第2期，張紫媛等，P423-427)，一些微生物因其產生IgA酶對人類有致病性，但是由於IgA酶能夠降解IgA分子,使得研究人員希望使用IgA酶來對IgAN進行治療。不過，由於缺乏可靠的動物模型，這個領域的研究主要集中在體外實驗上，IgA酶是否能夠有潛在的治療用途還不能客觀的評價。


【發明內容】

[0005]針對現有技術的缺陷，本發明的一個方面是提供一種製備IgAl酶的製備方法，它包括以下步驟:
[0006]I)以細菌作為發酵菌株，發酵完成後，得到發酵液；所述的細菌為淋球菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎球菌或變異鏈球菌；
[0007]2)分離純化發酵液，得IgAl酶。
[0008]優選的，所述的細菌為淋球菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎球菌。
[0009]進一步優選的，所述淋球菌為菌株號為ATCC49226的菌株；所述流感嗜血桿菌為菌株號為ATCC49247或ATCC10211的菌株；所述肺炎鏈球菌為菌株號為ATCC_? 6303?(血清3型)的菌株；腦膜炎球菌為菌株號為ATCC13090的菌株。
[0010]更優選的細菌為淋球菌，其菌株號為ATCC49226 ;或者為流感嗜血桿菌，其菌株號為 ATCC49247。
[0011]最優選的細菌為流感嗜血桿菌，其菌株號為ATCC49247。
[0012]本發明所述製備IgAl酶的方法中，步驟I)中所述的發酵方法是:
[0013]將細菌復甦後接種於液體培養基中，置37°C 200r/min震蕩培養18h，使菌懸液的光吸收值A600為1.0 ；
[0014]將菌懸液以體積比10%的比例接種於液體培養基中，37°C 200r/min震蕩培養15-24h後，離心，收集上清液備用；
[0015]步驟2)中所述的分離純化方法是:
[0016]取步驟I)得到的上清液，在4°C攪拌條件下加入飽和硫酸銨(NH4)2SO4至終濃度為50%，之後靜置2h，於4°C離心，收集沉澱，用Tris-HCl緩衝液溶解，即獲得IgA蛋白酶粗製品，透析、濃縮後即得。
[0017]本發明的另一個目的是提供一種IgAl酶，其最適作用溫度為35_45°C ;最適作用PH值為6-10 ;其底物為正常糖基化或異常糖基化的IgAl ；PMSF和SDS可完全抑制IgAl酶活性，DTT和EDTA則無影響；Cu2+、Ni2+、Zn2+、Fe3+和Fe2+均可抑制IgAl酶的活性，Ca2+和Mg2+對酶活性影響不明顯，而Co2+、Mn2+和Al3+對不同菌種分泌的酶活性影響存在差異性；IgAl酶對底物IgAl的分解作用不受其低糖基化程度的影響。
[0018]並且它是由權利要求1~6任意一項所述的方法製備的。
[0019]本發明的再一方面是提供所述的IgAl酶在製備治療IgAN的藥物中的用途。
[0020]在一個具體的實施例中，本發明製備了穩定的動物模型，製備方法簡單，能夠用於評價本發明的IgAl酶對沉積於腎組織中的免疫複合物的消化能力。
[0021]在一個具體的實施例中，採用商品化的IgAl酶和從流感嗜血桿菌ATCC49247中提取的IgAl酶注射到動物模型中，評價不同的IgAl酶對體內IgAl的消化能力。
[0022]顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0023]以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於以下的實例。凡基於本發明上述內容所實現的技術均屬於本發明的範圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1 IgA患者血清中Jacalin結合蛋白的SDS-PAGE電泳:
[0025]1.1gAl標準品；2.稀釋血清；3.50 %飽和(MM)2SO4沉澱；4.Jacalin穿透液；
5.PBS流出液；6.蜜二糖洗脫液I ;7.蜜二糖洗脫液2 ；8.蜜二糖洗脫液3 ；9.蜜二糖洗脫濃縮液
[0026]圖2 Western blot鑑定提取的IgAl蛋白:
[0027]1.1gA患者血清；2.過Jacalin純化柱穿透液；3.PBS流出液；4.過Jacalin柱蜜二糖洗脫液；5.PBS流出液；6-9.過S^hadex G-200分子篩層析流出液
[0028]圖3 Jacalin結合蛋白過Sephadex G-200分子篩層析:
[0029]第I峰為plgA，第2峰為mlgA，第3峰為非IgA峰
[0030]圖4 IgAl蛋白過Sephadex G-200分子篩層析:
[0031]第I 峰為 plgAl，第 2 峰為 mlgAl
[0032]圖5-1商品化的IgAl形成的免疫複合物I的免疫螢光觀察圖
[0033]圖5-2 IgAN患者血清中提取的低糖基化IgAl形成的免疫複合物2的免疫螢光觀察圖
[0034] 圖5-3陰性對照組的免疫螢光觀察圖
[0035]圖5-4同源對照組的免疫螢光觀察圖
[0036]圖6 ELISA法檢測不同菌種分泌的IgAl酶活性
[0037]圖7-1低糖基化IgAl形成的免疫複合物與NaCl (對照)作用後的免疫螢光觀察圖
[0038]圖7-2低糖基化IgAl形成的免疫複合物與提取自流感嗜血桿菌ATCC49247的IgAl酶作用後的免疫螢光觀察圖
[0039]圖7-3商品化IgAl形成的免疫複合物與NaCl (對照)作用後的免疫螢光觀察圖
[0040]圖7-4商品化IgAl形成的免疫複合物與商品化的IgAl酶作用後的免疫螢光觀察圖
[0041]圖5-1至圖5-4，以及圖7-1至圖7-4中，圖a為螢光抗體2:檢測IgAl的Fe段；圖b為螢光抗體1:檢測IgAl的F(ab)段；圖(:為螢光抗體3:檢測羊抗人抗體的F(ab)段，即免疫複合物中的IgAl的Fab段。

【具體實施方式】
[0042]用於形成免疫複合物的抗原:
[0043]抗原1:購買商品化的人多發性骨髓瘤血眾IgAl, Myeloma (Fitzgrald公司)
[0044]抗原2:從IgAN患者血清中提取的低糖基化IgAl
[0045]用於形成免疫複合物的抗體:
[0046]抗體1:AffiniPure F (ab，)2Fragment Goat Ant1-Human IgG, F (ab，)2FragmentSpecific (Jackson 公司)為特異抗 IgAl 的 IgG
[0047]抗體2:ChromPure Goat IgG.F(ab』)2Fragment (Jackson 公司)，為非特異抗 IgAl的普通的IgG
[0048]螢光抗體:
[0049]螢光抗體1:檢測IgAl的F(ab)段
[0050](FITC)-conjugated AffiniPure Rabbit Ant1-Human IgG,F(ab，)2FragmentSpecific (Jackson 公司)
[0051]螢光抗體2:檢測IgAl的Fe段
[0052]Mouse monoclonal B35064B4Anti_Human IgAlFc (FITC) ab99793 (abeam 公司)
[0053]螢光抗體3:檢測羊抗人抗體的F (ab)段
[0054]Rhodamine (TRITC) - conjugated AffiniPure Rabbit Ant 1-GoatIgG，F(ab，) 2Fragment Specific (Jackson 公司)
[0055]8-10W的Babl/c雌性小鼠購自成都達碩生物科技有限公司
[0056]實施例1本發明IgAl酶的製備
[0057]實驗材料:
[0058]流感嗜血桿菌ATCC49247購自上海復祥生物公司；
[0059]商品用IgAl 酶(IgA Protease (Igase Pro-Pro-Y-Pro),商品號:EP0205,MObitec公司)
[0060]1、細菌IgAl酶的製備
[0061]取出甘油保存的流感嗜血桿菌ATCC49247菌種管，室溫下解凍，然後接種於哥倫比亞巧克力瓊脂平板上，37°C孵箱培養18-24h ;取菌苔進行革蘭染色檢查，如為無汙染的純培養物，則挑取平板中數個單菌落，接種於3ml加入含有Hemin (終濃度為10 μ g/ml)和β -NAD (終濃度為10 μ g/ml)的心腦浸液液體培養基中，置37°C全溫震蕩培養箱200r/min培養18h，鏡檢無汙染後用比濁管調整菌液的濁度，使光吸收值A600為1.0 ;取2ml菌懸液接種於200ml的心腦浸液液體培養基中，37°C全溫震蕩培養箱200r/min培養15_24h。將培養一定時間的細菌懸液在冷凍離心機上以3000r/min的轉速離心10min，收集上清備用。
[0062](2)硫酸銨鹽析
[0063]取細菌培養上清液100ml，在4°C攪拌條件下緩慢加入飽和硫酸銨(NH4)2SO4至終濃度為50%,注意攪拌過程中不要攪出氣泡,之後靜置2h於4°C 6000r/min離心15min,收集沉澱，用少量Tris-HCl緩衝液(0.05mol/L, pH8.2)溶解，即獲得IgA蛋白酶粗製品。
[0064](3) IgAl蛋白酶粗製品的透析與濃縮
[0065]將IgA蛋白酶粗製品加入1KD的透析卡中，在Tris-HCl緩衝液(0.05mol/L,pH8.2)中4°C透析24h，其間更換透析液1_2次並攪動，將透析後的樣品於4°C 8000g離心20min,棄去沉澱，收集上清轉移入預冷的Amicon-Ultra_15超濾管中(50KD), 5000g離心15min,收集濃縮液，BCA法測蛋白濃度，_20°C凍存。
[0066]實施例2:本發明製備IgAl酶的方法
[0067]菌株號為ATCC49226的淋球菌購自上海復祥生物公司；
[0068](I)取出甘油保存的利用菌種管，室溫下解凍，然後接種於哥倫比亞巧克力瓊脂平板上，37°C孵箱培養18-24h ;取菌苔進行革蘭染色檢查，如為無汙染的純培養物，則挑取平板中數個單菌落，接種於3ml的心腦浸液液體培養基中，置37°C全溫震蕩培養箱200r/min培養18h，鏡檢無汙染後用比濁管調整菌液的濁度，使光吸收值A600為1.0 ;取2ml菌懸液接種於200ml的心腦浸液液體培養基中，37°C全溫震蕩培養箱200r/min培養15_24h。將培養一定時間的細菌懸液在冷凍離心機上以3000r/min的轉速離心10min，收集上清備用。
[0069](2)硫酸銨鹽析
[0070]取細菌培養上清液100ml，在4°C攪拌條件下緩慢加入飽和硫酸銨(NH4)2SO4至終濃度為50%,注意攪拌過程中不要攪出氣泡,之後靜置2h於4°C 6000r/min離心15min,收集沉澱，用少量Tris-HCl緩衝液(0.05mol/L, pH8.2)溶解，即獲得IgA蛋白酶粗製品。
[0071](3) IgAl蛋白酶粗製品的透析與濃縮
[0072]將IgAl蛋白酶粗製品加入1KD的透析卡中，在Tris-HCl緩衝液(0.05mol/L,pH8.2)中4°C透析24h，其間更換透析液1_2次並攪動，將透析後的樣品於4°C 8000g離心20min,棄去沉澱，收集上清轉移入預冷的Amicon-Ultra_15超濾管中(50KD), 5000g離心15min，收集濃縮液，BCA法測蛋白濃度，_20°C凍存。
[0073]實施例3本發明IgAl酶的製備
[0074](I)腦膜炎球菌(ATCC13090)/肺炎鏈球菌(ATCC? 6303?(血清3型))/流感嗜血桿菌(ATCC10211)的培養
[0075]以上菌株均購自購自上海復祥生物公司；
[0076]取出甘油保存的腦膜炎球菌/肺炎鏈球菌/流感嗜血桿菌菌種管，室溫下解凍，然後接種於哥倫比亞巧克力瓊脂平板上，37°C孵箱培養18-24h ;取菌苔進行革蘭染色檢查，如為無汙染的純培養物，則挑取平板中數個單菌落，接種於3ml的心腦浸液液體培養基中，而流感嗜血桿菌的心腦浸液液體培養基於臨用前在無菌條件下加入lmg/ml的Hemin貯存液(終濃度為10 μ g/ml)和10mg/ml的β -NAD貯存液(終濃度為10 μ g/ml)，置37°C全溫震蕩培養箱200r/min培養18h，鏡檢無汙染後用比濁管調整菌液的濁度，使光吸收值A600為1.0 ;取2ml菌懸液接種於200ml的心腦浸液液體培養基中，37°C全溫震蕩培養箱200r/min 培養 15-24h。
[0077](2)變異鏈球菌的培養
[0078]取出甘油保存的變異鏈球菌菌種管，室溫下解凍，接種於BHI瓊脂平板，置於厭氧培養箱中於37°C、混合氣(80% N2,10% CO2,10% H2)條件下培養48h ;塗片及革蘭染色檢查為純培養物後，無菌接種環刮取平板上的各種變鏈菌株，接種於3ml BHI液體培養基中，將厭氧罐置於37°C全溫震蕩培養箱200r/min培養18h，鏡檢無汙染後用比濁管調整菌液濁度，使光吸收值A600為1.0 ;取2ml菌懸液按照1:100比例(v/v)分別接種於BHI液體培養基中，37°C全溫震蕩培養箱200r/min培養15_24h。
[0079]將培養一定時間的細菌懸液在冷凍離心機上以3000r/min的轉速離心1min,收集上清備用。
[0080](3)硫酸銨鹽析
[0081]取細菌培養上清液100 ml，在4°C攪拌條件下緩慢加入飽和硫酸銨(NH4)2SO4至終濃度為50%,注意攪拌過程中不要攪出氣泡,之後靜置2h於4°C 6000r/min離心15min,收集沉澱，用少量Tris-HCl緩衝液(0.05mol/L, pH8.2)溶解，即獲得IgA蛋白酶粗製品。
[0082](4) IgAl蛋白酶粗製品的透析與濃縮
[0083]將IgAl蛋白酶粗製品加入1KD的透析卡中，在Tris-HCl緩衝液(0.05mol/L,pH8.2)中4°C透析24h，其間更換透析液1_2次並攪動，將透析後的樣品於4°C 8000g離心20min,棄去沉澱，收集上清轉移入預冷的Amicon-Ultra_15超濾管中(50KD), 5000g離心15min,收集濃縮液，BCA法測蛋白濃度，_20°C凍存。
[0084]實施例4製備IgAN動物模型
[0085]製備免疫複合物I
[0086]將抗原I (商品化的IgAl)與抗體I按照1:1濃度比例形成免疫複合物1:
[0087]將商品化IgAl 稀釋至 lmg/ml 與 lmg/ml Goat ant1-human F (ab) 2 抗體，即抗體 I混合，室溫放置5min後，取5 μ I滴在潔淨載玻片上，顯微鏡下觀察可見有明顯複合物形成，將形成的複合物置4°C保存備用。
[0088]製備免疫複合物2
[0089]1、從IgAN患者血清中提取低糖基化IgAl
[0090]將IgAN患者IgAl血清樣品通過硫酸銨沉澱、陰離子交換進行初步分離純化後，利用凝集素Jacalin對IgAl的糖鏈末端特異結合的特性,通過Jacalin親和層析柱製備IgAl亞型純品，利用葡聚糖凝膠S^hadex G-200可分離5-600KD分子量範圍內的蛋白質原理，將IgAl通過Sephadex G-200分子篩層析柱進一步分離獲得不同形式的IgAl。(用於形成免疫複合物的是包含單體和多聚體兩種形式的總IgAl，即混合不同形式的IgAl)
[0091]1.1硫酸銨沉澱
[0092]步驟:取血清5.0ml於小試管中，邊攪拌混勻邊緩慢滴加飽和硫酸銨5.0ml，防止形成團塊降低沉澱物的特異性，混勻後室溫靜置30min或置4°C冰箱過夜，高速低溫離心10000rpm，10分鐘，將上清液(含白蛋白)棄去，取沉澱物(含球蛋白)溶於0.02mol/L Tris緩衝液(pH8.0)中，重複洗滌一次，加入2ml0.02mol/L Tris緩衝液(ρΗ8.0)溶解，此液即為粗提的Y —球蛋白溶液，將溶解的粗提液轉移到1KD的透析卡中，置於盛適量Tris緩衝液的大燒杯中，4°C攪拌情況下透析過夜，用納氏試劑檢測水中的NH4+，直到陰性為止。
[0093]1.2DEAE52-纖維素離子交換層析
[0094]材料:樣品(經pH8.0,0.02Μ Tris緩衝液透析過的正常人血清)，DEAE —纖維素(陰離子交換劑)，2.5 X 25cm層析柱及不同離子強度的Tris洗脫劑。
[0095]步驟:用0.02M Tris緩衝液(pH8.0)平衡柱子，將透析袋內的蛋白質溶液用
0.22um的過濾器過濾後緩慢加入層析柱上，開下端出口，使樣品進入柱床，吸附的蛋白質，用連續增加NaCl的濃度來洗脫，用線性梯度緩衝液(20-200mmol/L NaCl)洗脫，流速Iml/min,分部收集洗脫液1.5ml/管。
[0096]1.3 Jacalin 親和層析
[0097]試劑
[0098](1)0.1M, PH7.4 磷酸鹽緩衝鹽液(Phosphate Buffered Saline, PBS)。(2)0.1M蜜二糖/PBS Elut1n Buffer:,
[0099](3)0.02% NaN3
[0100]實驗步驟:
[0101](I)用5倍柱體積的PBS液平衡層析柱；
[0102](2)將樣品手動加入Immobilized Jacalin親和層析柱，4°C孵育30min ；
[0103](3)用10倍柱體積的PBS洗柱(或直至洗脫液在280nm的光吸收度低於0.01)，血清中的IgAl將吸附於層析柱上，不與柱子結合的蛋白質隨緩衝液流出柱外，棄去洗脫液；
[0104](4)用5倍柱體積的0.1M蜜二糖/0.1M PBS (PH7.4)0.5ml/min洗脫層析柱至紫外分光光度儀280nm波長下光吸收度低於0.01，吸附於柱上的血清IgAl將隨溶液流出，2ml/管子收集洗脫液；
[0105](5)再用10倍柱體積PBS平衡層析柱，柱子保存於含0.02% NaN3的超純水中:
[0106](6)將洗脫液轉移入分子限量1KD的透析袋中，結紮，用相對分子質量為20000的聚乙二醇(PEG)4°C濃縮。
[0107]1.4Superdex200 凝膠柱層析
[0108]試劑
[0109]0.05M PB/0.15M NaCl 緩衝液(PH7.2)
[0110]實驗步驟:
[0111](I)將濃縮洗脫液上樣於S^hacryl S200分子篩層析柱；
[0112](2)用 3 倍柱體積的 0.05M PB/0.15M NaCl 緩衝液(PH7.2) 0.5ml/min 洗柱，每種IgAl中含有不同分子量成分將按照分子量由大到小的順序隨緩衝液流出柱外，共有3個洗脫峰，分別為多聚 IgAl (polymeric IgAl,plgAl)、單體 IgAl (monomeric IgAl’mlgAl)和其他非IgAl蛋白；
[0113](3)收集峰I和峰2洗脫液，PEG20000濃縮後，重複上樣，再次洗脫，此次有2個洗脫峰，收集各峰洗脫液，混合後得到純品IgAl，PEG20000濃縮後保存於EP管中，BCA法測蛋白濃度。
[0114](4)膠體的再生與保存:用0.5mol/L NaCl溶液浸泡膠體30min，傾去NaCl溶液，蒸餾永衝洗數次，再用緩衝液充分平衡即可。
[0115]1.5western blot 法驗證提取的 IgAl
[0116]SDS-PAGE電泳後，轉膜，5%脫脂牛奶封閉lh，加入TBST稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgAl抗體(a鏈，SouthernB1tech公司)，37°C雜交袋中孵育2h，TBST洗3次，進行化學發光反應。
[0117]純化提取結果:分離純化血清IgA的SDS-PAGE電泳結果如圖1所示。WesternBlot法鑑定提取的血清IgAl如圖2所示。Jacalin結合蛋白過Sephadex G-200分子篩層析分離結果如圖3所示。不同形式IgAl過Sephadex G-200分子篩層析分離結果如圖4所示。
[0118]2、製備免疫複合物
[0119]將抗原2 (按照上述方法從患者血清提取的低糖基化IgAl)與抗體I按照2:1的濃度比例體外形成免疫複合物2:
[0120]將製備的IgAl 稀釋至 2mg/ml 與 lmg/ml Goat ant1-human F(ab)2 抗體混合,室溫放置5min後，取5μ I滴在潔淨載玻片上，顯微鏡下觀察可見有明顯複合物形成，將形成的複合物置4°C保存備用。
[0121]動物模型的製備
[0122]將免疫複合物I和免疫複合物2尾靜脈注射到小鼠體內，構建類似於IgAN患者的免疫複合物沉積的動物模型。
[0123]3.1實驗分組:
[0124]隨機選取8-10W的Babl/c雌性小鼠30隻，進行分組，每組5隻。
[0125]3.2尾靜脈注射:
[0126]實驗組I注射750 μ I的免疫複合物I (商品化IgAl+抗體I);實驗組2注射750μ1的免疫複合物2 (血清提取的低糖基化IgAl+抗體I);陰性對照組分別為注射商品化IgAl或血清提取的低糖基化IgAl+NaCl ;同源對照組分別為注射商品化IgAl或血清提取的低糖基化IgAl與抗體2形成的免疫複合物3 ；
[0127]3.3檢測免疫螢光，判斷免疫複合物的沉積程度
[0128](I)分別在lh、4h、8h、16h、24h，頸處死小鼠，取小鼠腎組織，做冰凍切片；
[0129](2)免疫螢光檢測各時間點腎臟IgAl及含IgAl的免疫複合物沉積情況(通過三種螢光來檢測IgAl的沉積，這裡的IgAl包括游離的IgAl，也包括複合物中的IgAl)。通過螢光抗體I和螢光抗體2來檢測IgAl沉積情況，另用螢光抗體3來檢測免疫複合物中抗體的沉積情況。
[0130](3)動物實驗螢光染色方法
[0131 ] I)取各組織切片，每隻小鼠選取3個標本，雙蒸水脫膠後用圈存筆圈存組織，冷丙酮 4°C固定 5 - lOmin, PBST 洗 5minX3 次。
[0132]2)封閉:各標本加入即用型兔血清30 - 40 μ 1,37度溫箱溼盒內孵育lh，PBST洗5minX 3 次。
[0133]3)避光下，將按1:50稀釋的兔抗人IgG-Fab和兔抗羊IgG-Fab30ul共同加入一標本上，1:50稀釋的鼠抗人IgA - Fc30ul加入另一標本，第三個標本則加入PBS做陰性對照，37°C溫箱溼盒內孵育45min，PBST洗5minX7次。
[0134]4)各標本上加入1:5000稀釋的DAPI30 - 40 μ 1，室溫溼盒內孵育3min，PBST洗3min。
[0135]5)封片:各標本上加入15 μ I抗焚光淬滅劑，傾斜蓋上蓋玻片，正置焚光顯微鏡下觀察。
[0136]實驗結果:在螢光顯微鏡下，與陰性對照組(如圖5-3)和同源對照組(如圖5-4)相比，無論是免疫複合物I (如圖5-1)還是免疫複合物2 (如圖5-2)均能明顯觀察到免疫複合物在腎小球繫膜區的沉積現象。在注入小鼠體內Ih到8h內，螢光強度無明顯差別，16h時螢光強度有逐漸增強趨勢，24h時的螢光強度明顯強於8h，差異有統計學意義(P < 0.05)。
[0137](表1為4h時的螢光面積和強度)
[0138]表1免疫螢光分析結果(5=s)
[0139]

【權利要求】
1.一種製備IgAl酶的方法，包括以下步驟: 1)以細菌作為發酵菌株，發酵完成後，得到發酵液；所述的細菌為淋球菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎球菌或變異鏈球菌； 2)分離純化發酵液，得IgAl酶。
2.根據權利要求1所述的製備IgAl酶的方法，其特徵是:所述的細菌為淋球菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎球菌。
3.根據權利要求1~2任一一項所述的製備IgAl酶的方法，其特徵是:所述淋球菌為菌株號為ATCC49226的菌株；所述流感嗜血桿菌為菌株號為ATCC49247或ATCC10211的菌株；所述肺炎鏈球菌為菌株號為ATCC? 6303?(血清3型)的菌株；腦膜炎球菌為菌株號為ATCC13090的菌株。
4.根據權利要求3所述的製備IgAl酶的方法，其特徵是:所述的細菌為淋球菌，其菌株號為ATCC49226 ;或者為流感嗜血桿菌，其菌株號為ATCC49247。
5.根據權利要求4所述的製備IgAl酶的方法，其特徵是:所述的細菌為流感嗜血桿菌，其菌株號為ATCC49247。
6.根據權利要求1所述的製備IgAl酶的方法，其特徵是: 步驟I)中所述的發酵方法 是: 將細菌復甦後接種於液體培養基中，置37°C 200r/min震蕩培養18h，使菌懸液的光吸收值A600為1.0 ； 將菌懸液以體積比10%的比例接種於液體培養基中，37°C 200r/min震蕩培養15_24h後，離心，收集上清液備用； 步驟2)中所述的分離純化方法是: 取步驟I)得到的上清液，在4°C攪拌條件下加入飽和硫酸銨(NH4)2SO4至終濃度為50%，之後靜置2h，於4°C離心，收集沉澱，用Tris-HCl緩衝液溶解，即獲得IgA蛋白酶粗製品，透析、濃縮後即得。
7.—種IgAl酶，其特徵是:其最適作用溫度為35-45°C ;最適作用PH值為6_10。
8.根據權利要求7所述的IgAl酶，其特徵是:其底物為低糖基化的IgAl。
9.根據權利要求7所述的IgAl酶，其特徵是:它是由權利要求1~6任意一項所述的方法製備的。
10.權利要求7所述的IgAl酶在製備治療IgAN的藥物中的用途。
【文檔編號】C12R1/46GK104073474SQ201410299797
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年6月27日 優先權日:2014年6月27日
【發明者】樊均明, 王麗, 文集, 李雪英 申請人:樊均明