紅花及其提取物製備和促進組織血管再生的醫療保健用途的製作方法
2023-05-30 15:00:16 3
專利名稱：紅花及其提取物製備和促進組織血管再生的醫療保健用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及紅花及其提取物包括紅花油、紅花總黃酮、紅花黃色素、紅花黃色素A、紅花黃色素B、紅花明苷A、羥基紅花黃色素A在促進組織血管再生的醫療保健用途。
背景技術：
小血管的形成對改善組織的血液供應狀態具有重要的意義。在許多疾病或生理狀態下，例如衰老、患有動脈硬化、糖尿病、高血壓、血管阻塞以及骨質退行性變等疾病時，組織內的小血管數量都明顯減少，造成微循環不良，組織的血液供應減少，進而造成組織的代謝障礙甚至產生嚴重的組織病理學改變。另外，各種原因造成的機體損傷，例如創傷、器官或組織移植、炎症反應等都面臨著修復過程，其中新生血管形成是組織修復以及組織循環改善的關鍵。因此發現能夠促進血管形成藥物。將在抗衰老、治療疾病以及加快修復過程等具有重要的意義。
紅花是常用的中草藥，其具有的活血化淤作用已經被幾千年的中醫臨床實踐所證實。近年來隨著中藥現代化的開展，紅花中有效成分被逐步的分離純化，包括紅花總黃酮(TotalSafflower flavone)、紅花黃色素(Safflower yellow)、紅花黃色素A(Safflower yellow A)、紅花黃色素B(Safflower yellow B)、紅花明苷A(safflamin A)以及羥基紅花黃色素A(Hydroxysafflor Yellow A)等。有的已經被開發成新藥。但是有關紅花及其提取物紅花油、紅花總黃酮、紅花黃色素、紅花黃色素A、紅花黃色素B、紅花明苷A以及羥基紅花黃色素A促進小血管再生的研究，國內外均未見報導，我們的研究發現紅花及其提取物紅花油、紅花總黃酮、紅花黃色素、紅花黃色素A、紅花黃色素B、紅花明苷A以及羥基紅花黃色素A均能夠促進骨髓祖細胞的動員，外周血祖細胞增多，血管內皮生長因子、鹼性成纖維生長因子(basicfibroblast growth factor，bFGF)，細胞外信號調節激酶(ex-tracellularsignal-regulated kinase，ERK)的表達增加，組織內小血管的數量增加。能夠改善動脈硬化、心肌梗死和血管堵塞後的組織血液供應和微循環狀態，改善衰老機體器官的血液供應狀態。是一個很好的預防和治療藥物。
技術內容本發明提供紅花及其提取物在促進組織血管再生的醫療保健用途。其中紅花可以草藥單味直接用藥，也可以和桃仁等中藥組成方劑用藥，例如傳統方劑桃紅四物湯、血府逐瘀湯，補陽還五湯等。紅花提取物可以按照藥劑學的要求製成現代中藥製劑。例如紅花總黃酮顆粒、紅花注射液、注射用紅花黃色素、紅花明苷A氯化鈉注射液、注射用紅花黃色素A、注射用紅花黃色素B和羥基紅花黃色素注射液等。
本發明提供的紅花提取物包括紅花油溶性提取物或水溶性提取物。其中水溶性提取物可以是有效部位紅花總黃酮、紅花黃色素，也可以是單體化合物紅花黃色素A、紅花黃色素B、紅花明苷A或羥基紅花黃色素A。其中紅花總黃酮的有效成分主要是紅花黃色素A、紅花黃色素B、紅花明苷A或羥基紅花黃色素A。以其有效成分計的含量在10～100％之間。紅花黃色素的有效成分主要是羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、紅花黃色素B、紅花明苷A。以其有效成分計的含量在10～100％之間。紅花黃色素A、紅花黃色素B、紅花明苷A和羥基紅花黃色素A是紅花中提取或化學合成的化合物，其含量在10～100％之間。
羥基紅花黃色素A 紅花黃色素B本發明提供的紅花黃色素在大鼠口服、肌肉注射和靜脈注射時均發現有促進組織血管再生的作用，其結果為外周血祖細胞增加，血管內皮生長因子、鹼性成纖維生長因子(basicfibroblast growth factor，bFGF)、細胞外信號調節激酶(ex-tracellular signal-regulated kinase，ERK)的表達增加，組織內小血管的數量增加。
紅花黃色素B和羥基紅花黃色素A能夠明顯改善beagle犬肢體創傷的組織修復，新生肉芽組織內的小血管數量增加，骨痂形成時間縮短。
紅花總黃酮和紅花明苷A能夠改善衰老大鼠的器官血液供應狀態，腎臟、心臟和腸道組織的小血管數量增加，起到延緩腎臟老化的作用。
紅花黃色素和羥基紅花黃色素B能夠明顯改善心肌梗死和腦梗死大鼠的組織恢復狀態，恢復狀態明顯好於對照組。也可以改善高血壓大鼠心肌纖維化狀態和嚴重肝損傷造成的肝硬化。
紅花水溶性提取物和油溶性提取物能夠明顯增加深度燙傷大鼠創面血管內皮細胞增殖。
紅花明苷A和羥基紅花黃色素A可明顯加快人工真皮內及移植床的血管新生和類真皮組織的形成，縮短「二期植皮」的間隔時間。
紅花黃色素和羥基紅花黃色素A能夠增加犬關節移植後的血供重建，提高成骨能力。
本發明提供的紅花及其提取物所具有的促進組織血管再生的醫療用途，可用於加快組織創傷的修復，器官和組織移植的血管重建，嚴重疾病過程的修復，包括心肌梗死，腦梗死，嚴重肺炎引起的肺纖維化，嚴重腎炎引起的腎纖維化，嚴重肝炎引起的肝硬化，高血壓引起的心肌纖維化，以及動脈硬化引起的動脈壁的纖維化、骨質的退行性變等。也可以用於血管堵塞引起的組織供血不良，包括下肢靜脈血栓形成和栓塞引起的靜脈淤血綜合症等。另外由於紅花及其提取物具有促進小血管的再生作用，可以用於抗衰老。
具體實施例方式
實施例1.紅花黃色素不同給藥途徑對大鼠外周血祖細胞和組織血管數量的影響。
內皮祖細胞(EPC)是一種能定向分化為血管內皮細胞的前體細胞，可直接參與血管發育和生成。血管內皮細胞生長因子(VEGF)、鹼性成纖維生長因子(basic fibro blast growthfactor，bFGF)，細胞外信號調節激酶(ex-tracellular signal-regulatedkinase，ERK)的表達增加，有利於小血管的再生，本研究的目的是觀察不同給藥途徑紅花黃色素對成年大鼠EPC的動員和組織血管數量(MVD)的影響及其機制。
材料與方法試驗藥物由青島啟元藥品研究所提供，批號20030510。動物由青島市藥品檢驗所提供，bFGF、ERK、EPC、VEGF和MVD免疫組化試劑盒購自武漢博士德公司。取6月齡成年雄性SD大鼠40隻，體重300～350g。隨機分實驗組A、實驗組B、實驗組C和對照組，每組10隻，實驗組A靜脈注射紅花黃色素10mg/kg，實驗組B肌肉注射紅花黃色素10mg/kg，實驗組C口服紅花黃色素60mg/kg，對照組口服生理鹽水，每天給藥1次，連續給藥3周，最後一次給藥1小時後取血，按照文獻方法1和試劑盒說明書測定外周血EPC，取心臟進行組織化學染色觀察組織內MVD、bFGF、ERK、VEGF的表達。數據表示為均數±標準差(x±s)，採用組間比較t檢驗，以p＜0.05作為統計學顯著性標誌。
結果給藥組EPC、MVD和VEGF、bFGF、ERK的表達明顯高於對照組(表1)
表1.紅花黃色素對大鼠EPC、MVD和VEGF、bFGF、ERK的表達的影響
與對照組比較*P＜0.05；**P＜0.01。
結論紅花黃色素在大鼠口服、肌肉注射和靜脈注射時均發現外周血祖細胞增加，組織內小血管的數量增加，其機制可能與促進VEGF、bFGF和ERK的表達有關。
文獻1.張喜成等。肢體缺血大鼠骨髓內皮祖細胞的動員與組織血管新生的相關性研究，中華實驗外科雜誌2004；21(12)1537-9實施例2.羥基紅花黃色素A對骨折創傷後的骨痂組織內的小血管形成的影響血管形成是骨折癒合的重要組成部分，由於羥基紅花黃色素A具有促進小血管再生的作用，本研究觀察藥物對骨折創傷後新生肉芽組織內小血管形成的影響。
材料與方法動物來源同實施例1。SD大鼠隨機分為空白對照組、藥物高劑量組和低劑量組，每組30隻。按照文獻方法(徐叔雲等主編，藥理實驗方法，第二版，人民衛生出版社)做股骨骨折，創傷後採用髓內釘固定。手術3天後開始給藥羥基紅花黃色素A，高劑量組10mg/kg，低劑量組5mg/kg，對照組給予生理鹽水，腹腔注射給藥，每天1次，連續3周，分別於手術後2周、4周和8周取骨折部位連接部骨痂，按照實施例1方法觀察骨痂組織中的小血管數量。
結果對照組2周見少量連接部骨痂，4周仍有動物的骨痂有縫隙，8周骨痂基本形成，骨痂內小血管數量明顯少於給藥組，2給藥組動物2周就見連接部骨痂形成，4周骨痂未見明顯縫隙，8周骨痂形成良好，骨痂內小血管數量明顯多於對照組。
結論羥基紅花黃色素A能夠明顯改善beagle犬骨折創傷的組織修復，骨痂組織內的小血管數量增加，骨痂形成時間縮短。
實施例3.紅花黃色素B對衰老大鼠腎臟組織血管數量的影響紅花黃色素B由青島啟元藥品研究所提供，批號20031027。大鼠來源同上。大鼠隨機分為空白對照組、模型組、藥物高劑量組(20mg/kg)和低劑量組(10mg/kg)。除空白對照組外，其他組動物採用文獻方法(徐叔雲等主編，藥理實驗方法，第二版，人民衛生出版社)複製大鼠衰老模型，1周後腹腔注射藥物，連續給藥4周後，按照實施例1的方法測定大鼠心臟、腎臟和腸道組織中的小血管數量。
結果紅花黃色素B能夠明顯改善衰老大鼠的器官血液供應狀態，腎臟、心臟和腸道組織的小血管數量增加，起到延緩組織器官老化的作用(表2)。
表2.紅花黃色素B對心臟、腎臟和腸道組織中的小血管數量(條/mm2)
與模型組比較*P＜0.05實施例4.紅花明苷A對缺血心肌組織血管形成的作用觀察。
組織小血管的再生對急性心肌梗死組織的修復具有重要意義。稱為「藥物血管搭橋」。本研究觀察紅花黃色素對缺血心肌組織血管形成的影響。
材料與方法試驗藥物來源同實施例1。wistar大鼠(來源同上)，體重250～300g，隨機分為4組，分別為假手術組、空白對照組、藥物高劑量組和低劑量組，每組20隻。假手術組和空白對照組分別肌肉注射生理鹽水，藥物高劑量組肌肉注射紅花黃色素，20mg/kg，藥物低劑量組10mg/kg，每天1次，連續3周，採用文獻方法建立急性心肌梗死模型(徐叔雲等主編，藥理實驗方法，第二版，人民衛生出版社)。手術後停藥1周，第2周開始繼續給藥。分別於手術後14天和28天各組處死10隻動物，觀察梗死區面積，取梗死區邊緣做病理切片，採用文獻方法觀察心肌血管密度和梗死面積(孫林等。重組人鹼性成纖維細胞生長因子對缺血心肌血管結構的作用觀察中國心血管雜誌2004；19(3)163-5)。結果紅花明苷A預防注射，能夠減少心急梗死面積，治療注射能夠增加梗死區邊緣血管密度(表3)表3紅花明苷A肌肉注射對缺血心肌血管密度的影響(x±s)
^與假手術組比較P＜0.01，*空白組比較P＜0.010實施例5.紅花總黃酮改善高血壓大鼠心肌纖維化狀態動脈血壓升高引起心肌後負荷增加，導致左心室肥厚，常伴發灶性心肌纖維化，是心肌收縮力降低。本研究觀察紅花總黃酮對高血壓大鼠心肌纖維化的組織形態學影響。材料與方法紅花總黃酮由青島啟元藥品研究所提供，動物的來源同上，隨機分為假手術組、空白對照組、藥物高劑量組(40mg/kg)和低劑量組(20mg/kg)，每組10隻。假手術組只開腹腔不結紮腎動脈，其他組按照文獻方法結紮腎動脈複製大鼠高血壓模型景麗等。腎血管性高血壓大鼠心肌纖維化的病理組織學研究·2004；26(1)1-3。手術1周後，假手術組、空白對照組灌胃給予生理鹽水，藥物組每天口服紅花總黃酮，連續給藥4周，最後一次給藥後1小時將大鼠麻醉後取出心臟，觀察心肌組織內的纖維化和心血管數量。
結果給藥組心肌內的纖維化明顯減輕，血管數量增加。
實施例6.紅花外敷對深度燙傷大鼠創面血管密度的影響目的血管形成在組織癒合過程中的作用舉足輕重。本試驗利用大鼠燙傷模型，觀察創面癒合邊緣血管內皮細胞增殖的變化。
材料與方法紅花敷料的製備取紅花500g，CO2超臨界方法提取紅花油，以紅花油與紅花總黃酮1∶1的比例加滅菌生理鹽水100ml，用紗布浸潤，真空包裝。121℃滅菌25分鐘後備用。動物來源同上，隨機分為正常對照組、單純損傷組、藥物組。每組10隻。除正常對照組外，其餘動物用80℃水造成燙傷，面積約5×5cm。正常對照組和單純損傷組動物每日表面覆蓋滅菌生理鹽水紗布，藥物組每日覆蓋紅花敷料，連續給藥2周，每日觀察損傷組織的修復情況，創傷表面直徑每減少1cm，計為1分。每周自每隻動物癒合組織邊緣取病理，按照實施例1方法觀察標本中小血管計數。
結果用藥組的創面癒合情況明顯比單純損傷組好，組織化學觀察組織內的小血管數量增加，這種增加在2周後仍持續存在，而單純燙傷組在第2周小血管的數量明顯低於第1周(表4)。
表4紅花外敷對深度燙傷大鼠創面血管密度的影響(x±s)
^與第1周比較P＜0.05，*與單純損傷組比較P＜0.01結論紅花敷料能夠明顯增加深度燙傷大鼠創面小血管的數量。縮短創面癒合時間。
實施例7.紅花黃色素A對兔頸脊髓腹側慢性受壓模型脊髓微血管的影響目前認為機械壓迫的損害作用是由組織缺血導致的神經元微環境改變引起的，本試驗研究脊髓受壓後脊髓微血管、神經元微環境的變化。
材料與方法紐西蘭大白兔共40隻(來源同上)，隨機分為假手術組、重度壓迫組、藥物高劑量組和低劑量組4組。假手術組只進行手術，不損傷脊髓，其他組按照文獻方法造成兔重度頸脊髓腹側慢性受壓模型模(蔡欽林等。慢性壓迫性頸脊髓病超微病理變化的實驗研究。中國脊柱脊髓雜誌。1996；6(6)254)。手術成功2周後。開始給藥，每日靜脈點滴紅花黃色素A，連續給藥3周，末次給藥後1小時處死動物取出頸髓按照實施例1的方法顯示小血管。神經細胞凋亡觀察按照藥盒說明書(POD)方法(Boehinger Mannheim公司)檢測。
結果重度壓迫組神經元數量減少，前角明顯。顯微鏡下見神經元萎縮，白質脫髓鞘，軸突不居中或缺如。受壓灰質前角血管分布少，前角與白質交界處見少量神經元調亡，膠質細胞凋亡在灰質、白質多見。假手術組在白質偶見凋亡的神經膠質細胞。給藥組在灰質前角偶見陽性標記的神經元，中央管附近及后角有陽性標記膠質細胞，白質前索及後索有膠質細胞凋亡。灰質前角血管分布比單純損傷組多。提示紅花黃色素A能夠減輕壓迫缺血對神經元的損害作用，促進血管增生，增加脊髓血液供應。
實施例8.羥基紅花黃色素A對急性肺損傷肺內血管形成的影響急性肺損傷的組織修復伴有組織血管生成狀態的改變，微血管形成良好可以減輕肺纖維化的程度，對預後具有重要意義。
材料與方法羥基紅花黃色素A由青島啟元藥品研究所提供。動物來源同上。將SD大鼠隨機分為正常對照組，模型對照組，藥物高劑量組(20mg/kg)和低劑量組(10mg/kg)。每組10隻。正常對照組和模型對照組每日腹腔注射生理鹽水，藥物組腹腔注射羥基紅花黃色素A，每日1次，2周後除正常對照組外，其餘3組動物尾靜脈注射油酸0.1ml/kg。繼續給藥3周後，解剖取出肺臟，稱重，計算臟器係數(臟器重量g/100g體重)按照文獻觀察肺組織內的小血管數量和纖維化程度(Carl Zeiss KS400圖像分析儀)。
結果羥基紅花黃色素A能夠明顯增加損傷肺組織的心血管數量，減輕肺組織的纖維化。
表5.羥基紅花黃色素A對大鼠肺纖維化狀態和肺組織小血管的影響
與模型組比較*p＜0.0權利要求
1.紅花及其提取物在促進組織血管再生的醫療保健用途。
2.按照權利要求1所述的紅花其特徵是以草藥單味直接用藥，也可以與桃仁等中藥組成方劑用藥，例如傳統方劑桃紅四物湯、血府逐瘀湯，補陽還五湯等。
3.按照權利要求1所述的紅花及其提取物其特徵是紅花油溶性提取物和水溶性提取物。其中油溶性提取物和水溶性提取物可以單獨用藥，也可以一定的比例混和後用藥，其比例為0.1～99.9％∶99.9～0.1％之間。油溶性提取物可以通過蒸餾和CO2超臨界萃取獲得。水溶性提取物可以是有效部位紅花總黃酮、紅花黃色素，也可以是單體化合物紅花黃色素A、紅花黃色素B、紅花明苷A或羥基紅花黃色素A。其中紅花總黃酮的有效成分主要是紅花黃色素A、紅花黃色素B、紅花明苷A和羥基紅花黃色素A。以其有效成分計含量在5～100％之間。紅花黃色素的有效成分主要是羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、紅花黃色素B、紅花明苷A。以其有效成分計含量在5～100％之間。紅花黃色素A、紅花黃色素B、紅花明苷A和羥基紅花黃色素A是從藥材中提取或化學合成的化合物，其含量在10～100％之間。
4.按照權利要求1～3所述的紅花及其提取物其特徵是按照藥劑學的要求製成製劑。例如紅花總黃酮顆粒、紅花注射液、注射用紅花黃色素、紅花明苷A氯化鈉注射液、注射用紅花黃色素A、注射用紅花黃色素B和羥基紅花黃色素A注射液以及外用製劑等。
5.按權利要求1～4所述的紅花及其提取物其特徵是在口服、肌肉注射、靜脈注射以及外用時有促進組織血管再生的作用。
6.按權利要求1～5所述的紅花及其提取物其特徵是有促進組織血管再生和開放的作用。組織內小血管的數量增加。
7.按權利要求1～6所述的紅花及其提取物促進組織血管再生的作用。其特徵是能夠促進骨髓祖細胞的增殖和動員，血液內祖細胞數量增多。血管內皮生長因子和/或鹼性成纖維生長因子和/或細胞外信號調節激酶的表達增加，並與祖細胞增殖和/或血管內皮生長因子和/或鹼性成纖維生長因子和/或細胞外信號調節激酶的基因調控有關。
8.按權利要求1～7所述的紅花及其提取物其特徵是可以用於組織損傷後的修復。例如創傷後的修復；嚴重炎症反應後的修復，可以減輕包括心臟、腦、肺、腎、肝、脾、胰腺、血管、皮膚、骨、軟骨等組織器官纖維化；嚴重疾病過程的修復以及減輕和預防併發症的發生，包括心肌梗死，腦梗死，嚴重肺炎，嚴重腎炎，嚴重肝炎，高血壓，糖尿病以及動脈硬化等。
9.按權利要求1～7所述的紅花及其提取物其特徵是用於促進血管的重建。用於器官和組織移植，血管堵塞後組織的血液供應障礙，例如關節置換、人工皮膚、器官移植、血管堵塞、骨質退行性變等疾病。
10.按權利要求1～7所述的紅花及其提取物其特徵是能夠改善衰老機體的組織器官血液供應狀態，用於抗衰老保健。
全文摘要
本發明涉及紅花及其提取物包括紅花油、紅花總黃酮、紅花黃色素、紅花黃色素A、紅花黃色素B、紅花明苷A、羥基紅花黃色素A在促進組織血管再生的醫療保健用途。可用於加快組織創傷的修復，器官和組織移植的血管重建，嚴重疾病過程的修復，包括心肌梗死，腦梗死，嚴重肺炎引起的肺纖維化，嚴重腎炎引起的腎纖維化，嚴重肝炎引起的肝硬化，高血壓引起的心肌纖維化，以及動脈硬化引起的動脈壁的纖維化、骨質的退行性變等。也可以用於血管堵塞引起的組織供血不良，包括下肢靜脈血栓形成和栓塞引起的靜脈淤血綜合症等。另外由於紅花及其提取物具有促進小血管的再生作用，可以用於抗衰老。
文檔編號A61P13/12GK1827121SQ200510042120
公開日2006年9月6日 申請日期2005年3月2日 優先權日2005年3月2日
發明者彭康康, 馬維富 申請人:青島啟元藥品研究所