油菜光合效率相關基因perg及製備方法和應用與流程
2023-05-31 02:53:37 1
本發明屬於分子生物學領域，具體涉及一種與油菜光合效率相關的基因perg及其製備方法，該基因可提高葉片的光合效率，通過轉基因技術證實基因perg的過量表達增強了擬南芥葉片的光合效率。
背景技術：
油料作物生產不僅在國民經濟和社會發展中佔有重要地位，也是促進中國農業可持續發展的主要因素之一。目前中國的植物油生產量僅能滿足國內1/2－2/3的消費需求，大量依賴進口，是世界上最大的油料進口國。油菜是中國最主要的油料作物之一，菜籽油在中國的食用油約佔40％。中國油菜年種植面積700萬公頃，菜籽產量超過1000萬噸，面積和總產均為世界第一位，分別佔全世界的1/3。目前經過幾代育種學家的努力，通過傳統育種途徑已經使油菜單產提高了許多，進一步通過傳統育種途徑大幅度提高產量的難度很大。
光合作用是植物生長的基礎，並支撐著地球上絕大部分生物的生命活動。伴隨著環境的惡化和資源的日益匱乏，現代農業亟需提供更高的農作物產量以養活不斷增長的龐大數量人口。通過光合作用性狀改良來提高農作物的產量對現代農業的綠色與可持續發展有著至關重要的意義(murchieetal.,2009；janssenetal.,2014)。光能為植物提供持續而純淨的能源，植物乾物質含量的90％～95％來自光合作用的能量供給，光能利用效率的強弱決定了農作物產量的高低。研究表明增強農作物的光合效率理論上可以提高其50％的產量潛力(zhuetal.,2010；covshoffandhibberd,2012)。然而主要的農作物如水稻，小麥、油菜和大豆等c3作物光能利用效率很低，因而研究光合作用進行高光效改良將能從根本上大幅提高農作物的產量。
油菜是最重要的油料作物之一，其生產的菜籽油佔我國食用植物油供給的一半。我國油菜種植面積和產量均居世界第一，然而2012-2013年統計我國食用植物油自給率已嚴重不足，僅為35.3％，由於嚴重依賴進口，已對我國食用植物油的供給安全造成了威脅(王漢中和殷燕，2014)。目前水稻等主要糧食作物的光合作用方面已經投入了大量的研究和嘗試，而油菜等油料作物相關研究則較為滯後，目前為止尚未有油菜光合作用相關基因的報導。因而深入研究光合性狀提高光合效率對促進油菜高油高產和油菜生產的可持續發展有著重要意義，有利於解決我國食用油供給安全方面所處的困境。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供了一種油菜光合效率相關基因perg，其序列為seqidno.1所示，編碼的蛋白為seqidno.2所示。
本發明的另一個目的在於提供一對油菜光合效率相關基因perg的擴增引物，用於perg基因的克隆，方法簡便易操作。
本發明的再一個目的在於提供了基因perg在提高植物葉片(如擬南芥)光合效率中的應用，通過轉基因技術證實基因perg的過量表達增強了擬南芥葉片的光合效率。
為了實現上述目的，本發明採用以下技術措施：
油菜光合效率相關基因perg的克隆，其步驟是：
1)自一對光合效率存在差異的油菜品系中轉錄組數據分析得到基因perg，利用油菜基因組序列以及擬南芥資料庫中該基因序列設計基因擴增cdna編碼區引物，其序列為正向引物5′-atgggaaacagagagcaag-3′，反向引物5′-tcatccatggaattggtag-3′；
2)以油菜cdna第一鏈為模板進行rt-pcr擴增，將擴增得到的片段進行測序，獲得油菜perg基因序列，其核苷酸序列為seqidno.1所示，其胺基酸序列為seqidno.2所示。
油菜基因perg在提高植物葉片光合效率中的應用，其方法是：
1)將克隆得到的油菜基因perg分別與質粒連接，命名為pcambia3301-perg；
2)將載體pcambia3301-perg轉入根癌農桿菌gv3101，再導入擬南芥植株中；
3)種植擬南芥t0代所收穫的種子，提取葉片dna後進行pcr鑑定用於篩選陽性植株，最終確認基因已導入的陽性植株；
4)對擬南芥突變體、野生型對照及轉基因株系的光合效率進行測定，結果表明，過量表達perg的轉基因株系葉片光合效率提高，與野生型對照相比增加幅度在20％-47％。
perg基因編碼定位於細胞核和細胞質膜的蛋白，目前在所有植物中功能尚未有被報導。本研究發現利用葉片特異啟動子驅動perg在擬南芥中的表達，可以提高擬南芥葉片的光合速率。
與現有技術相比，本發明具有以下優點及有益效果：
本發明是國內外首次公開油菜光合效率相關基因perg序列，目前該類基因可調控植物葉片光合作用的功能沒有相關報導。利用擬南芥作為受體的轉基因實驗證實，perg基因的過量表達提高了植物的光合效率，本發明實驗結果表明，與野生型對照相比，轉perg基因擬南芥的光合效率最高可提高47％，擬南芥種子的產量也相應得到提高。因此，本發明提出可利用油菜光合效率相關基因perg的過量表達來增強植物光合效率以便用於作物的產量選育。
附圖說明
圖1為表達載體pcambia3301-perg構建示意圖。
圖2為油菜perg轉基因株系與野生型對照對比，wt為野生型擬南芥，bnperg為轉油菜光合效率相關基因perg的擬南芥株系。
具體實施方式
本發明中所用的術語「轉基因植物」是指含有導入的基因並能夠穩定地增強或抑制所導入的基因表達並產生具有特定的生物學性狀的植物。
克隆本發明中所述的獲得油菜光合效率相關基因perg的方法是本領域中所常採用的方法。提取植物葉片dna是常用的分子生物學技術，提取mrna的方法也有多種成熟的技術，試劑盒(trizolreagent)可從商業途徑獲得(invitrogen公司)，而構建cdna文庫也是常用的分子生物學技術。構建本發明中所述的載體構建和將載體轉染入植株所用到的酶切、連接、花序侵染等方法也是本領域中常用技術。其中所涉及的質粒(pcambia3301)，轉染用媒體(如根癌農桿菌gv3101和所用試劑成分如蔗糖、6-ba等)可從商業途徑獲得。
實施例1：油菜光合效率相關基因perg的克隆
1、設計cdna編碼區引物
利用一對高低光合效率油菜材料zy036和51070的轉錄組數據分析，發現perg基因表達存在顯著差異，因此將其篩選出作為影響光合效率的候選基因。在ncbi資料庫中檢索已發表的擬南芥perg基因序列(at1g01840)，並以此編碼區序列blast油菜資料庫，尋找與之同源的油菜perg基因序列，並設計基因編碼序列的兩側引物：perg正向引物5′-atgggaaacagagagcaag-3′，反向引物5′-tcatccatggaattggtag-3′，用於從油菜中擴增perg的對應序列。
2、基因序列擴增
(1)提取油菜mrna
採用trizoltmkit提取rna：液氮研磨100mg油菜材料，加1mltrizol，室溫(20-25℃，下同)放置5min；加入200μl氯仿，劇烈振蕩30s，室溫放置2min；4℃條件下12000×g離心15min，取上清至新管中，加入500μl異丙醇，混勻後室溫放置15min；4℃條件下12000×g離心15min，去上清，加入1ml70％(無水酒精與h2o的體積比)乙醇；4℃條件下7500×g離心7min，去上清，空氣乾燥；depc－h2o溶解；
(2)cdna第一鏈的反轉錄採用revertaidhminusfirststrandcdnasynthesiskit(fermentas)，操作參照所用試劑盒說明進行；
(3)以cdna為模板進行pcr擴增並測序，擴增體系及條件如下：
pcr反應混合液的配比為(25μl體系)：cdna模板1μl，dntp(10mm)0.5μl，上下遊引物(5μm/μl)各1μl，buffer2.5μl，taq酶(1u)1μl，ddh2o18μl；反應的時間和溫度如下：94℃3min；94℃30s，59℃45s，72℃30s，30個循環；72℃5min。由此得到了油菜光合效率相關基因perg的cdna序列，其核苷酸序列為seqidno.1所示，對應該核酸序列的蛋白質，其胺基酸序列為seqidno.2所示。
實施例2：油菜基因perg在提高擬南芥葉片光合效率中的應用
1、perg表達載體的構建及擬南芥的轉化
perg表達載體的構建：設計帶載體接頭的引物，擴增與載體一步融合的基因序列(perg正向引物：5′-gggggactcttgaccatggtaatgggaaacagagagcaag-3′，反向引物：5′-gtcacctgtaattcacacgtgtcatccatggaattggtag-3′)，將pcr擴增得到的基因序列與pcambia3301載體(cambia公司)用一步克隆試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)連接重組，轉化到感受態細胞dh5α(invitrogen公司)中，示意圖見圖1。
擬南芥的轉化步驟：
(1)製備好已轉化了相應質粒的農桿菌(根癌農桿菌gv3101)菌液10ml，在轉化前一天晚上，轉入大瓶培養過夜，第二天取出使用時農桿菌菌液od600在1.2到1.6之間；
(2)室溫5000rpm離心15分鐘；
(3)棄上清，將農桿菌沉澱懸浮於相應體積的滲透培養基裡，使od600在0.8左右；
(4)將整個植株直接浸泡至農桿菌懸浮液30s；
(5)避光培養過夜，然後正常培養至結子。
滲透培養基(1l)：1/2×murashige-skoog；5％(質量比)蔗糖；0.5克mes；用koh調至ph5.7；再加：10微升1mg/ml的6-ba母液；200微升silwetl-77。
2、轉基因擬南芥的篩選和驗證
將春化過的擬南芥種子種於澆過飽和pns營養液的人工土中，並用保鮮膜罩上；兩天後人工模擬自然條件光照(光照16小時，暗8小時)，三天後揭膜。人工培養室條件：相對溼度80％，恆溫20-24℃，光照強度80-200μmol/m2·s，光照周期為8h黑暗﹑16h光照培養。一周左右，噴除草劑篩選陽性植株。具體步驟如下：
(1)提取轉化植株總dna
a.70％(體積比，下同)乙醇擦洗葉片，稱取大約100mg；
b.加入600μl抽提緩衝液(0.2mtris-cl，0.25mmnacl，25mmedta，0.5％sds，ph7.5)，室溫快速研磨；
c.ependorff管中渦旋混勻5-10s；
d.室溫下12000rpm離心25min，取上清，加等體積異丙醇，-20攝氏度沉澱過夜；
e.室溫下12000rpm離心15min，加入70％乙醇200μl泡洗dna沉澱；
f.室溫下12000rpm離心15min，去乙醇，倒置於紙巾上，待乙醇揮發乾淨；
g.加無菌水100μl溶解粗提dna沉澱，用分光光度計測定或電泳估測其濃度。
(2)篩選轉基因陽性植株
葉片dna提取後進行pcr鑑定，引物序列為：上遊引物：5′-atgggaaacagagagcaag-3′，下遊引物：5′-cccatctcataaataacgtcat-3′；pcr反應混合液的配比為(25μl體系)：dna模板1μl，dntp(10mm)0.5μl，上下遊引物(5μm/μl)各1μl，buffer2.5μl，taq酶(1u)1μl，ddh2o18μl；反應的時間和溫度作如下：94℃3min；94℃30s，59℃45s，72℃30s，30個循環；72℃5min。檢測結果顯示，大多數轉化植株均能夠擴增出預期大小(500bp左右)的電泳條帶，而陰性對照則沒有，表明轉基因擬南芥基因組中已經含有外源基因dna片段。
3、擬南芥轉基因株系表型分析
葉片光合效率分析：利用野生型擬南芥為受體進行轉基因，油菜光合效率相關基因perg過量表達葉片顏色變成深綠色(見圖2)。對野生型對照(wt)及轉基因株系(bnperg)的光合效率進行測定(thebngrf2gene(grf2-likegenefrombrassicanapus)enhancesseedoilproductionthroughregulatingcellnumberandplantphotosynthesis.journalofexperimentalbotany,2012,63,10:3727–3740)，結果表明，過量表達油菜光合效率perg的轉基因株系的葉片光合效率提高(見表1)，與野生型對照相比增加幅度在20％-47％。
表1.轉油菜和擬南芥perg基因的擬南芥株系葉片光合效率測定結果
sequencelisting
中國農業科學院油料作物研究所
油菜光合效率相關基因perg及製備方法和應用
油菜光合效率相關基因perg及製備方法和應用
2
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1
465
dna
油菜
1
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tctcatcaaatcggaaccgccgtggaacgaaaccagctccttcaaatctcctcctctctc120
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gataactctgtctcctccgtcgctccgatgcaattaggggagggcgaggctgaagcgatg240
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aggaacaagagagccaagaagcggccactgtctccgtcgtctgcggtggtggagacttcg360
gcgacagaagagaggagtagccgtgattattatgggcagttcgatttggacccaaatgcc420
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