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複合酶製劑高效降解黃麴黴毒素B1的製備方法與流程

2023-05-30 22:57:46 3


本發明屬於酶製劑領域,涉及一種高效降解黃麴黴毒素B1的複合酶製劑的製備方法。



背景技術:

黃麴黴毒素是一個典型的真菌次生代謝產物,其具有極強致癌、致畸、致突變性作用。黃麴黴的主要作用器官是肝臟,並能誘發肝細胞癌變,給人類和動物帶來巨大的危害。黃麴黴毒素汙染的範圍比較廣泛如花生、玉米、乾果、牛奶等日常食物,因其毒性巨大,而越來越受關注。黃麴黴毒素對糧食的汙染嚴重影響到各國的進出口貿易,給經濟帶來了巨大的損失。

黃麴黴毒素在結構上是由一個雙呋喃環和一個氧雜萘鄰酮環組成,其結構式中的不飽和內酯環結構以及雙呋喃環是黃麴黴毒素強致癌性的原因。黃麴黴毒素B1是毒性最強的一種,當內酯環結構被破壞時,螢光性會消失,毒性也會隨之減弱,因此將毒素降解的關鍵是將其結構破壞。傳統方法去除黃麴黴毒素主要有物理吸附、臭氧處理、酸鹼調控處理、輻射處理,但是傳統物理化學方法處理黃麴黴毒素包含降解效率低,副產物多,操作複雜,成本高昂的缺點,因此迫切需求一種安全高效降解黃麴黴毒素的方法。

生物法降解黃麴黴毒素成為當今的熱點,利用具備降解能力的真菌或者細菌降解黃麴黴毒素。經研究微生物降解黃麴黴毒素主要分為微生物吸附和微生物降解兩種。微生物對黃麴黴毒素的降解主

要是其所產酶起作用效果。研究不同菌體胞外酶按照一定的組分百分比混合製成複合酶製劑高效降解黃麴黴毒素B1的研究甚少。



技術實現要素:

本發明在於提供一種高效降解黃麴黴毒素B1的複合酶製劑的製備方法。

本發明的好食脈胞菌、雷斯青黴來自於實驗室保藏,真菌漆酶源自於試劑公司購買。

為實現上述目的,本發明採用的技術方案為:

一種高效降解黃麴黴毒素B1的複合微酶製劑:由好食脈胞菌和雷斯青黴的粗酶製劑與真菌漆酶按照一定的組分百分比混合而成。

進一步在製備複合酶製劑時,由好食脈胞菌和雷斯青黴的粗酶製劑以及真菌漆酶分別以一定的組分百分比混合而成,並確保各自所佔組分百分比在區間20%~60%以內,並且兩組分之和為100%。

本發明高效降解黃麴黴毒素B1的複合酶製劑的製備方法包括以下步驟:

(1)發酵培養好食脈胞菌以及雷斯青黴,並將各自培養液置於離心管內離心5500rpm離心10分鐘,將上清液與下層菌體分開,將上清液超濾濃縮10倍,採用50%的飽和硫酸銨沉澱,10000轉離心5分鐘,棄去上清,將沉澱蛋白進行磷酸鹽緩衝液復溶,透析過夜之後進行冷凍乾燥,進而將得到蛋白作為好食脈胞菌和雷斯青黴的粗酶製劑。

(2)將上述好食脈胞菌粗酶製劑、雷斯青黴的粗酶製劑和真菌漆酶

混合製成複合酶製劑,其中三者都滿足所佔組分百分比在區間20%~60%以內,並且三組分之和為100%。

利用國標法(編號:GB/T 17480-2008)檢測黃麴黴毒素B1的含量。黃麴黴毒素B1降解率利用以下公式計算:降解率=(1-樣品中AFB1峰面積/空白對照中AFB1的峰面積)×100%。

黃麴黴毒素B1的製取:取粉碎的玉米、花生、小麥於錐形瓶中,加入蒸餾水攪拌均勻,滅菌之後接種黃麴黴菌懸液,置於恆溫培養箱培養一周左右,取被黃麴黴汙染的樣品與燒杯中,加入甲醇充分攪拌使黃麴黴素充分溶解,紗布過濾殘渣,向濾液中加入氯仿充分振蕩萃取,取下層氯仿於旋轉蒸發儀蒸乾,色譜甲醇溶解,並於0.22微米濾膜過濾,利於HPLC進樣並收集黃麴黴毒素B1出峰區間的流出樣,進而得到純化的黃麴黴毒素B1,檢測其純度可達95%。

本發明在研究複合酶製劑降解黃麴黴毒素B1的過程中,充分考慮到環境因素對其降解效果的影響。經過研究發現,通過控制降解溫度以及降解pH,在相同的溫度以及pH下,複合酶製劑對黃麴黴毒素B1的降解能力相比好食脈胞菌粗酶製劑、雷斯青黴粗酶製劑、真菌漆酶分別單獨降解同等濃度的黃麴黴毒素B1的降解率有顯著的提升。

本發明考慮到將降解黃麴黴毒素B1作用位點存在差異的酶混合,充分發揮不同種類酶在體系中的互補作用以及與酶在降解毒素的過程中相互促進作用。研究環境因素影響對複合酶製劑降解黃麴黴毒素B1效率的過程中,控制降解黃麴黴毒素B1的溫度為33℃~37℃,pH為5~7.5,以及酶液濃度和作用時間等重要條件。複合酶製劑在同等條件下降解黃麴黴毒素B1的效率相比好食脈胞菌粗酶製劑、雷斯青黴粗酶製劑與真菌漆酶分別單獨降解黃麴黴毒素B1的效率提高25%以上。

本發明一種高效降解黃曲酶毒素B1的複合酶製劑,控制複合酶製劑與黃麴黴毒素B1在降解體系中之比區間為0.2g/L·ppm~0.4g/L·ppm時,複合酶製劑在同等條件下降解黃麴黴毒素B1相比好食脈胞菌粗酶製劑、雷斯青黴粗酶製劑與真菌漆酶分別單獨降解黃麴黴毒素B1時表現出顯著的用料節省性。

本發明主要是考慮到將能夠降解黃麴黴毒素B1的微生物酶製劑混合,發揮酶復配之後產生的協同效應。將不同種粗酶製劑與真菌漆酶進行配比混合,使作用位點有差異以及作用位點相似的酶匯聚在相同的環境裡,從而發揮酶與酶之間的互補和協同作用提升降解能力。

本發明的好食脈胞菌粗酶製劑內包含錳過氧化物酶能夠作用於黃麴黴毒素B1的雙呋喃環末端的雙鍵,通過對雙呋喃環末端的雙鍵進行氧化和加成反應,生成AFB1-8,9-二氫二醇,從而降低黃麴黴毒素B1的毒性。雷斯青黴粗酶製劑將黃麴黴毒素B1的雙呋喃環不飽和雙鍵加氫消除,從而使黃麴黴毒素B1降解為黃麴黴毒素B2。真菌漆酶多為白腐真菌等發酵生產提取而成的,研究發現其作用黃麴黴毒素B1之後能夠降低毒素的螢光強度,因此推測真菌漆酶解毒機理是使AFB1內酯環開環。複合酶製劑中三種組分對黃麴黴毒素B1的作用效果不同。

本發明複合酶製劑中,好食脈胞菌粗酶製劑和雷斯青黴粗酶製劑分別能夠將黃麴黴毒素B1的雙呋喃環不飽和雙鍵進行氧化加成以及還原雙鍵,從而降解並改變黃麴黴毒素B1的結構使其毒性降低。而源自於白腐真菌的真菌漆酶通過催化黃麴黴毒素B1的內酯環開環從而使毒素降解。將真菌漆酶與上述兩種粗酶混合,匯聚了不同能力降解酶的共同點和特異性,同時發揮不同種類酶的作用位點互補作用,使複合酶製劑能夠多方位降解黃曲酶毒素B1,三種酶在不同層次上降解黃麴黴毒素B1的同時相互促進,進一步將黃麴黴毒素B1徹底降解,從而整體提升對黃麴黴毒素B1的降解能力。

複合酶製劑在處理飼料中黃麴黴毒素B1中的應用。

本複合酶製劑具有降解黃麴黴毒素B1效率高、無汙染、在降解飼料中的黃麴黴毒素具有廣闊的前景。研究證明,將好食脈胞菌粗酶製劑、雷斯青黴粗酶製劑以及真菌漆酶混合時,保證三者各自所佔組分百分比在區間20%~60%以內,且三組分百分比之和為100%,在研究環境影響複合酶製劑降解黃麴黴毒素的過程中,控制降解黃麴黴毒素B1的溫度為33℃~37℃,pH為5~7.5,所製成的複合酶製劑能夠高效降解黃麴黴毒素B1,降解率區間為76%~89%。在最適溫度33℃~37℃,pH為5~7.5研究複合酶製劑,複合酶製劑在同等條件下降解黃麴黴毒素B1的效率相比好食脈胞菌粗酶製劑、雷斯青黴粗酶製劑與真菌漆酶分別單獨降解黃麴黴毒素B1的效率提升25%以上。同時在控制複合酶製劑與黃麴黴毒素B1在降解體系中之比區間為0.2g/L·ppm~0.4g/L·ppm時,複合酶製劑在同等條件下降解黃麴黴毒素B1相比好食脈胞菌粗酶製劑、雷斯青黴粗酶製劑與真菌漆酶分別單獨降解黃麴黴毒素B1時表現出顯著的用料節省性。

附圖說明

圖1為複合酶製劑在36℃,pH6.5,作用72小時後黃麴黴毒素B1剩餘毒素濃度的示意圖。圖中1為初始檢測的黃麴黴毒素B1含量,作為對照組。圖中2、3、4分別代表好食脈胞菌粗酶製劑、雷斯青黴粗酶製劑、真菌漆酶分別單獨作用黃麴黴毒素B1剩餘毒素濃度的示意圖。5、6、7、8、9分別代表好食脈胞菌粗酶製劑、雷斯青黴粗酶製劑、真菌漆酶分別以組分百分比(20%、20%、60%),(30%、30%、40%)、(40%、20%、40%)、(30%、40%、30%)、(50%、25%、25%)混合而成的複合酶製劑作用黃麴黴毒素B1剩餘毒素濃度的示意圖。控制每組酶製劑的加入量相同均為0.2g。

具體實施方式

下面結合實施例,對本發明的具體實施方式進一步詳細描述。以下實施例是用來進一步說明本發明的內容,而不限制本發明的保護範圍。對於本發明所涉及的相關內容及所做的修改,均屬於本發明保護範圍。

實施例1

發酵培養好食脈胞菌以及雷斯青黴,並將各自培養液置於離心管內離心5500rpm離心10分鐘,將上清液與下層菌體分開,將上清液超濾濃縮10倍,採用50%的飽和硫酸銨沉澱,10000轉離心5分鐘棄去上清,將沉澱蛋白進行磷酸鹽緩衝液復溶,透析過夜之後進行冷凍乾燥,進而將得到蛋白作為好食脈胞菌粗酶製劑和雷斯青黴粗酶製劑,保存備用。

將好食脈胞菌粗酶製劑、雷斯青黴粗酶製劑、真菌漆酶分別以組分百分比(20%、20%、60%)混合,稱量0.2g複合酶製劑(其中包含0.04g好食脈胞菌粗酶制、0.04g雷斯青黴粗酶製劑、0.12g真菌漆酶),充分震蕩溶解於1L無菌蒸餾水中製成酶液,使其在體系中的濃度為0.2g/L,加入黃麴黴毒素B1標準品使酶液中初始黃麴黴毒素B1濃度為1ppm。檢測初始黃麴黴毒素B1的含量作為對照。此時複合酶製劑與黃麴黴毒素B1在降解體系中之比為0.2g/L·ppm。控制培養溫度為36℃,pH為6.5培養72小時,檢測剩餘黃麴黴毒素B1的含量。

經檢測,對照組黃麴黴毒素B1含量為956ppb,黃麴黴毒素B1剩餘含量為110ppb,降解率最高可達88.5%。

實施例2

在實施例1製備好食脈胞菌粗酶製劑、雷斯青黴粗酶製劑的基礎上,將好食脈胞菌粗酶製劑、雷斯青黴粗酶製劑、真菌漆酶分別以組分百分比(40%、40%、20%)混合製成複合酶製劑,稱取0.4g複合酶製劑(包含0.16g好食脈胞菌粗酶製劑,0.16g雷斯青黴粗酶製劑,0.08g真菌漆酶),充分震蕩溶解於1L無菌蒸餾水中製成酶液,使其在體系中的濃度為0.4g/L,加入黃麴黴毒素B1標準品使酶液中初始黃麴黴毒素B1濃度為1ppm。此時複合酶製劑與黃麴黴毒素B1在降解體系中之比為0.4g/L·ppm。控制培養溫度為36℃,pH為6.5,檢測黃麴黴毒素剩餘含量為500ppb時所需要的降解時間.與複合酶製劑作為對比,同等條件下分別檢測0.4g好食脈胞菌粗酶製劑、0.4g雷斯青黴粗酶製劑、0.4g真菌漆酶分別單獨降解黃麴黴毒素B1使其濃度達到500ppb所需的時間。

經過檢測,複合酶製劑降解黃麴黴毒素B1剩餘含量為500ppb時所需要的時間僅為9小時,好食脈胞菌粗酶製劑降解黃麴黴毒素B1剩餘含量為500ppb時所需要的時間為12h、雷斯青黴粗酶製劑降解黃麴黴毒素B1剩餘含量為500ppb時所需要的時間為14h、真菌漆酶降解黃麴黴毒素B1剩餘含量為500ppb時所需要的時間為13h,相對於三組分單獨作用所需的時間,複合酶製劑效率提升了(25%、35.71%、30.77%)。

實施例3

在實施例1製備好食脈胞菌粗酶製劑、雷斯青黴粗酶製劑的基礎上,將好食脈胞菌粗酶製劑、雷斯青黴粗酶製劑、真菌漆酶分別以組分百分比(40%、40%、20%),稱取0.4g複合酶製劑(其中包含0.16g好食脈胞菌粗酶製劑、0.16g雷斯青黴粗酶製劑、0.08g真菌漆酶),充分震蕩溶解於1L無菌蒸餾水中製成酶液,使其在體系中的濃度為0.4g/L,加入黃麴黴毒素B1標準品使酶液中初始黃麴黴毒素B1濃度為1ppm。檢測初始黃麴黴毒素B1的含量作為對照。此時複合酶製劑與黃麴黴毒素B1在降解體系中之比為0.4g/L·ppm。控制培養溫度為36℃,pH為6.5培養72小時。相同處理條件下,將好食脈胞菌粗酶製劑、雷斯青黴粗酶製劑、真菌漆酶分別單獨作用初始黃麴黴毒素B1濃度為1ppm的溶液,並檢測達到與複合酶製劑降解率相同時假單胞菌粗酶製劑、分支桿菌粗酶製劑、真菌漆酶的分別用量。

經檢測,對照組黃麴黴毒素B1含量為956ppb,在36℃,PH為6.5培養72小時剩餘黃麴黴毒素B1含量為150ppb,降解率達到84.31%,相同條件分別使用好食脈胞菌粗酶製劑、雷斯青黴粗酶製劑、真菌漆酶單獨作用1ppm的黃麴黴毒素B1,檢測剩餘黃麴黴毒素B1含量為150ppb左右時所需製劑的用量,結果表明,好食脈胞菌粗酶製劑、雷斯青黴粗酶製劑、真菌漆酶的用量分別為0.88g,0.93g,0.96g,而複合酶製劑的用量為0.4g,表現出複合酶製劑的省料性。

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