一種海因酶基因及其編碼的胺基酸和應用的製作方法

2023-05-30 22:51:46 1

>O.D.600μmol/min/ml/ODBL21/pETJ22.2±0.10.016±0.002實施例4、目的蛋白比活的測定將實施例2中過夜培養的BL21(DE3)/pETJ2按1％的接種量接入含50μg/ml卡那黴素的TB液體培養基中，37℃，200rpm，培養至OD600≈0.6時，加入終濃度為0.25mM的IPTG，於20℃，誘導培養5小時。收集菌液，離心，棄去上清，然後用50mMpH8.0的Tris-HCl緩衝液將菌體重懸。將重懸的菌液壓榨破壁，採用GE公司NiSepharoseHighPerformance純化目的蛋白，並用Bradford方法測定目的蛋白濃度。將目的蛋白用50mMpH8.0的Tris-HCl稀釋為終濃度0.06mg/mL，加入到含1％對羥基苯海因pH8.0的Tris-HCl緩衝液中，40℃反應30分鐘，加入3.7％的HCl中止酶反應並混勻。將上述反應液於12000rpm離心5分鐘，取上清稀釋10倍後利用HPLC分析反應產物生成的量(結果如圖4所示)，計算酶比活，結果如表2所示。用同樣的方法可從含有來源於Agrobacteriumsp.KNK712海因酶的工程菌(CGMCCNo.0520.2)中表達、純化得到來源於Agrobacteriumsp.KNK712的海因酶，並在上述同樣的條件下，測定其活性和比活。表2、目的蛋白比活測定結果根據上述實施例中實驗結果，可以推定具有SEQIDNO2的胺基酸序列的蛋白，具有海因酶的功能，因此是一種海因酶；且本發明的海因酶不同於目前已知來源的海因酶，其在以對羥基苯海因作為底物時，表現出較高的比活，其比活約為來源於Agrobacteriumsp.KNK712的海因酶的4倍，因此，在運用雙酶法生產對羥基苯甘氨酸的工業生產中可有較廣闊的運用前景。序列表110中國科學院上海生命科學研究院120一種海因酶130P50710121603170PatentInversion3.12101211457212PRT213Agrobacteriumsp.KNK7124001MetAspIleIleIleLysAsnGlyThrIleValThrAlaAspGlyIle151015SerArgAlaAspLeuGlyIleLysAspGlyLysIleThrGlnIleGly202530GlyAlaLeuGlyProAlaGluArgThrIleAspAlaAlaGlyArgTyr354045ValPheProGlyGlyIleAspValHisThrHisValGluThrValSer505560PheAsnThrGlnSerAlaAspThrPheAlaThrAlaThrValAlaAla65707580AlaCysGlyGlyThrThrThrIleValAspPheCysGlnGlnAspArg859095GlyHisSerLeuAlaGluAlaValAlaLysTrpAspGlyMetAlaGly100105110GlyLysSerAlaIleAspTyrGlyTyrHisIleIleValLeuAspPro115120125ThrAspSerValIleGluGluLeuGluValLeuProAspLeuGlyIle130135140ThrSerPheLysValPheMetAlaTyrArgGIyMetAsnMetIleAsp145150155160AspValThrLeuLeuLysThrLeuAspLysAlaValLysThrGlySer165170175LeuValMetValHisAlaGluAsnGlyAspAlaAlaAspTyrLeuArg180185190AspLysPheValAlaGluGlyLysThrAlaProIleTyrHisAlaLeu195200205SerArgProProArgValGluAlaGluAlaThrAlaArgAlaLeuAla210215220LeuAlaGluIleValAsnAlaProIleTyrIleValHisValThrCys225230235240GluGluSerLeuGluGluValMetArgAlaLysSerArgGlyValArg245250255AlaLeuAlaGluThrCysThrHisTyrLeuTyrLeuThrLysGluAsp260265270LeuGluArgProAspPheGluGlyAlaLysTyrValPheThrProPro275280285AlaArgAlaLysLysAspHisAspValLeuTrpAsnAlaLeuArgAsn290295300GlyValPheGluThrValSerSerAspHisCysSerTrpLeuPheLys305310315320GlyHisLysAspArgGlyArgAsnAspPheArgAlaIleProAsnGly325330335AlaProGlyValGluGluArgLeuMetMetValTyrGlnGlyValAsn340345350GluGlyArgIleSerLeuThrGlnPheValGluLeuValAlaThrArg355360365ProAlaLysValPheGlyMetPheProGlnLysGlyThrIleAlaVal370375380GlySerAspAlaAspIleValLeuTrpAspProGluAlaGluMetVal385390395400IleGluGlnThrAlaMetHisAsnAlaMetAspTyrSerSerTyrGlu405410415GlyHisLysValLysGlyValProLysThrValLeuLeuArgGlyLys420425430ValIleValAspGluGlySerTyrValGlyGluProThrAspGlyLys435440445PheLeuLysArgArgLysTyrLysGln4504552102211487212PRT213Jannaschiasp.CCS14002MetSerLysValIleLysGlyGlyThrIleValThrAlaAspArgGln151015TrpGlnAlaAspValLeuIleGluGlyGluLysIleAlaGluIleGly202530GluAsnLeuArgGlyAspGluValIleAspAlaGluGlyAlaTyrVal354045IleProGlyGlyIleAspProHisThrHisLeuGluMetProPheMet505560GlyThrThrAlaAlaGluThrPheGluThrGlyThrPheAlaAlaAla65707580AlaGlyGlyThrThrMetLeuValAspPheCysLeuProGlyGluAsp859095GlySerLeuLeuSerAlaIleAspAlaTrpAspAlaLysSerLysAsp100105110GlnIleCysValAspIleSerTyrHisMetAlaIleThrGlyTrpSer115120125GluSerIlePheAsnGluMetAlaAspValValAsnValArgGlyIle130135140AsnThrPheLysHisPheMetAlaTyrLysGlyAlaLeuMetIleGlu145150155160AspAspGluMetPheSerSerPheLysArgCysAlaGluLeuGlyAla165170175LeuProLeuValHisAlaGluAsnGlyAspIleValGlnGluLeuGln180185190GlnLysTyrMetAlaMetGlyValThrGlyProGluGlyHisAlaTyr195200205SerArgProProGluValGluGlyGluAlaAlaAsnArgAlaIleMet210215220IleAlaAspAlaAlaGlyThrProLeuTyrIleValHisValSerCys225230235240GluGlnAlaHisGluAlaIleArgArgAlaArgGlnLysGlyMetArg245250255ValPheGlyGluProLeuIleGlnHisLeuThrLeuAspGluSerGlu260265270TyrPheAsnLysAspTrpGlnTyrAlaAlaArgArgValMetSerPro275280285ProPheArgAsnLysGluHisGlnAspGlyLeuTrpAlaGlyLeuAla290295300AlaGlySerLeuGlnValValAlaThrAspHisAlaAlaPheThrAsp305310315320GluGlnLysArgMetGlyValAspAsnPheGlyMetIleProAsnGly325330335ThrGlyGlyLeuGluGluArgMetAlaMetLeuTrpThrArgGlyVal340345350GluThrGlyArgLeuThrProGluGluPheValAlaValThrSerSer355360365AsnIleAlaLysIleLeuAsnIleTyrProMetLysGlyGlyIleAsn370375380ValGlyGlyAspAlaAspIleValValTrpAspProLysLeuGlyArg385390395400ThrIleThrThrAlaThrAlaLysSerIleLeuAspTyrAsnValPhe405410415GluGlyMetGluValSerAlaSerProArgTyrThrLeuSerArgGly420425430AspValValTrpAlaAlaGlyGlnAsnSerGlnProGlnProGlyArg435440445GlyLysPheValLysArgProProAlaAlaSerAlaSerGlnAlaLeu450455460SerLysTrpLysAlaLeuAsnThrProArgLysIleGluArgAspPro465470475480MetAsnIleProAlaGlyVal48521032111464212DNA213Jannaschiasp.CCS14003atgagcaaggtgatcaagggcggcacgattgtgaccgcagaccgtcaatggcaggcggac60gtgttgatcgagggcgaaaagattgccgagatcggggagaacctgcgcggggatgaggtg120atcgacgcggaaggcgcctatgtgatcccgggcggcatagacccccacacgcatcttgag180atgcccttcatgggcaccacggcggcggagacgttcgagacgggcacctttgcggcggca240gcgggcggcaccacgatgctggtcgatttctgccttccgggcgaggatggcagccttttg300tccgccatcgatgcctgggacgccaaatcgaaggatcagatctgcgttgatatctcctac360cacatggcgatcaccggctggtcggagagcattttcaatgagatggcggacgttgttaat420gtgcgcggcatcaacacatttaagcatttcatggcctataaaggcgcgctgatgatcgag480gatgacgagatgttttcgtcgttcaagcgctgcgctgaattgggcgcgctgccgctggtc540catgccgaaaacggcgatatcgtccaggagttgcaacagaaatacatggcgatgggcgtg600acggggccggagggtcacgcatattcccgtccgcctgaggtcgaaggggaagccgccaac660cgcgcgatcatgatcgccgacgccgctggcacgccgttgtatatcgtccatgtgtcgtgt720gagcaggcccatgaggccatccgccgtgcccgtcagaaggggatgcgggtcttcggggag780ccactgatccagcacctgacgctggatgagagcgagtatttcaacaaggattggcaatat840gcggcccgccgggtcatgtccccgccgtttcgcaacaaagagcatcaggacggtctttgg900gcaggtcttgccgctgggtccttgcaggttgtggccacggaccacgccgccttcaccgac960gagcaaaagcgcatgggcgtggacaatttcggcatgatccccaacggcaccggcgggctt1020gaggagcgcatggcaatgttgtggacgcgcggcgtggaaacgggccgcctgacgccggaa1080gaattcgttgcggtgacgtcatcgaacatcgccaagatcctcaacatttacccaatgaag1140ggtggcatcaacgtcggcggcgacgcggatatcgtggtctgggacccgaaactgggccgc1200acgatcacgacggcaacggcgaaatctatccttgattacaatgtgttcgagggaatggag1260gtgagcgcctccccccgctacaccctgtcgcgcggggatgtggtgtgggcggcggggcaa1320aacagccagccgcaaccgggccgtgggaaattcgtgaaacggcccccggcggcgagtgcg1380tcccaggcgctgagcaagtggaaggcgttgaacacgccgcgcaagatcgagcgcgacccg1440atgaacattccggcgggggtttga146權利要求1.一種海因酶基因，其特徵在於，所述海因酶基因來源於Jannaschiasp.CCS1。2.如權利要求1所述的海因酶基因，其特徵在於，所述基因編碼的胺基酸具有SEQIDNO2所示的胺基酸序列。3.如權利要求1或2所述的海因酶基因，其特徵在於，所述的基因具有SEQIDNO3所示的DNA序列。4.如權利要求1-3任一項所述的海因酶基因編碼的胺基酸。5.如權利要求4所述的胺基酸，其特徵在於，所述胺基酸具有SEQIDNO2所示的胺基酸序列。6.如權利要求5所述的胺基酸，其特徵在於，所述胺基酸由具有SEQIDNO3所示的DNA序列的海因酶基因所編碼。7.一種重組質粒，其特徵在於，所述重組質粒具有編碼SEQIDNO2所示的胺基酸序列的海因酶基因和一種載體DNA序列。8.如權利要求7所述的重組質粒，其特徵在於，所述海因酶基因具有SEQIDNO3所示的DNA序列。9.如權利要求7所述的重組質粒，其特徵在於，所述載體包括pET系統，pSU系統，pTrc系統，pMW系統，pKK系統，RSF1010。10.如權利要求9所述的重組質粒，其特徵在於，載體為pET28a。11.如權利要求1-3任一項所述的海因酶基因的應用，其特徵在於，用於製備海因酶。12.如權利要求11所述的應用，其特徵在於，包括以下步驟A、構建重組質粒；B、轉化宿主菌；C、發酵培養，獲得海因酶。13.如權利要求12所述的應用，其特徵在於，所述重組質粒具有編碼SEQIDNO2所示的胺基酸序列的海因酶基因和一種載體DNA序列。14.如權利要求13所述的重組質粒，其特徵在於，所述海因酶基因具有SEQIDNO3所示的DNA序列。15.如權利要求14所述的重組質粒，其特徵在於，所述載體包括pET系統，pSU系統，pTrc系統，pMW系統，pKK系統，RSF1010。16.如權利要求15所述的重組質粒，其特徵在於，載體為pET28a。17.如權利要求11或12所述的應用，其特徵在於，所述的海因酶具有SEQIDNO2所示的胺基酸序列。18.如權利要求1-3任一項所述的海因酶基因用於製備D-對羥基苯甘氨酸的應用。19.如權利要求18所述的應用，其特徵在於，包括以下步驟A、構建重組質粒；B、轉化宿主菌；C、發酵培養，製備海因酶發酵液；D、利用發酵液將D，L-對羥基苯海因底物轉化為D-對羥基苯甘氨酸。20.如權利要求19所述的應用，其特徵在於，所述重組質粒具有編碼SEQIDNO2所示的胺基酸序列的海因酶基因和一種載體DNA序列。21.如權利要求20所述的重組質粒，其特徵在於，所述海因酶基因具有SEQIDNO3所示的DNA序列。22.如權利要求21所述的重組質粒，其特徵在於，所述載體包括pET系統，pSU系統，pTrc系統，pMW系統，pKK系統，RSF1010。23.如權利要求22所述的重組質粒，其特徵在於，載體為pET28a。24.如權利要求18或19所述的應用，其特徵在於，所述的海因酶具有SEQIDNO2所示的胺基酸序列。全文摘要本發明提供了一種海因酶基因，以及該基因編碼的胺基酸、包含該基因的重組質粒和該基因的應用。本發明提供的海因酶基因所編碼的胺基酸序列不同於目前已知來源的海因酶，所述海因酶基因的表達產物在以對羥基苯海因作為底物時表現出較高的酶活，其比活明顯高於目前工業生產中常用的來源於Agrobacteriumsp.KNK712的海因酶。文檔編號C12N9/78GK101058818SQ200710039229公開日2007年10月24日申請日期2007年4月6日優先權日2007年4月6日發明者姜衛紅,蔡淵恆,姜世民,陳軍,楊蘊劉,楊晟申請人:中國科學院上海生命科學研究院