一種基因重組鮭魚降鈣素的製備工藝的製作方法
2023-05-30 14:14:26 1
專利名稱：一種基因重組鮭魚降鈣素的製備工藝的製作方法
技術領域：
本發明屬醫藥技術領域，具體涉及一種新的基因重組鮭魚降鈣素(簡記為sCT)製備工藝。
目前，市場上的商品均為化學合成，但由於對硬體設備、合成試劑、生產環境要求苛刻，使得產品成本昂貴、規模化生產的固定投入巨大，且易汙染環境。美國UNIGENE公司(Bio/Technology，1993，1164-70)等通過基因工程生產sCT是先由大腸桿菌表達得到羧基端(C末端)為甘氨酸(簡記為Gly)的sCT前體，再經α-醯胺化酶(α-AE)的作用，加工為成熟重組sCT。由於所得的C末端為Gly的由33個胺基酸組成的sCT前體，必須用α-AE才能修飾C末端產生成熟sCT。問題是α-AE目前尚未商品化，通過生物提取或基因工程得到α-AE T藝複雜，不僅造成sCT生產周期延長，又提高了成本。也有研究通過使用具有乙醯化功能的真核細胞(如鼠垂體細胞AtT-20)來實現C末端醯胺化的(Protein Expression and Purification，1996，7347-354)，但是由於產率極低，故至今該醯胺化線路只能停留於實驗室階段。竇鴻等利用大腸桿菌BL(21)為宿主，首先表達、純化得到33位為丙氨酸(簡記為Ala)的sCT前體再利用羧基肽酶進行C端醯胺化，加工出成熟sCT(Productionof Recombinant Salmon Calcitonin by Amidation of Precursor Peptide Using EnzymaticTransacylation and Photolysis in Vitro.Dou Hong，Zhuang Mingqiang，Li Min，ChenChangqing，Mao Jifang.Biochem Biophys Res Commun.2000；267(1)362-367)，但其一，BL(21)宿主表達目的融合蛋白降解程度大於40％；其二，前體C術端為Ala，造成醯胺化產率下降；其三，羧基肽酶中帶入的蛋白酶A可降解sCT前體和醯胺化產物。以上種種原因造成生產投入較大、產率較低，成本高。
本發明提出的製備基因重組鮭魚降鈣素工藝，具體步驟如下(1)構建含sCT前體cDNA融合表達載體pGEX-sCT前體的工程菌；(2)sCT工程菌的發酵；(3)分離、純化sCT前體；(4)sCT前體的醯胺化及復性成為成熟sCT；(5)sCT活性的測定；其中，在構建sCT前體基因時，首先按其胺基酸序列，用大腸桿菌的偏愛密碼編碼成若干DNA片段，並化學合成DNA片段，再拼接成sCT前體的全長cDNA(見圖3所示)，所拼接成的全長cDNA N端含蛋氨酸(Met)密碼子，以便通過CNBr裂解產生與天然sCT完全相同的N端胺基酸序列，C末端為亮氨酸(Leu)密碼子，以便使由大腸桿菌表達出的產物，可用羧基肽酶Y(CPD-Y)進行C末端醯胺化。
本發明中，sCT cDNA構建時退火、連接後的DNA片段直接與表達載體進行連接，轉化大腸桿菌後，抽提質粒，雙酶切，用瓊脂糖凝膠電泳鑑定陽性克隆，再測序證實，省去利用克隆載體構建sCT cDNA中間過程。
本發明中，構建的融合表達載體轉化由Ecoli.B衍生的大腸桿菌宿主(蛋白酶缺陷型宿主)，以避免表達的目的蛋白降解，提高產量。
本發明中，sCT的前體採用羧基肽酶-Y(CPD-Y)進行醯胺化時，同時加入鄰硝基苯甘氨醯胺(O-PNGA)，使得sCT前體的第33位Leu被O-PNGA取代，成為光敏感的sCT-O-PNGA，該產物經光解得線形sCT，並可通過空氣氧化摺疊，重建二硫鍵，得到具有生物活性sCT。
此舉可提高醯胺化效率，降低醯胺化成本。
本發明中，在利用CPD-Y進行C末端醯胺化時，反應體系中加入DMSO(二甲亞碸)、Papstatin A，以增加醯胺化效率、抑制CPD-Y帶入的非特異水解酶活性，達到提高產率降低成本的目的。
本發明利用基因工程生產重組sCT，其步驟如
圖1所示。下面進一步描述各步驟
1.合成sCT前體DNA片段及構建含sCT前體cDNA的融合表達載體的工程菌為提高sCT在大腸桿菌中的表達量，按照sCT前體的胺基酸序列，用大腸桿菌的偏愛密碼，編碼成若干DNA片段，使位於全長cDNA3』端為Leu的密碼子，以便使由大腸桿菌表達出的產物，可用CPD-Y進行C末端醯胺化。DNA片段採用亞磷酸二酯法合成。將合成的DNA片段按常規用《BASICMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY》方法拼接起來。首先將片段磷酸化，再加熱至96℃後，退火到室溫，拼接成全長sCT前體cDNA，然後通過連接酶的作用與經BamH1、Xho1雙酶切的pGEX-4T-3表達載體相連接，成為pGEX-sCT前體表達載體，轉化大腸桿菌，獲得工程菌。將其質粒DNA經雙酶切和DNA測序鑑定插入序列後，進行融合蛋白誘導表達的鑑定。
2.sCT工程菌的高密度發酵將工程菌接種於LB培養基，37℃培養過夜，作為一級種子，次日將一級種子接種於含2％甘油的2-YT培養基中，37℃振搖培養，用作二級種子(詳見Lee SY，TIBTECH，1996，1498-105)，然後將二級種子接種於發酵培養基的發酵罐中進行補料分批培養。整個發酵過程pH控制在6.9左右，溶解氧在30％左右，攪拌速度逐漸增大，最高轉速每分鐘1200轉(詳見M.Yabuta，Y.Suzuki，K.Ohsuye. Appl Microbiol Biotechnol.1995，42703-708)。
3.分離純化sCT前體按常規採用親和層析從高密度發酵獲得的菌體中純化得到穀胱甘肽巰基轉移酶(GST)-sCT前體的融合蛋白，經酶或化學裂解，再經離子交換層析、梯度反相凝膠脫鹽，獲得高純度的sCT的前體。
本步驟中，對融合蛋白可進行S-磺酸化，以提高溴化氰的裂解效率。使產生的S-磺酸化sCT(SO3-sCT)具有高穩定性、高比活性。
4.sCT前體經體外醯胺化，復性成為成熟sCT將含1mM EDTA、200mM O-PNGA的溶液用5N NaOH調pH值到6.0，加入sCT前體、CPD-Y，DMSO、Papstatin A於30℃保溫，反應完成後用RP-C18脫鹽和純化，冷凍乾燥，得到光敏感的中間體sCT-O-PNGA。將產物溶解於60mMNaHSO3甲醇-水溶液中，充入氬氣5分鐘，開始光解可得到線形sCT，反應完成後用RP-C18脫鹽，再用高效液相(HPLC)純化。純化得到的線形肽，經空氣氧化摺疊，重建二硫鍵[以二甲基亞碸，半胱氨酸，K3(FeCN6)或穀胱甘肽為介質的系統]，得到具有生物活性的sCT。
5.測定活性按《中國藥典》方法，將體重為40-50g同一來源、同一品系、同一性別的健康大白鼠，隨機分成5組(對照組、生產樣品高濃度組、生產樣品低濃度組、標準品高濃度組、標準品低濃度組)，每組10隻，編號後，分別按順序，尾靜脈注射0.4ml相應濃度的sCT標準品、生產樣品及空白稀釋液。給藥後準確1小時，分別取血樣，用鄰甲酚酞絡合劑比色法測定血鈣。實驗結果按《中國藥典》附錄檢定統計法中量反應平行線計算，隨機設計法計算效價以及實驗誤差。並進行統計學可靠性檢驗。
本發明同以往的基因工程製備sCT工藝相比優點在於工藝簡單、成本低廉、生產周期短。
基因重組sCT的製備一.材料與方法1.限制性內切酶BamH1、Xho1購自Biolab，T4連接酶、T4激酶購自Promaga；凝血酶、羧基肽酶購自Sigma。
2.菌種與質粒pGEX-4T-3購自Pharmacia Biotechs。E.coli WA873購自E.coli Genetic Stock Center，U.S.A。
3.瓊脂糖、生物瓊脂購自Sigma，酵母粉、蛋白腖購自Oxid；質粒抽提試劑盒購自上海華舜生物工程公司；Glutathione Sepharose 4B、SP-Sepharose Fast Flowresin、G-25購自Pharmacia Biotech，RP-C18購自Merk。
4.質粒DNA的製備及片段的回收按華舜生物工程公司試劑盒操作手冊。其它常規操作按Molecular Cloning ；發酵產物的鑑定用SDS-PAGE法，染色膠用BioRad DENSITOMETER掃描；融合蛋白的純化按GlutathioneSepharose 4B操作手冊進行。
5.高密度發酵參照[M.Yabuta，Y.Suzuki，K.Ohsuye.Appl MicrobiolBiotechnol.1995，42703-708]。
6.sCT的復性參照David Andreu，Fernando Alvericio，Nuria A.SoleMark C.Munson，Mare Ferrer；and George Barany.(1994)in Methods inMolecular Biology.Vol.35Peptide synthesis protocols(PenningtonM.W.and Dunn B.M.，Eds.)，pp91-169，Humana Press Inc.，Totowa，NJ。
7.活性鑑定按《中國藥典》sCT的生物測定法測定注射sCT後大鼠血清鈣下降程度。
二.具體操作1.合成sCT前體DNA片段及構建含sCT前體cDNA的融合表達載體的工程菌將sCT前體cDNA分為F′1-F′8，8個DNA片段採用亞磷酸二酯法由上海Sangon合成，序列詳見圖3。在連接反應管中加入上述8個DNA片段各20pmol，10倍濃度的連接酶緩衝液3μl，T4激酶10單位，再加水19μl，使Tris-HCl、MgCl2、二硫蘇糖醇的終濃度分別為50mM、10mM、10mM，置37℃ 30分鐘，再96℃ 2分鐘滅活T4激酶，經30分鐘退火至20℃左右。取10μl退火片段溶液，加入6μl BamH1、Xho1雙酶切的pGEX-4T-3載體溶液、連接酶5單位，再加連接酶緩衝液2μl，使Tris-HCl、MgCl2、二硫蘇糖醇的終濃度分別為50mM、10mM、10mM，在14℃連接過夜。吸取該連接載體溶液10μl，加200μl WA837大腸桿菌溶液(約含106-107個感受態細胞)，冰浴30分鐘後，42℃ 90秒鐘，加入800μl LB培養基，37℃振搖培養45分鐘後塗板。其插入序列通過雙酶切後由1％瓊脂糖凝膠鑑定大小，再由DNA測序證實。拼接成的全長cDNA為120bp，如圖3所示，其中包括5』BamH1位點(I)，3』Xho1位點(II)，兩個終止密碼(III)，在GST與sCT編碼序列之間加入ATG構成CNBr裂解位點(IV)。為便於體外醯胺化修飾，在sCTC術端加Leu密碼子CTG(V)。
2.高密度發酵3μl OD600＝0.7的工程菌接種於3ml LB培養基37℃培養過夜作為一級種子，次日將3ml一級種子接種於200ml含2％甘油的2-YT培養基中振搖培養至OD600＝0.7用作二級種子，然後按常規將二級種子接種於含3L發酵培養基的發酵罐中進行補料分批培養。整個發酵過程pH控制在6.9左右並不斷攪拌，為維持溶解氧在30％左右，需要不斷增加攪拌速度，轉數從起始每分鐘50轉，逐漸加大，在7小時左右達到最高速，每分鐘1200轉，然後供應純氧，以維持大腸桿菌的需氧量。分批培養5小時後菌體密度達到50D600隨後進入10小時的補料培養階段，菌體生長近10倍。37℃培養12小時，加入0.1mM的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導目的蛋白表達，隨著目的蛋白表達量增加到一定程度，菌體的比生長速率明顯減小，生長趨勢開始減緩故終止發酵。發酵菌體終濃度53 OD600、重量150克/升，經SDS-PAGE鑑定，最終融合蛋白表達量佔可溶菌體蛋白30％。誘導後融合蛋白表達量的變化，通過SDS-凝膠電泳圖譜(圖4)可以明顯地看出，加入IPTG後目的蛋白的表達量隨誘導時間的增加而增加。圖中泳道1為標準蛋白，泳道2為IPTG誘導前菌體蛋白電泳，3為IPTG誘導1小時菌體蛋白電泳，4為IPTG誘導1.5小時菌體蛋白電泳，4為IPTG誘導2小時菌體蛋白電泳，6為IPTG誘導2.5小時菌體蛋白電泳。分子量30kDa的條帶為目的蛋白，即GST-sCT前體融合蛋白3.純化sCT前體3.1.GST-sCT前體融合蛋白的純化將100g大腸桿菌菌體置於1000ml pH7.2的磷酸緩衝液中，冰浴中超聲破碎，加入20％Triton-X100終濃度1％，靜置30分鐘，15,000g離心25分鐘，取上清液與40ml Glutathione Sepharose 4B混合，溫和振搖30分鐘，500g離心5分鐘，將沉澱裝柱，磷酸緩衝液洗脫至OD280＜0.02，再用3倍於柱體積緩的衝液(10mM glutathione，50mMTris-HCl，pH8.0)洗脫，洗脫樣品用SDS-凝膠電泳分析結果見圖5，可溶性的菌體總蛋白經過親和樹脂純化，獲得的目的融合蛋白GST-sCT前體純度大於80％。
3.2.S-磺酸化及溴化氰裂解用55％飽和(NH4)2SO4沉澱GST-sCT前體融合蛋白，15,000g離心15分鐘，加水調整蛋白濃度至10mg/ml。加入1/10體積1M Tris-HCl調至pH8.0，按52mg Na2SO3/ml融合蛋白和25mg Na2S4O4/ml融合蛋白的比例分別加入Na2SO3和Na2S4O4，避光反應12小時。經G-25柱(6×60cm)脫鹽(預先用10mMTris-HCl，pH8.0平衡)。收集洗脫液的流穿峰，加尿素至終濃度8M，加濃HCl至終濃度50mM，加入溴化氰避光反應4小時，得重組sCT前體等裂解產物(圖5)。
3.3.裂解產物純化將上述裂解反應液加4倍體積水，經SP-Sepharose Fast Flow層析柱，用1號液(2M尿素，10mMHCl)洗脫至OD280＜0.02，換2號液(2M尿素，10mMHCl，100mM NaCl)，用分光光度計，以220nm檢測，收集該吸收峰的洗脫液。收集液經RP-C18柱，先用3號液(5％乙腈95％水0.1％三氟乙酸)洗脫至OD220＜0.02，再用38％-49％乙腈梯度洗脫，收集樣品，冰凍乾燥得到重組sCT前體。HPLC分析產物，條件是流動相丙為水0.1％三氟乙酸，流動相丁為乙腈0.1％三氟乙酸，流速為每分鐘1ml，線性梯度為40分鐘丁流動相由0到80％，所得重組sCT前體產物純度大於95％。用電噴霧質譜鑑定sCT前體，見圖6，圖譜結果按3×(m/z)-3計算，表明sCT前體的分子量為3708，與理論計算完全一致。
4.體外醯胺化將含1mM EDTA、200mM O-PNGA的溶液用5N NaOH調pH值到6.0，加入sCT前體至終濃度1mM、羧基肽酶60μg、DMSO至終濃度4％、PAPSTATIN A50μM，置30℃水浴中120分鐘後用RP-C18脫鹽，冷凍乾燥，得到光敏感中間體sCT-O-PNGA，圖譜結果按3×(m/z)-3計算(圖6)，與理論值相符。將其溶解於60mM NaHSO3甲醇-水(甲醇∶水＝1∶1)溶液中，充入氬氣後進行光解，可得到線形sCT，反應完成後，RP-C18脫鹽，冷凍乾燥，用HPLC進行純化，條件同上。得到的線形sCT純度大於95％。
5.復性將sCT 1mg溶於1ml pH為8.0含0.1M Tris-HCl和5mM半胱氨酸的溶液中，置37℃ 5分鐘。HPLC純化產物，條件同上。得到的sCT純度大於99％。用電噴霧質譜鑑定sCT見圖7，圖譜表明sCT分子量為3432，與理論計算值完全一致。
6.活性測定按《中國藥典》方法。將體重40-50g同一來源、同一品系、同一性別的健康大白鼠，隨機分成5組(對照組、人降鈣素類似物樣品高濃度組、人降鈣素類似物樣品低濃度組、標準品高濃度組、標準品低濃度組)，每組10隻，編號後，分別按順序，尾靜脈注射1×10-2單位和5×10-2單位兩種濃度的降鈣素標準品和人降鈣素類似物樣品0.4ml/只，對照組注射空白稀釋液0.4ml/只。給藥後準確1小時，分別取血樣，用鄰甲酚酞絡合劑比色法測定血鈣。實驗結果按《中國藥典》附錄檢定統計法中量反應平行線計算，隨機設計法計算效價以及實驗誤差。並進行統計學可靠性檢驗。結果見表2。
表2.測定sCT的活性sCT樣品標準品劑量 0.01單位 0.05單位 0.01單位 0.05單位7.29 5.84 7.55 6.586.71 5.84 7.61 5.556.23 6.57 7.56 6.107.07 6.23 6.81 5.267.15 5.84 7.15 5.59反應值y7.39 5.63 7.39 5.608.21 6.29 7.60 5.898.00 5.89 6.70 5.807.45 5.81 6.70 5.657.30 6.00 7.40 6.00結論回歸非常顯著、偏離平行不顯著，可靠性檢驗通過，實驗結果成立。FL％＝33％。效價4100iu/mg。95％可信限率6232-2747。
權利要求
1.一種基因重組鮭魚降鈣素的製備工藝，包括(1)構建含sCT前體cDNA融合表達載體pGEX-sCT前體的工程菌；(2)sCT工程菌的發酵；(3)分離、純化sCT前體；(4)sCT前體的醯胺化及復性成為成熟sCT；(5)sCT活性的測定；其特徵在於構建sCT前體基因時，首先按其胺基酸序列，用大腸桿菌的偏愛密碼編碼成若干DNA片段，並化學合成DNA片段，再拼接成sCT前體的全長cDNA，所拼接成的全長cDNA N端含蛋氨酸密碼子，以便通過CNBr裂解產生與天然sCT完全相同的N端胺基酸序列，C末端為亮氨酸密碼子，以便使由大腸桿菌表達出的產物，可用羧基肽酶Y進行C末端醯胺化。
2.根據權利要求1所述的製備工藝，其特徵在於構建的融合表達載體轉化由Ecoli.B衍生的大腸桿菌宿主，以避免表達的目的蛋白降解。
3.根據權利要求1所述的製備工藝，其特徵在於sCT的前體採用羧基肽酶-Y進行醯胺化時，同時加入鄰硝基苯甘氨醯胺，使得sCT前體的第33位Leu被O-PNGA取代，成為光敏感的sCT-O-PNGA，該產物經光解得線形sCT，並可通過空氣氧化摺疊，重建二硫鍵，得到具有生物活性sCT。
4.根據權利要求3所述的製備工藝，其特徵在於在利用CPD-Y進行C末端醯胺化時，反應體系中加入二甲亞碸、Papstatin A，以增加醯胺化效率、抑制CPD-Y帶入的非特異水解酶活性。
5.根據權利要求3所述的製備工藝，其特徵在對融合蛋白進行S-磺酸化，以提高溴化氰的裂解效率。
全文摘要
本發明涉及一種基因重組鮭魚降鈣素(sCT)的製備工藝，是對原工藝作了許多重要改進，例如，使大腸桿菌基因表達的sCT前體C末端為亮氨酸，以便能使用CPD－Y進行C末端醯胺化；構建的融合表達載體轉化由Ecoli.B衍生的大腸桿菌宿主，以避免表達的目的蛋白降解，提高融合蛋白產量等等。本發明方法工藝簡單、成本低廉、生產周期短，且不會造成環境汙染。
文檔編號C12N15/16GK1441058SQ0211105
公開日2003年9月10日 申請日期2002年3月15日 優先權日2002年3月15日
發明者竇鴻, 趙東, 朱彤 申請人:竇鴻, 趙東, 朱彤