一種使用高濃度甘油的pcr方法及其反應液和應用的製作方法
2023-05-30 12:10:46
專利名稱：一種使用高濃度甘油的pcr方法及其反應液和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學技術，特別是涉及一種聚合酶鏈式反應的方法及其反應液和應用。
背景技術：
已有不少文獻報導甘油能降低高G+C區域的二級結構，能促進長距離PCR和提高標準PCR方法的反應專一性。此外，有報導在多重PCR(O.Henegariu等，Biotechniques，1997，23504)和等位專一PCR(R.S.Cha等，PCR Methods and Applications，1992，214)反應液中添加甘油。上述研究有二個共同特點，第一，甘油濃度較低通常為5-10％(V/V，下文中未指明的均指體積百分比)，文獻報導的最高濃度為20％(Y.H.Liu等，Trends in Gentics，1993和S.Vilcek，Journal Virological Methods，1993，41245) 第二，添加甘油後變性溫度包括首次和循環變性均仍採用常規的94或95℃。尚未有文獻或專利將甘油濃度擴展至20-45％，並且將含5-45％甘油的PCR反應的首次變性溫度提高到大於95℃至98℃，循環變性溫度降低到小於94℃至60℃的報導。
在一管法RT-PC方面，至今僅有一篇文獻(T.W.Myers等，PCR Strategies，p.58-68，Ed.M.A.Innis等，1995)在反應液中添加3％甘油，加上原來由DNA聚合酶和反轉錄酶試劑帶進的2％甘油，使PCR能在含5％甘油反應液中進行。未有將一管法RT-PCR反應液的甘油濃度擴展至5-25％的報導。
發明內容
所要解決的技術問題本發明所要解決的技術問題是提供一種含高濃度甘油的聚合酶鏈式反應的方法及其反應液和應用，以突破現有PCR方法中甘油濃度的常規，克服經典PCR反應容易出現非專一性擴增產物的缺陷，減少了模板順序突變而導致的假陰性。
發明構思應用高濃度甘油的思路是在文獻檢索和對PCR反應機制及甘油作用進行分析的基礎上發展形成的。
1.現有的PCR技術觀點通常認為當擴增產物區域含有高比例G+C時，添加甘油或其他變性劑能降低核酸的二級結構，促進目標產物的擴增。我們認為，除上述機制外，甘油的關鍵作用是它能促進半擴增鏈和最初擴增產物的形成，從而對目標擴增的形成和擴增的專一性起重要作用。根據擴增產物的形成機制，從基因組DNA形成半擴增鏈和從半擴增鏈形成最初的擴增產物對PCR擴增產物在數量上的貢獻可以忽略。但是，半擴增鏈和最初擴增產物的形成對完成目標產物擴增的關鍵性作用卻不容忽略。目前各種教科書和專著在描述PCR原理的圖解中，都將基因組變性後的大分子單鏈DNA標示為一條直線型分子，按照這種模式圖解，引物與目標順序和非目標順序的結合併得到延伸的機會在空間效應上是等同的。根據此模式，如果引物有良好的嚴謹性，那麼在嚴謹的退火溫度下出現非專一產物的可能性應很小，只出現非專一產物而無目標產物幾乎不可能。對於一個20鹼基長的引物，在目標順序以外出現與之完全匹配的順序的機會約一萬億分之一(1/420)，此數值比人基因組的總鹼基數高几個數量級。另外，一段核酸順序必須分別具有與正反引物匹配的位點才可能能被擴增。概率計算表明，在基因組DNA中幾乎不可能存在一段目標順序以外的幾百至幾千鹼基長的核酸片段，其上下遊順序會分別與正反引物完全匹配。但事實上，在較低退火溫度下非專一產物形成相當普遍，即使在引物的最高允許退火溫度也常會有非專一產物出現。這是因為引物除了能與完全匹配的目標順序結合外，也能與有若干錯配甚至較嚴重錯配的非目標順序結合而引發擴增。但是，無論退火溫度高還是低，非目標順序與引物的結合強度總是要比目標順序與引物的結合強度低，按上述線性分子模式就不能解釋為何會出現只有非專一產物而無目標產物形成的現象。空間位阻可能為這種現象提供一種可能的解釋。變性後大分子單鏈DNA需要一定的溫度和時間才能完成自身的完全退火，完成退火之前單鏈大分子DNA不是呈線性或僅有一些小髮夾，而是有非常複雜的空間結構。如果目標順序處在具有複雜結構大分子的內部，則雖然它與引物完全匹配但也可能因位阻現象而不能完成目標半擴增鏈和最初的目標擴增產物的形成。反之，處在單鏈模板DNA大分子表面的不存在位阻現象的非目標順序，雖然它與引物有不同程度的錯配，但只要在試驗條件下能完成退火就能形成半擴增鏈和最初的擴增產物。最初的非專一擴增產物的順序已與引物完全匹配就很容易繼續完成以後步驟的擴增。所以，非目標順序在空間位置上比目標順序可能佔有先機是只形成非擴增產物，以及形成目標擴增產物同時出現非專一條帶的主要原因之一。我們曾用不切割目標順序的識別順序為4個鹼基的幾種限制性內切酶來切割基因組DNA，以被切割成小分子的基因組DNA作模板能得到目標擴增產物，在同樣反應條件下直接用基因組DNA作模板，卻只得到非專一擴增產物而無目標擴增產物，間接證明了我們的推斷。在高的退火溫度下，模板單鏈DNA的空間結構比較鬆散，目標順序有更多的機會暴露在分子的表面，使目標順序和引物物順序完全匹配的優勢得到發揮。同樣，我們設想高濃度的甘油可以使單鏈模板DNA的空間結構變得鬆散，從而促進目標半擴增鏈和最初的目標擴增產物的形成。由於至今尚未能建立一項技術來預測大分子單鏈DNA在不同溫度下的空間結構，而引物軟體雖能自動選擇出具有高嚴謹性的引物，卻不能預測與引物匹配的模板順序是否會受到位阻的影響。所以，克服位阻的簡單方法是在比引物最高允許退火溫度略低的溫度下退火，因為溫度越高單鏈DNA分子的結構越鬆散。同樣使用比臨界允許甘油濃度稍低的甘油濃度，會對促進目標擴增產物形成提高PCR專一性有普遍的意義。
2.含50％甘油的緩衝液在-20℃或更低溫度下不結冰，商品酶製劑包括TaqDNA聚合酶通常加50％甘油避免反覆使用時因凍融而造成酶的失活。甘油也能提高TaqDNA聚合酶的熱穩定性。
Landre(PCR Strategies，p.1-16，Ed.M.A.Innis等，1995)指出Taq酶在97.5℃時的半衰期為9-11分鐘，添加1，10和20％的甘油能使半衰期分別提高至13，33和60分鐘以上。可以推測，高於20％的甘油會使Taq酶仍具有類似的、同樣的或更好的熱穩定性。所以在眾多能降低DNA二級結構、促進PCR擴增的變性劑中我們首選甘油。標準PCR的變性溫度為94-95℃，這一溫度下並非所有基因組DNA都能得到充分的完全的變性，但如使用更高的變性溫度可能對酶的穩定性帶來消極影響。使用高濃度甘油使酶在高溫下的熱失活顯著降低，所以可以在95-98℃進行首次變性使所有模板DNA得到充分的變性。
3.Landre等的研究表明10％甘油使Lamda噬菌體DNA的解鏈溫度降低3℃，10％甘油和5％甲醯胺聯用使Lamda噬菌體DNA的解鏈溫度降低6.2℃，使其他4種基因組DNA的解鏈溫度降低4.5-6.5℃。顯然，擴增產物的解鏈溫度也因導入高濃度甘油而顯著降低(見實施例)。所以根據擴增產物的解鏈溫度和甘油的加量，將循環變性溫度降至93-60℃是可行的選擇。
4.同樣，高濃度甘油會使引物與目標順序的最高允許退火溫度降低(見實施例)，使用較低的退火溫度會部分抵銷甘油降低核酸二級結構的作用。為了充分發揮高濃度甘油的有益作用，可設計解鏈溫度高的引物，長度為30-50鹼基的引物或在原有引物的5』端延伸若干鹼基，使得引物能在原有的退火溫度下與目標順序結合。
5.有研究表明，10％和20％甘油會使TaqDNA聚合酶在60-74℃時活力比對照降低約20-25％左右。更高濃度的甘油有可能使活力繼續下降，由於TaqDNA聚合酶在最適條件下每秒鐘能合成70個以上的核苷酸，PCR產物通常長度為幾百鹼基而延伸時間通常為1分鐘，所以即使酶的活力有所下降仍能在原來的或稍長的的延伸時間內完成擴增。
技術方案本發明的一種含高濃度甘油的聚合酶鏈式反應的反應液，其組分包括dNTPs、DNA聚合酶、甘油和水，其中甘油含量為5-45％(V/V)，優選為20-35％(V/V)。
本發明同時提供應用上述的反應液的聚合酶鏈式反應方法，依次包括如下步驟(1)模板變性；(2)引物退火；(3)DNA聚合酶催化下合成互補鏈；(4)按步驟(1)-(3)循環進行合成反應；其中，當反應液含5-20％(V/V)甘油時，PCR的首次變性溫度範圍為95℃至97℃；反應液含20-45％(V/V)甘油時首次變性溫度範圍為95℃至98℃。
上述的聚合酶鏈式反應方法，它的一個優選方案為應用5-20％(V/V)甘油時，除反應啟動時的首次變性外，在其餘各PCR循環中的變性溫度為94℃至60℃；應用20-45％(V/V)甘油時，則其餘各PCR循環中的變性溫度為93℃至60℃。
上述的聚合酶鏈式反應方法，它的另一個優選方案為應用5-20％(V/V)甘油時，從第三個循環開始，最低變性溫度的下限比擴增產物的解鏈溫度低1-4℃；應用20-45％(V/V)甘油時，從第三個循環開始，最低變性溫度比擴增產物的解鏈溫度低1-8℃。
本發明同時提供上述的反應液在減少PCR檢測結果非專一性擴增產物中的應用方法，即通過應用高濃度的甘油使模板與引物專一性的識別獲得提高，相應地減少非專一性識別。
本發明也提供上述的反應液在減少PCR檢測結果假陰性中的應用方法，即通過提高甘油濃度使模板DNA鏈變性充分以減少假陰性。
本發明提供上述的聚合酶鏈式反應方法在檢測變異DNA序列中的應用，即通過降低循環中的變性溫度，使有錯配鹼基的變異的目標DNA序列與引物結合的機會增加，減少了因模板順序突變而導致的假陰性。
本發明同時提供應用上述反應液的反轉錄聚合酶鏈式反應方法，依次包括如下步驟(1)反轉錄酶催化下以RNA為模板合成DNA鏈；(2)DNA鏈模板變性；(3)引物退火；(4)DNA聚合酶催化下合成互補鏈；(5)按步驟(2)-(4)循環進行合成反應；
其中，當反應液含5-20％(V/V)甘油時PCR的首次變性溫度範圍為95℃至97℃；反應液含20-45％(V/V)甘油時首次變性溫度範圍為95℃至98℃。
上述的反轉錄聚合酶鏈式反應方法的一個優選方案為，在應用5-20％(V/V)甘油時PCR循環中變性溫度為94℃至60℃；應用20-45％(V/V)甘油時PCR循環中變性溫度為93℃至60℃。
有益效果1.高濃度甘油使呈單鏈的模板DNA分子的空間結構比同樣溫度下不加甘油時鬆散，使目標順序最初擴增時受到空間位阻的可能性減少，可充分法揮引物與目標順序完全匹配的優勢，專一地得到目標擴增產物。
2.高濃度甘油增強TaqDNA聚合酶等對高溫度的耐熱性，可提高首次變性溫度，使所有模板得到充分變性。
3.高濃度甘油使擴增產物變性溫度降低，從而可降低後續循環的變性溫度。
4.高濃度甘油使模板空間結構鬆散，引物與目標順序結合的競爭力增強，能在較低溫度下仍然專一地擴增目標產物。有錯配鹼基的目標順序變種與引物專一結合、得到專一擴增的機會增加，減少了模板順序突變而導致的假陰性。
5.為能在低溫保存含高濃度甘油的全預混試劑盒的應用開創了條件。
具體實施例方式
實施例1.
從人甘油醛-3-磷酸-脫氫酶基因(基因庫編號XM006959)設計一對引物，其順序和特性示於表1和2。
表1.實施例1引物順序
表2.實施例1引物特性
PCR採用ClonTech公司的Advantage-2試劑盒，但PCR反應液添加不同濃度甘油。每管反應體積5微升，引物濃度0.5μM。每100微升反應液加cDNA10微升，cDNA由人組織總RNA用ClonTech公司cDNA合成試劑盒，以試劑盒提供的Oligo(dT)作反轉錄引物合成。PCR首次變性97℃1分鐘。試驗退火和延伸溫度條件時，循環變性溫度88℃持續10秒，試驗退火和延伸溫度範圍為66-76℃持續10秒；試驗變性溫度條件時，退火溫度64℃持續10秒，變性溫度試驗範圍80-88℃持續10秒。循環數32。試驗結果示於表3。
表3.實施例1試驗結果
表3結果說明在首次變性97℃，循環變性88℃和退火延伸溫度64℃的條件下，添加0-30％的甘油都能得到目標擴增產物。循環的最低允許變性溫度從88℃降低至80℃，循環的最高允許退火溫度從76℃降低至64℃。由於設計的正反引物長度分別為30和34鹼基解鏈溫度均超過87℃，即使反應液含有30％甘油仍能在64℃下退火完成擴增。
實施例2.
實施例2為一管法RT-PCR，引物順序為GCCCAGCGGGTGACGATGCC，它與人肌動球蛋白基因(基因庫編號BC016045)的134-153及314-299位順序分別高度互補，能得到長181礆基的擴增產物。正反引物之間跨越一個內涵子RT-PCR的擴增產物能與基因組DNA擴增產物區別。實施例2採用ClonTech公司的TITIUM一管法RT-PCR試劑盒提供的緩衝液，反轉錄酶和TaqDNA聚合酶混合液等，但只使用部分的或不使用試劑盒提供的熱穩定劑，不使用試劑盒提供的GC-Melting試劑。每管反應體積5微升，每100微升反應液加0.5微克人組織總RNA作為原始模板，引物濃度為1μM。試驗的甘油濃度範圍為0-30％。在35-55℃反轉錄60分鐘然後立即轉入PCR程序。首次變性96℃2分鐘，循環變性92℃10秒鐘，退火50℃1分鐘，延伸70℃2分鐘，循環數30。結果見表4。
表4.實施例2試驗結果
#不使用試劑盒提供的熱穩定劑，其他均使用試劑盒規定量50％的熱穩定劑。
試驗結果表明應用10或20％甘油反轉錄溫度35-55℃均能專一地得到擴增產物而無非專一產物幹擾。相反如不加甘油無論在哪一溫度反轉錄在50℃下退火均有大量非專一產物。
實施例3.
實施例3以人基因組DNA為原始模板比較PCR反應液中添加不同濃度甘油對擴增人Beta腎臟腺素受體基因(3451鹼基，基因庫編號M15169)的作用。引物選自文獻(H.G.Xie等，Clin.Pharmacol.Ther，2000，67670-675)，擴增產物長度252鹼基，引物對順序見表5。
表5.實施例3引物順序
擴增用試劑和方法與實施例1基本相同。不同處為每100微升反應液加10微升商品人基因組DNA(Roche公司，0.2微克/微升)。循環變性92℃10秒，退火45-65℃1分鐘，延伸65℃2分鐘，循環數32。試驗結果示於表6。
表6.實施例3試驗結果
-表示無擴增產物+多少代表目標擴增產物強度***表示有非專一產物但不成條帶×阿拉伯數字為非專一條帶數量結果表明不添加甘油時，僅當退火溫度控制在63-65℃之間才得到擴增產物，擴增產物微弱而且有大量非專一擴增產物。隨甘油濃度增高非專一產物不斷減少，當甘油濃度為35％、控制退火溫度為45-53℃時目標擴增產物強而無非專一條帶。甘油濃度高至40-45％時，在所試退火溫度範圍內均無非專一產物，但在適當退火溫度下仍有目標擴增產物形成。本實施例反引物的解鏈溫度為62.8℃，引物設計軟體預測其最高允許退火溫度為65.8C，試驗結果證實了軟體的計算結果。隨甘油濃度增加最高允許退火溫度也隨之降低。
實施例4實施例4仍以人基因組DNA為原始模板比較PCR反應液中添加不同濃度甘油對擴增人Beta腎臟腺素受體基因的作用。將文獻報導(見實施例3)的引物在5』端增長使其解鏈溫度和結合效率增加而其他特性基本未變。引延伸後的引物順序示於表6，擴增產物長度262鹼基，引物對順序見表7。
表7.實施例4引物順序
*粗黑體順序表示為從文文獻報導引物(實施例3)延伸的部分。
擴增用試劑和方法與實施例3相同。甘油濃度為35％，結果在所試的45-65℃退火溫度範圍內均得到強的擴增產物而無非專一產物幹擾。
權利要求
1.一種含高濃度甘油的聚合酶鏈式反應的反應液，其組分包括dNTPs、DNA聚合酶、甘油和水，其特徵在於甘油含量為5-45％(V/V)。
2.根據權利要求1所述的反應液，其特徵在於甘油含量為20-35％(V/V)。
3.應用權利要求1所述的反應液的聚合酶鏈式反應方法，依次包括如下步驟(1)模板變性；(2)引物退火；(3)DNA聚合酶催化下合成互補鏈；(4)按步驟(1)-(3)循環進行合成反應；其特徵在於當反應液含5-20％(V/V)甘油時PCR的首次變性溫度範圍為95℃至97℃；反應液含20-45％(V/V)甘油時首次變性溫度範圍為95℃至98℃。
4.根據權利要求3所述的聚合酶鏈式反應方法，其特徵在於應用5-20％(V/V)甘油時PCR循環中變性溫度為94℃至60℃；應用20-45％(V/V)甘油時PCR循環中變性溫度為93℃至60℃。
5.根據權利要求3或4所述的聚合酶鏈式反應方法，其特徵在於應用5-20％(V/V)甘油時第三個循環開始的最低變性溫度比擴增產物的解鏈溫度低1-4℃；應用20-45％(V/V)甘油時第三個循環開始的最低變性溫度比擴增產物的解鏈溫度低1-8℃。
6.權利要求1所述的反應液在減少PCR檢測結果非專一性擴增產物中的應用。
7.權利要求1所述的反應液在減少PCR檢測結果假陰性中的應用。
8.權利要求3所述的聚合酶鏈式反應方法在檢測變異DNA序列中的應用。
9.應用權利要求1所述的反應液的反轉錄聚合酶鏈式反應方法，依次包括如下步驟(1)在反轉錄酶催化下以RNA為模板合成DNA鏈；(2)DNA鏈模板變性；(3)引物退火；(4)DNA聚合酶催化下合成互補鏈；(5)按步驟(2)-(4)循環進行合成反應；其特徵在於當反應液含5-20％(V/V)甘油時PCR的首次變性溫度範圍為95℃至97℃；反應液含20-45％(V/V)甘油時首次變性溫度範圍為95℃至98℃。
10.根據權利要求9所述的反轉錄聚合酶鏈式反應方法，其特徵在於應用5-20％(VN)甘油時PCR循環中變性溫度為94℃至60℃；應用20-45％(V/V)甘油時PCR循環中變性溫度為93℃至60℃。
全文摘要
本發明涉及一種含高濃度甘油的聚合酶鏈式反應的方法及其反應液和應用，特別地，採用在原有的PCR反應液中添加5－45％(V/V)甘油的高甘油配方，大大突破了現有的反應液甘油濃度，並且提供相應的提高首次變性溫度至95℃－98℃、降低循環中變性溫度至94℃－60℃的反應方法，使非專一性擴增產物顯著下降，PCR結果中的假陰性減少，對於目標DNA序列的變異，其檢出率亦獲得提高。本發明的反應液和反應方法適用於分子生物學實驗室高效的常規PCR擴增和快速而特異的臨床醫學核酸檢測。
文檔編號C12Q1/68GK1548544SQ0311701
公開日2004年11月24日 申請日期2003年5月20日 優先權日2003年5月20日
發明者徐定邦, 朱德芬, 孫崇榮, 徐文慧 申請人:徐定邦, 徐文慧