一種純化奈西利肽的方法
2023-05-30 11:54:21 2
專利名稱：一種純化奈西利肽的方法
技術領域：
本發明涉及一種多肽的純化方法，尤其涉及反相高效液相色譜法純化 奈西利肽的方法。
奈西利肽(Nesiritide)又稱人腦利鈉肽，由Sudoh於1988年從豬腦組 織中分離出來，是內源性利鈉家族的重要成員之一，主要由心臟分泌。其 結構與心鈉素相似，具有利鈉、利尿、擴張血管和抑制腎素分泌等作用， 主要用於治療心力衰竭等，其效果較好且副作用小，是一種很有市場前景 的多肽藥物。
奈西利肽(Nesiritide)序列如下所示
現有技術純化奈西利肽的方法得到的精肽奈西利肽純度不高，收率低。
發明內容
本發明提出了一條適於產業化純化奈西利肽的方法，使用反相高效液 相色譜法純化奈西利肽，純度高且收率好，達到產業化要求。
為實現上述目的，本發明採:f又純化奈西利肽的方法，包括以下步驟
a、 以反相矽膠為固相，以體積比為80-95: 20-5的水和乙腈為流動相， 將奈西利肽粗肽與固相結合；
b、 用1-50: 99-50的水和乙腈為洗脫液對固相進^f亍洗脫；
c、 濃縮洗脫液；
d、 上述濃縮的粗肽溶液用十八烷基矽烷鍵合矽膠為固定相，以磷酸鹽 緩衝溶液為A相、色譜純乙腈為B相，進行梯度洗脫純化，其中梯度 B°/。: 5%—45%, A相的pH應小於5，不小於1. 5;
e、 採用陰離子交換法將磷酸鹽、三氟醋酸鹽轉成醋酸鹽。
步驟a、以反相石圭膠為固相，以體積比為80-95: 20-5的水和乙腈為
背景技術：
H-Ser-Pro-Lys畫Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-C!ys陽Phe-Gly-Arg陽 Lys-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser-Ser扁Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Lys-Val-Leu畫Arg-Arg-His-OH |
3流動相，將奈西利肽粗肽與固相結合；所述體積比為80-95: 20-5的水和乙 腈的含義是水乙腈的體積比為80: 20至95: 5之間的任意一個比例，下面所 述的"用1-50: 99-50的水和乙腈為洗脫液"，"優選20-50: 80-50的水和 乙腈為洗脫液"，"更優選30-40: 70-60的水和乙腈為洗脫液，，，"優選90-95: 10-5水和乙腈為流動相"等表達含義的解釋邏輯相同。
其中所述的"反相矽膠"是C8或C18的矽膠；將"奈西利肽粗肽與固 相結合"可以通過將奈西利肽粗肽溶液過矽膠柱實現；奈西利肽粗肽指採 用固相合成法等合成獲得未曾精製的奈西利肽；優選90-95: 10-5水和乙 腈為流動相，更優選95: 5的水和乙腈為流動相；
步驟b 、用1-50: 99-50的水和乙腈為洗脫液對固相進行洗脫；
水和乙腈的體積乙腈含量的升高，洗脫效果越好，其中優選20-50: 80-50的水和乙腈為洗脫液，更優選30-40: 70-60的水和乙腈為洗脫液； 所述的"對固相進行洗脫"為常規的洗脫操作，並收集洗脫液。
步驟c、濃縮洗脫液；
將步驟b所收集的洗脫液進行濃縮至10-15mg/mL,優選旋轉蒸發濃縮 方式。
步驟d、上述濃縮的粗肽溶液用十八烷基矽烷鍵合矽膠為固定相，以 磷酸鹽緩衝溶液為A相、色譜純乙腈為B相，進行梯度洗脫純化，其中 梯度B%: 5%—45%， A相的pH應小於5，不小於1. 5;
其中A相的pH優選為小於4. 5，不小於2. 5;。梯度B。/n優選為12% _38%。
步驟e、採用陰離子交換法將磷酸鹽、三氟醋酸鹽轉成醋酸鹽。
通過採用能夠提供醋酸根的陰離子交換樹脂，如 Amberlite IRA-93或Wofatit AD-41等進行離子交換，將奈西利肽的磷酸 根或三氟醋酸根轉換成醋酸根實現。
純化規模包括以下規格色譜柱5 cm x 25 cm (柱子直徑x長度)、 15 cm x 25 cm、 30 cm x 25 cm 。
本發明的方法純化奈西利肽操作筒單可行、純度高、收率好，達到產 業化要求。
具體實施例方式
下面給出實施例以對本發明進行具體描述，有必要在此指出的是以下實施例只用於對本發明作進一步的說明，不能理解為對本發明保護範圍的 限制，該領域的技術熟練人員根據本發明內容對本發明作出的一些非本質 的改進和調整，仍屬於本發明的保護範圍。
實施例一
1、 樣品處理將奈西利肽粗肽稀溶液用反相矽膠為固相，以水和乙腈 為液相，調整水和乙腈的比例為95: 5,將粗肽與固相結合。然後調整水 和乙腈比例為大於1: 99,使得粗肽完全溶於液相中，旋轉蒸發濃縮至 10-15mg/mL，用濾膜過濾後收集濾液備用。
2、 純化
純化條件色譜柱以十八烷基矽烷4建合矽膠為固定相的色譜柱，柱 子直徑和長度為5 cm x25cm。流動相A相^岸酸二氬鈉水溶液用 磷酸調pH至3. 0-4. 5 ; B相色語純乙腈。流速50-80 ml/min。檢測 波長230 nm。梯度B%: 15%—32% 30-40 min。進樣量為1.5-3 g 。
純化過程將色譜柱用50%以上的乙腈沖洗乾淨後上樣，上樣量為 150-200ml樣品溶液。線性梯度洗脫40-50min,收集目的峰，將收集的目 的肽溶液於水溫不超過37 。C下減壓旋蒸濃縮至約10-20 mg/mL後備用。
3、 轉鹽取6. 2 g陰離子交換樹脂Amberlite IRA-93置於合適大小 的砂芯漏鬥中，用超純水衝洗至中性後上樣，上樣量1 g，減壓抽濾並收 集濾液，濾液於不超過35 。C下減壓旋蒸濃縮至約5-8 ml/g後轉至合適大 小西林瓶，進行冷凍乾燥，即可得到純度大於98. 5%的奈西利肽，收率 46. 7%。
實施例二
1、 樣品處理將奈西利肽粗肽稀溶液用反相矽膠為固相，以水和乙腈 為液相，調整水和乙腈的比例為80: 20，將粗肽與固相結合。然後調整水 和乙腈比例為48: 52,使得粗肽溶於液相中，旋轉蒸發濃縮至12mg/mL， 用濾膜過濾後收集濾液備用。
2、 純化
純化條件色譜柱以十八烷基矽烷鍵合矽膠為固定相的色譜柱，柱 子直徑和長度為15 cm x 25cm。流動相A相石粦酸二氫鈉水溶液 用磷酸調pH至3. 0-4. 5 ; B相色譜純乙腈。流速450-550 ml/min。 檢測波長230 nm。梯度B%: 12%~38% 50-70 min。進樣量為10-20g 。
純化過程將色譜柱用50%以上的乙腈衝洗乾淨後上樣，上樣量為1000ml-2000ml樣品溶液。線性梯度洗脫50-70min,收集目的峰，將收集 的目的肽溶液於水溫不超過37 。C下減壓旋蒸濃縮至約10-20 mg/mL後備 用。
3、轉鹽取48 g陰離子交換樹脂Wofatit AD-41置於合適大小的砂 芯漏鬥中，用超純水沖洗至中性後上樣，上樣量5.9 g，減壓抽濾並收集 濾液，濾液於不超過35 。C下減壓旋蒸濃縮至約5-8 ml/g後轉至合適大小 西林瓶，進行冷凍乾燥，即可得到純度大於98. 5%的奈西利肽，收率49. 2%。
實施例三
1、 樣品處理將奈西利肽粗肽稀溶液用反相矽膠為固相，以水和乙腈 為液相，調整水和乙腈的比例為90: 10，將粗肽與固相結合。然後調整水 和乙腈比例為30: 70, 4吏得粗肽溶於液相中，旋轉蒸發濃縮至10mg/mL， 用濾膜過濾後收集濾液備用。
2、 純化
純化條件色譜柱以十八烷基矽烷鍵合矽膠為固定相的色譜柱，柱 子直徑和長度為30cm x 25 cm 。流動相A相石壽酸二氫鈉水溶液 用磷酸調pH至2. 7-4. 2 ; B相色譜純乙腈。流速1900-2200 ml/min。 檢測波長230 nm。梯度B%: 9% ~ 41% 100-150 min。進樣量為55-75 g 。
純化過程將色譜柱用50%以上的乙腈沖洗乾淨後上樣，上樣量為 5500ml-7500ml樣品溶液。線性梯度洗脫100-150min,收集目的峰，將收 集的目的肽溶液於水溫不超過37 。C下減壓旋蒸濃縮至約10-20 mg/mL後 備用。
3、 轉鹽取460 g陰離子交換樹脂Amberlite IRA-93置於合適大小 的砂芯漏鬥中，用超純水衝洗至中性後上樣，上樣量62g，減壓抽濾並收 集濾液，濾液於不超過35 。C下減壓旋蒸濃縮至約5-8 ml/g後轉至合適大 小西林瓶，進行冷凍乾燥，即可得到純度大於98. 5%的奈西利肽，收率 51. 3%。
實施例四
1、 樣品處理將奈西利肽粗肽稀溶液用反相矽膠為固相，以水和乙腈 為液相，調整水和乙腈的比例為85: 15，將粗肽與固相結合。然後調整水 和乙腈比例為30: 70，使得粗肽溶於液相中，旋轉蒸發濃縮至10mg/mL， 用濾膜過濾後收集濾液備用。
2、 純化純化條件色譜柱以十八烷基矽烷鍵合矽膠為固定相的色譜柱，柱 子直徑和長度為30cm x 25 cm 。流動相A相-岸酸二氫鈉水溶液 用磷酸調pH至1.5-5 ; B相色譜純乙腈。流速1900-2200 ml/min。 檢測波長230 nm。梯度B%: 5% ~ 45% 100-150 min。進樣量為55-75 g 。
其他操作同實施例3,即可得到純度大於98. 5%的奈西利肽，收率 50. 4%。
綜上所述本發明通過將奈西利肽粗肽與固相結合，用高壓反相色譜 純化後釆用陰離子交換法將磷酸鹽、三氟醋酸鹽轉成醋酸鹽，純化方法適 於奈西利肽的規;漠純化，純度高且收率好，達到產業化要求，為大量純化 製備奈西利肽原料藥提供了 一種有效純化工藝。
權利要求
1、一種純化奈西利肽的方法，包括以下步驟a、以反相矽膠為固相，以體積比為80-95∶20-5的水和乙腈為流動相，將奈西利肽粗肽與固相結合；b、用1-50∶99-50的水和乙腈為洗脫液對固相進行洗脫；c、濃縮洗脫液；d、上述濃縮的粗肽溶液用十八烷基矽烷鍵合矽膠為固定相，以磷酸鹽緩衝溶液為A相、色譜純乙腈為B相，進行梯度洗脫純化，其中梯度:B％:5％—45％，A相的pH應小於5，不小於1.5；e、採用陰離子交換法將磷酸鹽、三氟醋酸鹽轉成醋酸鹽。
2、 根據權利要求1所述方法，其特徵在於所述的a步驟中作為流動 相的水和乙腈的體積比優選為90-95: 10-5。
3、 根據權利要求1所述方法，其特徵在於A相的pH應小於4. 5， 不小於2. 5。
4、 根據權利要求2所述方法，其特徵在於A相的pH應小於4. 5, 不小於2. 5。
5、 根據權利要求1至4任意一項所述方法，其特徵在於所述d步驟 的梯度B。/。: 12%—38°/。。
6、 根據權利要求1至4任意一項所述方法，其特徵在於所述的陰離 子交換法為通過採用能夠提供醋酸根的陰離子交換樹脂進行離子交換實 現。
7、 根據權利要求5所述方法，其特徵在於所述的陰離子交換法為通 過採用能夠提供醋酸根的陰離子交換樹脂進行離子交換實現，所述的陰離 子交換樹脂是Amber lite IRA-93或Wofatit AD-41。
8、 根據權利要求1所述方法，其特徵在於所述的a步驟中作為流動 的水和乙腈的體積比優選為95: 5。
9、 根據權利要求1所述方法，其特徵在於所述的b步驟中作為流動 相的水和乙腈的體積比優選為20-50: 80-50。
10、 根據權利要求1或9所述方法，其特徵在於所述的b步驟中作 為流動相的水和乙腈的體積比優選為30-40: 70-60。
全文摘要
本發明提供一種奈西利肽的純化方法，主要通過將奈西利肽粗肽與固相結合，用1-50∶99-50的水和乙腈為洗脫液對固相進行洗脫，濃縮洗脫液，將濃縮的粗肽溶液用十八烷基矽烷鍵合矽膠為固定相，以磷酸鹽緩衝溶液為A相、色譜純乙腈為B相，進行梯度洗脫純化，採用陰離子交換法將磷酸鹽、三氟醋酸鹽轉成醋酸鹽。本發明的純化方法適於產業化純化奈西利肽，純度高且收率好，達到產業化要求，為大量純化製備奈西利肽原料藥提供了一種有效純化工藝。
文檔編號C07K14/47GK101463080SQ20091010486
公開日2009年6月24日 申請日期2009年1月9日 優先權日2009年1月9日
發明者柱 戴, 李紅玲, 袁建成, 覃亮政, 馬亞平 申請人:深圳市翰宇藥業有限公司