一種現場快速定性鑑定赤潮微藻的方法
2023-05-30 14:16:31
專利名稱：一種現場快速定性鑑定赤潮微藻的方法
技術領域：
本發明涉及一種快速定性檢測赤潮微藻的方法，具體說是全細胞螢光原位雜交技術(Whole-cell Fluorescence in Situ Hybridization)在防治赤潮方面的應用。
背景技術：
FISH技術是細胞生物學和分子生物學技術(主要是分子雜交技術)相結合的產物，主要是選擇一個已知序列中特異的DNA片段，用螢光標記後作為FISH的探針與中期細胞的染色體或細胞核的DNA雜交(結合)，在染色體上顯示與螢光探針同源的DNA片段的位置，從而將這個已知序列的DNA片段定位在細胞中。FISH技術不僅準確、快速、靈敏，而且簡單方便，目前已經在細胞遺傳學、產前診斷及腫瘤生物學上廣泛應用。
目前赤潮生物的分類與識別方法主要有三方面(1)根據細胞的形態及其生活史。但是，這些產生赤潮的微型生物的形態有時很難區分，有些形態的細微差別是由於環境條件的不同而產生的，以這些形態上的差別作為分類的標準會造成赤潮生物分類上的混亂；同時，以形態上的差異作為分類的依據不同的分類學家有不同的標準，帶有一定的主觀性。(2)採用分子生物學技術。如序列測定、限制性片段長度多態性RFLP(Restricted Fragment Length Polymorphism)、隨機擴增多態性RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)等。應用這些方法均可以有效地鑑定某株藻並通過構建進化樹確定該株藻的分類位置。但上述分子生物學方法都有著無法避免的缺點，如操作時間長，檢測樣品少以及不能定性檢測自然水體樣品等。同時應用分子生物學方法鑑定赤潮藻的前提條件是赤潮藻必須經過分離純化以及實驗室單種培養。有些赤潮藻難以分離，實驗室單種培養更為困難，這些因素無疑限制了用分子生物學方法鑑別赤潮藻。(3)將在醫學領域廣泛使用的免疫螢光技術應用到赤潮藻分類上。應用免疫螢光技術首先要製備合適的抗體(單抗或多抗)，如果製備的抗體合適，則免疫螢光技術表現出明顯的優越性。應用免疫螢光技術不僅靈敏、簡單，而且可以對水體中同種赤潮藻細胞進行定量，比赤潮藻的分子生物學鑑定更為優越。然而，赤潮藻抗體的獲得基於藻細胞的外部形態特徵，藻細胞的外部形態又極易受環境的影響，因而其準確性受到懷疑。同時，在自然水體中某些微生物往往會和赤潮藻的抗體發生非特異性免疫交叉反應，在進行自然水體赤潮藻細胞定量分析時出現嚴重偏差。因此，用免疫螢光方法對自然水體中的赤潮藻細胞進行定性和定量分析時，可信度並不高。
以上赤潮藻鑑定方法具有局限性和對赤潮藻鑑定的不準確性，到目前為止，在國內還未檢索到赤潮藻快速現場檢測的報導。
赤潮(red tide)是泛指海洋浮遊生物(主要是甲藻類)過度繁殖造成海水變色(一般為紅色)的現象。自20世紀70年代之後，有關赤潮的報導越來越多。據不完全統計，1972～1998年我國(香港地區和臺灣省未統計在內)有記載的赤潮達360次(文獻1.齊雨藻鄒景忠，梁松等著，中國沿海赤潮[M].北京科學出版社，2003.302-303)。隨著經濟的發展，我國的赤潮發生頻率明顯增加，發生規模及危害程度也日益加劇。赤潮的頻繁爆發不僅危害海洋生態環境，給海洋漁業、海水養殖業和濱海旅遊業等造成一定的危害，而且也給人類健康和生命安全帶來威脅(文獻2.彭崑崙，李錦蓉.一次發生在深圳赤灣赤潮的初步報告.[J]暨南大學學報(赤潮研究專刊)，1989，86-89；文獻3.齊雨藻，洪英，呂頌輝等.中國赤潮生物新記錄種—海洋褐胞藻.[J]暨南大學學報(自然科學報)1991，12(3)92-95；文獻4.HoKC，Hodgkiss IJ.severe fishkills in Hong Kongcaused by noctiluca scintillans blooms.[J]Red Tide Newsletter.1992，512；文獻5.Wang DF.red tides in Hong Kongproblems and management.strategy with special reference to the mariculture industry.[J]J ShorelineManagement.1987，32-21；文獻6.Sournia A，red tide and marinephytoplankton of the world oceanan inquiry into biodiversity.Lassus P，Arzul G，Denn E et al.(eds)Harmful Marine Algal Blooms.London，NewYork，ParisTechnique Documentation-Lavoisier/Andover，England UKIntercept Ltd，1995.103-112)。赤潮已成為全球性的主要海洋災害之一。Sournia做了一個統計(文獻6.Sournia A，red tide and marine phytoplanktonof the world oceanan inquiry into biodiversity.Lassus P，Arzul G，Denn Eet al.(eds)Harmful Marine Algal Blooms.London，New York，ParisTechnique Documentation-Lavoisier/Andover，England UKIntercept Ltd，1995.103-112)，認為海洋種有3365～4025種浮遊藻類，其中赤潮種約佔6％，為184～267種，有毒種約佔2％，為60～78種。由於某些赤潮藻形態高度多樣化，有毒赤潮的種類也在增加，如以前從未在中國出現過的鏈狀裸甲藻、異彎藻、海洋褐胞藻等都是新赤潮種出現的例證(文獻7.郭玉潔.大連灣赤潮生物—赤潮異彎藻[J]海洋與湖沼，1994，25(2)211-215；文獻8.齊雨藻，洪英，呂頌輝等.南海大鵬灣海洋褐胞藻赤潮及其成因[J]海洋與湖沼，1994，25(2)132-137)，因此單憑傳統的以形態鑑定為主的分類學已顯得力不從心。
分子生物技術的迅速發展為赤潮藻的鑑定提供了新思路。目前運用分子生物學的方法主要有隨機擴增多態性(RAPD)、限制性片段產度多態性(RFLP)、測定序列，如研究核糖體大小亞基或其轉錄單元內間隔區(ITS)rDNA序列等，在鑑定赤潮微藻方面已經取得了一定的進展(文獻9.Scholin C A.，Anderson D M.Identification of species and strain-specificgenetic markers for globally distributed Alexandrium(Dinophyceae).I.RFLPanalysis of SSU rRNA genes.[J]J.Phycol，1994，30744-754；文獻10.Scholin C A.，Herzog M.，Sogin ML.，et al.Identification of group and strain-specific genetic markers for globally distributed Alexandrium(Dinophyceae).II.Sequence analysis of a fragment of the LSU rRNA gene.[J]J.Phycol，1994，30999-1011；文獻11.Adachi M.，Sako Y.and Ishida Y.Restriction fragmentlength polymorphism of ribolsomal DNA internal transcribed spacer and 5.8Sregions in Japanese Alexandrium species(Dinophyceae).[J]J.Phycol，1994，30857-863；文獻12.莊麗，陳月琴，李欽亮等.赤潮叉角藻18SrDNA和ITS區序列測定與分析.[J]海洋與湖沼，2001，32(2)148-153)。但這些方法均不適用於現場檢測自然水體樣品。因為應用上述方法的前提條件是赤潮藻必須經過分離純化及實驗室單種培養。因此要達到早期預報的目標還有很大的距離。如何找到一種準確、快速的現場檢測自然水體樣品的方法已成為研究赤潮的重要方向。
發明內容
本發明的目的在於提供一種準確、快速、簡單的應用全細胞螢光原位雜交技術現場快速定性鑑定赤潮微藻的方法。
為實現上述目的，本發明採用的技術方案為應用全細胞螢光原位雜交技術鑑定赤潮微藻的步驟包括從赤潮藻目的序列中尋找高度特異的DNA序列作為探針—製備探針—固定赤潮藻細胞—雜交—螢光顯微鏡檢測1.探針的確定比較多種浮遊植物的核糖體大小亞基基因18S/28S rDNA(18S/28Sribosomal RNA gene)和二者之間的轉錄單元內間隔區ITS(InternalTranscribed Spacer)序列表明，rDNA序列是由相互間隔的保守區和多變區構成。保守區rDNA序列較為相似，反映了生物在進化上的同源性。不同海洋浮遊植物的rDNA多變區序列以及ITS序列存在較大差異，因此這些區域不僅是鑑定這些生物的良好遺傳標記，而且是尋找特異性分子標記的良好區域；目前，用rDNA和ITS區作為分子指標在研究赤潮甲藻系統發育方面已取得了較好的結果。因此本發明採用赤潮藻核糖體大亞基DNA序列和核糖體大小亞基之間的轉錄單元間隔區ITS作為目的序列，或以ITS序列設計探針，或在這些目的片段中尋找高度特異的DNA序列作為探針。
2.探針的標記探針的標記主要有4種方法，即隨機引物法、缺口平移法、PCR擴增法和末端標記法。
3.赤潮藻細胞的固定本發明涉及固定細胞的方法包括2方面；一是細胞的固定；用該法固定的細胞不僅不變形而且保存時間長，在室溫下可保存6周；在4℃可長達15周再用於雜交時效果也很好；二是將細胞固定在載玻片上。普通的載玻片經處理後，滴加上固定後的藻細胞，30-45℃乾燥20min即可。
4.雜交將含有探針的雜交液加到有固定細胞的載玻片上，在一定溫度下進行雜交反應(將該片置於鋪有溼濾紙的培養皿中，蓋上蓋子，漂浮於一定溫度的恆溫水浴中過夜；衝洗後滴加抗體，37℃溫育1h)；5.螢光顯微鏡觀察封片，用螢光顯微鏡觀察或保存於4℃。
所述雜交前固定的赤潮藻細胞應進行DNA變性，即加變性液於乾燥後的載玻片上，80℃1.5min後迅速放在-20℃的一系列濃度的酒精中脫水；系列酒精的體積濃度分別為50-70％，70-90％，90-100％。
本發明具有如下優點1.本發明是將FISH技術改良後應用到赤潮生物檢測上，改良的FISH技術在定性檢測赤潮微藻方面顯示了無可比擬的優越性；本發明簡單易行，且準確性也較高；細胞固定後不變形，這對於檢測自然水體樣品打下良好的基礎。
2.本發明鑑定赤潮微藻的方法—全細胞螢光原位雜交技術不僅具有準確、快速、簡單的的優點，整個檢測過程所需時間小於20小時，而且操作簡單；更重要的是該法能進行現場檢測，即可以在自然水體中進行藻細胞的定性分析，這是目前其它鑑定赤潮微藻的方法所不能達到的。因此該發明將會在海洋微藻鑑定方面顯示良好的應用前景。
圖1為東海原甲藻在螢光顯微鏡下的觀察圖片(Abs/Em＝492/519nm；20X10)；圖2為第二次實驗東海原甲藻在螢光顯微鏡下的觀察圖片(40x10)；圖3為東海原甲藻細胞按一定的比例稀釋後雜交的結果觀察圖片(40x10)。
具體實施例方式
本發明採用赤潮藻核糖體大亞基DNA序列和核糖體大小亞基之間的轉錄單元間隔區ITS(Internal Transcribed Spacer)作為目的序列，在此目的片段中尋找高度特異的DNA序列作為探針。應用該技術對自然水體赤潮藻進行定性分析的關鍵是要在藻細胞基因組中找到合適的DNA片段作為探針。這個DNA片段必須高度變異，也就是說，不同種之間甚至同種不同地理株之間的序列表現不同。ITS序列因高度變異，可以考慮作為FISH探針。其它的DNA序列，如28S rDNA中的D1和D2區域也高度變異(分析亞歷山大藻核糖體大亞基的結構已證實)，也可以作為FISH探針。因此，篩選合適的DNA片段作為探針是FISH技術成功的前提。
實施例1以東海原甲藻為例具體實驗步驟如下
東海原甲藻是在我國東海新出現的赤潮物種，也是引發東海赤潮的主要物種。該物種經單種分離培養後，提取該種藻細胞的總DNA。經PCR擴增得到含5.8S rDNA的ITS序列。該序列在國際基因資料庫(GenBank)中比對後，證實該ITS序列為該藻所特有。因此在該區域構建探針。東海原甲藻ITS序列如下gcacgcatcc atttgattca ttgtgaataa cagttggtga ggatctgggt ggggatgaag60atagcatcga tgcccccatg cggatactcg agggcagcaa gccaggctca gaccgtcttc120tgggcttgtc cttgctgcca gtgtctgttt gatattctgt atgttccaat ttgttctgag180tggtcttcca ctctttatct tcttacaact ttcagcgacg gatgtctcgg ctcgaacaac240aatgaagggc gcagcgaagt gtgataagca ttgtgaattg cagaattccg tgaaccaata300gggacttgaa cgtatactgc gctttcggga tatccctgaa agcatgcctg cttcagtgtc360tattcttatt attccagcat ctgacttgtt cggaatgctt gtgtgtgttt gtgtgccagg420gcgcctctac ggcctctggc gcattcagtg cacagggtct tcccgcgcaa acaactagaa480gagtatctct gatgctatct gttgtcttgt tgtcgggctg ggccttgttg tctagtgcat540atcgcactta ta552(1)SEQ ID No1的信息(參見序列表)source1..552/organism＝″Prorocentrum donghaiense″/mol_type＝″genomic DNA″/note＝″authorityProrocentrum donghaiense Lu″misc_RNA1..203/product＝″internal transcribed spacer 1″rRNA204..362/product＝″5.8S ribosomal RNA″misc_RNA363..552/product＝″internal transcribed spacer 2″(A)序列特徵*長度552個鹼基*類型核酸*鏈型單鏈*拓撲結構線性(b)分子類型DNA (c)假設否 (d)反義否(e)最初來源東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense Lu)ITS(Internal Transcribed Spacer)即核糖體轉錄單元內的非間隔區。真核生物的rDNA成簇排列在一起，由16-18SrDNA，5.8SrDNA和26-28SrDNA組成一個轉錄單位，彼此被轉錄單元內間隔區ITS(Internal TranscribedSequences)分開，目前.rDNA及ITS區被廣泛用作研究系統發育、進化及分類鑑定的分子指標，在動物(Gonzalez et al.，1990)、被子植物(Baldwin，1992)、真菌(Morales et al.，1993)和綠藻(Bakker et al.，1992)等均已獲得理想的結果。ITS區因進化速率較核糖體大小亞基及5.8S rDNA快，因此在不同物種之間，甚至同種不同地理株之間差別較大，因此，該區域的序列不僅可以作為相對接近生物種類的分析的指標，而且是尋找特異性分子標記(如設計探針)的良好區域。
1.離心收集藻細胞，加固定液MSE22mL 95％的乙醇，5mL無菌水和3mL 25×SET(3.75M NaCl；25mM EDTA；0.5M Tris-cl，pH 7.8)固定1-2h，離心再用5×SET懸浮，離心後重懸於1×PBS(100mM NaCl；10mMNa2HPO4；10mM NaH2PO4；1mM EDTA，pH7.0)中；2.取一定體積的重懸液(視固定細胞的濃度而定，若細胞濃度大，則加200μl左右，若細胞濃度低，則加500μl左右)滴加於處理過的載玻片上(載玻片事先用多聚賴氨酸處理過)，45℃乾燥20min。
3.變性玻片上滴加70％DF(去離子甲醯胺)，2×SSC，80℃1.5min後立即放到-20℃的一系列不同濃度的酒精中脫水(50％；75％；95％)；4.探針的製備(隨機引物法)參照試劑盒(Roche DIG High PrimeDNA Labeling and Detection Starter Kit)說明；即取10ng-3μg純化的東海原甲藻ITS DNA，補加高壓蒸汽滅菌的雙蒸水到16μl；將裝有此混合物的eppendorf管在沸水浴中煮10分鐘後，迅速放到冰水中，然後加入試劑盒中1號管藥品4μl，混勻後37℃溫育1h或過夜；5.雜交液50％DF；10％DS；2×SSC；10ng Probe；10μg salmon spermDNA，80℃10min.然後保存與4℃，在使用前於37℃溫育1hour；6.約200μl雜交液加到載玻片上，將該片置於鋪有溼濾紙的培養皿中，蓋上蓋子，漂浮於42℃的恆溫水浴中過夜；7.該載玻片先用預熱到該雜交溫度的2×SSC衝洗5min，再在室溫下用2×SSC衝洗10min；8.滴加30μl抗Dig的抗體，抗體上標記的螢光素是FITC，37℃溫育1h；9.室溫乾燥後用含2.5％的KI的甘油PBS緩衝液(1∶1)封片，用螢光顯微鏡觀察或保存於4℃。
實驗結果本過程以東海原甲藻為材料，以其ITS序列為目標片段設計探針(通過隨機引物法合成並標記)；依上述步驟共進行了三次實驗。實驗的陰性對照是一株赤潮甲藻-塔馬亞歷山大藻。該藻經上述步驟處理後在螢光顯微鏡下並未觀察到螢光，故無法附加圖片。東海原甲藻在螢光顯微鏡下觀察結果如下從圖1可以看出，圖中顯示綠色螢光的是探針與目的片段雜交的結果(Abs/Em＝492/519nm；20X10)；有的藻細胞顯示有綠色的螢光，這標明探針與目的片段結合。未顯示有綠色螢光的表明無探針結合到目的片段上。
圖2是第二次實驗結果。大部分藻細胞的前端顯示有螢光分子，標明此次大部分細胞的目的片段與探針結合。
圖3是藻細胞按一定的比例稀釋後雜交的結果。此結果表明即使細胞的濃度很低，只要探針準確且特異性高，同樣可以檢測出水體中低濃度的樣品。
結論陰性對照塔馬亞歷山大藻在螢光顯微鏡下未觀察到螢光，而目的藻東海原甲藻在螢光顯微鏡下能觀察到FITC發出的綠色螢光。這說明該探針是(高度)特異性的。上述固定方法的優點為檢測自然水體的樣品打下基礎。只要探針設計準確，應用上述步驟能準確、快速地檢測自然水體中地目的赤潮藻。
實施例2與實施例不同之處在於，所選取的赤潮藻物種為海洋原甲藻(Prorocentrum micans Ehrenberg)，它是我國南海北部近岸水域常見種和誘發赤潮的主要種類。該物種經單種分離培養後，提取該種藻細胞的總DNA。經PCR擴增得到含5.8S rDNA的ITS序列。該序列在國際基因資料庫(GenBank)中比對後，證實該ITS序列為該所特有，因此可在該區域構建探針；其ITS序列如下ttaccacacc taaagtctac cggcctcggg ctagtagcaa aaaacgaaag gagagactgg 60gtaaaaccgg tctcgaattt tgtgtcccgc ggacctataa ttttaatggc gtctctcgag 120atgcccaaag ctgatacccc gtctttgttg ggcgctgcat ggcgttccaa caggatactg 180aaccatgagt aatcataatt cggcgtcgtg cacttcggtg tcggtatcgg ttacgaaaca 240atgtcaaaac actttcagca atggatgtct cggctcccac atcgatgaag aacgcagtga 300aatgcgatac gtaatgcgaa ttgcaaaatc agcgagtcat caaaactttg aacgcaactt 360gcacttcctt cggggagtat gtctgttgga gtgtctgttc atccccacca tcccccactc 420cccctaaaca agggagctgg tgcaggatgc agtccaccgc tttcctggta aagcgagtgc 480agatgaaaaa actaatctta taatcgttcc tactcggtgt aatgccggaa ggacgcgaga 540tgatatcatt tacgcgtccc gatagcaata catacaaagc cggatgggcc ctcgattatt 600ctcaattagg acctccaatc agtcaagaat a 631SEQ ID No2的信息(參見序列表)source1..631/organism＝″Prorocentrum micans″/mol_type＝″genomic DNA″misc RNA 1..245/product＝″internal transcribed spacer 1″rRNA 246..410/product＝″5.8S ribosomal RNA″misc RNA411..631/product＝″internal transcribed spacer 2″(A)序列特徵
*長度631個鹼基*類型核酸*鏈型單鏈*拓撲結構線性(b)分子類型DNA (c)假設否 (d)反義否(e)最初來源海洋原甲藻(Prorocentrum micans Ehrenberg)實施例3與實施例不同之處在於，所選取的赤潮藻物種為東海中肋骨條藻[Skeletonema costatum(Greville)Cleve]它是在我國東海海域新出現的赤潮種。該物種經單種分離培養後，提取該種藻細胞的總DNA。經PCR擴增得到含5.8S rDNA的ITS序列。該序列在國際基因資料庫(GenBank)中比對後，證實該ITS序列為該株藻所特有，因此可在該區域構建探針；其ITS序列如下tagtcttact tgatttgagg ttaaattatg ctttcaactc actgcatcag tacattgtgt60gacacagttc agcgcagaca tgcgttcgtt gctcagacac ttccctatat ataaagtatt120gatagacaca gagaggcaca cattgctgca taccatcatc atagaatcct acttgtatat180ataaatgtgg atgcgttgtc gcaatcaaac atctacatag ctttaaagca actatcgtgt240aaggatagat gctcacactc ctcccaacct cactcttccg cgaagaagaa tggatgagag300agttttgtta accaacactc aaacaagcat gctcacagtt tcctgcaagc gctatgtgcg360ttcaaagatt cgatgattca ctgagttctg caattcacat tacgtatcgc attttgctgc420gttcttcatc gttacaggag cctagatatc cgttgctaac agttgttttt ctattacgtt480tatctcttga accatttgga ggtcaaccac aagggcctct ctcacaaatt ttcaatcgat540gaaatcatta gtatgtatga attcaataga cattgggtgt taaaaagtgt aaagacttta600acagttcaca caaggtgtta tgccaatgcc actctccaat gctacttctc tccgaaaaga660gttgacagca acactcgaga agtgacagtg acaaaaggtt ggattatagt gttaa 715SEQ ID No3的信息(參見序列表)source 1..715/organism＝″Skeletonema costatum″/mol_type＝″genomic DNA″misc_RNAcomplement(＜1..＞715)/note＝″contains internal transcribed spacer 1 and 5.8Sribosomal RNA″(A)序列特徵*長度715個鹼基*類型核酸*鏈型單鏈*拓撲結構線性(b)分子類型DNA (c)假設否 (d)反義否(e)最初來源東海中肋骨條藻[Skeletonema costatum(Greville)Cleve]
鑑定赤潮微藻SEQUENCE LISTING110中國科學院海洋研究所120一種現場快速定性鑑定赤潮微藻的方法130
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1.一種現場快速定性鑑定赤潮微藻的方法，其特徵在於1)探針的確定從已知的赤潮藻目的序列中尋找高度特異的DNA序列作為探針；採用赤潮藻核糖體大亞基rDNA序列和核糖體大小亞基之間的轉錄單元間隔區ITS作為目的序列，或以ITS序列設計探針，或在這些目的片段中尋找高度特異的DNA序列作為探針；2)探針的標記按常規方法對所選探針進行標記；3)固定赤潮藻細胞並裂解離心收集藻細胞，加固定液MSE固定，將用固定液固定後的赤潮藻細胞固定在載玻片上乾燥；4)雜交將含有探針的雜交液加到有固定細胞的載玻片上，進行雜交反應；5)衝洗、滴加抗體、乾燥後封片，螢光顯微鏡檢測。
2.按照權利要求1所述的鑑定赤潮微藻的方法，其特徵在於所述探針的標記可採用隨機引物法、缺口平移法、PCR擴增法或末端標記法。
3.按照權利要求1所述的鑑定赤潮微藻的方法，其特徵在於所述加固定液MSE固定藻細胞後，離心再用SET懸浮，離心後重懸於PBS中。
4.按照權利要求1所述的鑑定赤潮微藻的方法，其特徵在於所述雜交前固定的赤潮藻細胞應進行DNA變性，即加變性液於乾燥後的載玻片上，80℃1.5min後迅速放在-20℃的一系列濃度的酒精中脫水。
5.按照權利要求4所述的鑑定赤潮微藻的方法，其特徵在於所述一系列酒精的體積濃度分別為50-70％，70-90％，90-100％。
全文摘要
本發明涉及一種快速定性檢測赤潮微藻的方法，具體說是全細胞螢光原位雜交技術在防治赤潮方面的應用。具體過程為1)從已知的赤潮藻目的序列中尋找高度特異的DNA序列作為探針；2)對所選探針標記；3)固定赤潮藻細胞離心收集藻細胞，加固定液MSE固定，將藻細胞固定在載玻片上乾燥；4)將含有探針的雜交液加到載玻片上進行雜交反應；5)衝洗、滴加抗體、乾燥後封片，螢光顯微鏡檢測。本發明是將FISH技術改良後應用到赤潮生物檢測上，其在定性檢測赤潮微藻方面有無可比擬的優越性；簡單易行，且準確性也較高；細胞固定後不變形，這對檢測自然水體樣品打下良好的基礎。
文檔編號C12Q1/68GK1710097SQ200410020770
公開日2005年12月21日 申請日期2004年6月16日 優先權日2004年6月16日
發明者王廣策, 張寶玉 申請人:中國科學院海洋研究所