一種快速檢測水稻黑條矮縮病病原的方法
2023-05-31 06:59:46
一種快速檢測水稻黑條矮縮病病原的方法
【專利摘要】本發明涉及一種快速檢測水稻黑條矮縮病病原的方法，應用水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒的一對病毒特異性引物以待測樣本總RNA為模板進行RT-PCR擴展，擴增產物在封閉條件下經高解析度溶解曲線分析判斷水稻黑條矮縮病的病原。發明有益的效果是：本發明針對上述生產實際，發展建立了一種僅應用一對引物且無需其他任何探針和擴增後電泳、EB染色、紫外燈下觀察等步驟，就可高通量、快速同步檢測區分RBSDV、SRBSDV的方法，為水稻黑條矮縮病的準確診斷、預測預報和科學防控提供了技術支持。
【專利說明】一種快速檢測水稻黑條矮縮病病原的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及植物保護【技術領域】，尤其是一種快速檢測水稻黑條矮縮病病原的方 法。
【背景技術】
[0002] 水稻是一種重要的糧食作物，但其安全生產常受到病害的侵擾。水稻黑條矮縮 病是其中危害最為嚴重的病毒病之一，主要分布日本、朝鮮、越南、中國等水稻種植區。迄 今為止，已發現該病害可由兩種病毒單獨或複合侵染所致（Zhang et al.，2013;mi et al. , 2013) 〇 一是水稻黑條矮縮病毒（rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)，是呼腸 孤病毒科斐濟病毒屬確定成員，主要傳播媒介是灰飛蝨；另一種是近年新發現的水稻新病 毒-南方水稻黑條矮縮病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV), 又名水稻黑條矮縮病毒2號（Rice black-streaked dwarf virus 2，RBSDV-2)，是呼腸孤 病毒科斐濟病毒屬暫定成員，主要通過白背飛蝨傳播。二者症狀相似性、分布上的重疊性、 田間侵染的複雜性使得檢測與診斷更加困難，而病株和帶毒昆蟲的快速準確檢測診斷又是 病害準確預測和有效監控的前提。
[0003] 血清學方法因其簡單快速、成本低廉，比較適合於大規模田間樣品的檢測。一般 而言，一次ELISA分析，僅能用一種血清來能識別一種或幾種血清學相關的病毒，但難以同 步區分血清學相關但種類不同的病毒；專一性僅識別RBSDV或僅識別SRBSDV的單克隆抗 體尚未有研製成功的報導。因此，目前尚缺乏應用血清學方法同步區分RBSDV、SRBSDV的 報導。近年來，隨著多個RBSDV、SRBSDV分離物基因組序列的完成（Zhang et al.，2001; Wang et al. , 2003 ；Zhang et al. , 2008；Zhou et al. , 2008 ；ffang et al. , 2010；Xue et al.，2014)，分子生物學檢測RBSDV、SRBSDV的技術得到迅速發展。巢式和一步RT-PCR、多 重RT-PCR(mRT-PCR)、雙重實時定量RT-PCR(qRT-PCR)(周倩等，2010 ;季英華等，2011 ;王強 等，2012 ;Wu et al.，2013 ;Zhang et al.，2013)等分子方法被相繼用來檢測和區分RBSDV、 SRBSDV。但這些方法常需要多對引物或探針、或擴增後電泳、染色等過程。本發明針對上述 生產實際，發展建立了一種僅應用1對引物且無需其他任何探針和擴增後電泳、EB染色、紫 外燈下觀察等步驟，就可高通量、快速同步檢測區分RBSDV、SRBSDV的方法，為水稻黑條矮 縮病的準確診斷、預測預報和科學防控提供了技術支撐。
【發明內容】
[0004] 本發明要解決上述現有技術的缺點，提供一種高通量同步檢測區分RBSDV、SRBSDV 的快速檢測水稻黑條矮縮病病原的方法。
[0005] 本發明解決其技術問題採用的技術方案：這種快速靈敏的檢測水稻黑條矮縮病病 原的方法，僅應用一對引物，以樣品總RNA為模板進行RT-PCR擴增。該引物序列為：
[0006] HRM2-1，5, -ACT TCT CTA ATC CYT TAT AC-3，
[0007] HRM2-2,5' -GTA TCA ATC ATT CTT TMC AT-3'
[0008] 最後根據擴增產物的高解析度熔解判斷水稻黑條矮縮病樣品中RBSDV、SRBSDV的 侵染狀況，具體包括以下步驟：
[0009] 引物設計：通過比對分析GenBank資料庫公布和本實驗室測定的RBSDV、SRBSDV全 基因組序列，獲得2種病毒種間保守和多態性相間的區域，按照引物條件選取特定區域設 計了 2種水稻病毒的1對特異性引物。
[0010] 樣品總RNA提取：對於水稻等植物樣品，取適量病株或健株葉片於研缽中加液氮 研磨成粉狀，轉入1.5mL離心管後，再加入ImL TRIzol試劑（Invitrogen);對於飛風樣品， 取單頭蟲體，置於I. 5mL離心管中，加入500 ii LTRIzoI試劑（Invitrogen)，再用經過高溫處 理的玻棒將蟲體充分研磨；此後的操作均按TRIzoI試劑使用說明書提取總RNA，提取的總 RNA保存於-80°C冰箱中備用。
[0011] 擴增反應及烙解曲線分析：採用MeltDoctor?HRM染色試劑（Applied Biosystems)進行擴增，反應總體積20 ii L，內含樣品模板I ii L，其他各組份參照試劑盒說 明。反應程序為：50°〇301^11，951：5111111，951：158,601：308,40個循環 ；高解析度熔解曲線 分析程序：95°C 10s，6(TC lmin，：95°C 15s，6(TC 15s。
[0012] 檢測特異性分析：先利用上述一對引物分別對兩種病毒標準樣品進行擴增並進行 熔解曲線或熔解峰分析（結果見圖1和圖2)，該引物對在相應的病毒標準樣品中均能擴增 到預期片段，但二者的高解析度熔解曲線和熔解峰均呈顯著差異。從熔解峰曲線（圖2)還 可以看出，RBSDV擴增片段熔解溫度（Tm)總是在70°C以下，而SRBSDV擴增片段熔解溫度 (Tm)總是在70°C以上；另一方面，兩種病毒擴增片段的熔解峰峰值均比較單一，無其它非 特異的的熔解峰，表明該對引物具有高度的特異性，不存在非特異性擴增產物。這些結果一 致性地表明，本方法可特異性地用於檢測區分RBSDV和SRBSDV。。
[0013] 發明有益的效果是：本發明針對上述生產實際，發展建立了一種僅應用一對引物 且無需其他任何探針和擴增後電泳、EB染色、紫外燈下觀察等步驟，就可高通量、快速同步 檢測區分RBSDV、SRBSDV的方法，檢測過程不僅簡單快速準確靈敏，而且降低了樣品汙染的 可能性並增強了操作過程的安全性，為水稻黑條矮縮病的準確診斷、預測預報和科學防控 提供了技術支持。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014] 圖1顯示檢測RBSDV、SRBSDV標準樣品獲得的溶解曲線；
[0015] 圖2顯示檢測RBSDV、SRBSDV標準樣品獲得的溶解峰；
[0016] 圖3顯示部分田間樣品檢測獲得的溶解曲線；
[0017] 圖4顯示部分田間樣品檢測獲得的溶解峰。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合附圖對本發明作進一步說明：
[0019] 實施例：
[0020] 樣品選取：田間疑似病株水稻、玉米等樣品主要於2012?2014年間採集自中國浙 江、山東、湖南、海南等省市；飛蝨樣品主要採集自浙江省各市。
[0021] 樣品總RNA提取：對於水稻等植物樣品，取適量葉片於研缽中加液氮研磨成粉狀， 轉入I. 5mL離心管後，再加入ImL TRIzol試劑（Invitrogen);對於飛風樣品，取單頭蟲體， 置於I. 5mL離心管中，加入500 ii LTRIzol試劑（Invitrogen)，再用經過高溫處理的玻棒 將蟲體充分研磨；此後的操作均按TRIzoI試劑使用說明書提取總RNA，提取的總RNA保存 於-80°C冰箱中備用。
[0022] 擴增反應及烙解曲線分析：採用MeltDoctor?HRM染色試劑（Applied Biosystems)進行擴增，反應總體積20 ii L，內含樣品模板I ii L，其他各組份參照試劑盒說 明。反應程序為：50°〇301^11;951：5111111;951：158,601：308,40個循環 ；高解析度熔解曲線 分析程序：95°C 10s，6(TC lmin，：95°C 15s，6(TC 15s。
[0023] 結果分析：將檢測所獲得的田間樣品擴增產物的熔解曲線（圖3)或熔解峰（圖 4)分別與標準樣品相比，很顯然，待測陽性樣品的曲線可分為兩種類型，熔解曲線分別基本 與RBSDV或SRBSDV標準樣品所得結果一致；而且熔解峰（圖4)也與對應結果一致，因此， 本方法可以很簡單快速地清晰區分RBSDV和SRBSDV，表明該方法可成功地用于田間樣品的 高通量檢測。檢測統計結果顯示湖南和海南水稻樣品中僅檢測到SRBSDV，表明湖南和海南 水稻黑條矮縮病主要由SRBSDV引起；在山東玉米樣品中僅檢測到RBSDV，表明山東的玉米 粗縮病主要由RBSDV引起；而在浙江的樣品中，RBSDV和SRBSDV均檢測到，且約1%以上的 白背飛蝨攜帶SRBSDV，表明浙江省水稻黑條矮縮病病原較為複雜，需引起重視。
[0024] 除上述實施例外，本發明還可以有其他實施方式。凡採用等同替換或等效變換形 成的技術方案，均落在本發明要求的保護範圍。
【權利要求】
1. 一種快速檢測水稻黑條矮縮病病原的方法，其特徵是：應用水稻黑條矮縮病毒和南 方水稻黑條矮縮病毒的一對病毒特異性引物以待測樣本總RNA為模板進行RT-PCR擴展，擴 增產物在封閉條件下經高解析度溶解曲線分析判斷水稻黑條矮縮病的病原。
2. 根據權利要求1所述的快速檢測水稻黑條矮縮病病原的方法，具體包含以下步驟： 1) 引物設計：通過比對分析水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒的全基因組 序列，獲得兩種病毒種間保守和多態性相間的區域，按照引物條件選取特定區域設計了兩 種水稻病毒的一對特異性引物： HRM2-1，5' -ACT TCT CTA ATC CYT TAT AC-3' HRM2-2,5' -GTA TCA ATC ATT CTT TMC AT-3' ； 2) 樣品總RNA提取：對於水稻植物樣品，取適量病株或健株葉片於研缽中加液氮研磨 成粉狀，轉入1. 5mL離心管後，再加入lmL TRIzol試劑；對於飛風樣品，取單頭蟲體，置於 1. 5mL離心管中，加入500ii L TRIzol試劑，再用經過高溫處理的玻棒將蟲體充分研磨；此 後的操作均按TRIzol試劑使用說明書提取總RNA，提取的總RNA保存於-80°C冰箱中備用； 3) 擴增反應及熔解曲線分析：採用MeltDoctor HRM染色試劑進行擴增，反應總體 積20yL，內含樣品模板lyL，其他各組份參照試劑盒說明，反應程序為：50°C 30min， 95 °C 5min，95 °C 15s，60°C 30s，40個循環；高解析度熔解曲線分析程序：95 °C 10s， 60°C lmin,95〇C 15s,60〇C 15s ； 4) 結果分析：將檢測所獲得的田間樣品擴增產物的熔解曲線或熔解峰分別與標準樣 品的熔解曲線或熔解峰相比，可以很簡單快速地清晰區分水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑 條矮縮病毒。
【文檔編號】C12Q1/70GK104450960SQ201410681404
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月24日 優先權日:2014年11月24日
【發明者】張恆木, 羊健, 李靜, 劉曉雅, 項聰英, 劉靖, 陳劍平 申請人:浙江省農業科學院