一種藥物誘導肌肉間充質幹細胞增殖和分化的方法及應用的製作方法

2023-05-31 07:06:11

專利名稱：一種藥物誘導肌肉間充質幹細胞增殖和分化的方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及 生物醫學技術領域，特別是涉及一種藥物誘導肌肉間充質幹細胞增殖和分化的方法及應用。
背景技術：
肌肉間充質幹細胞是在成體骨骼肌組織中發現的在創傷後重建肌肉組織的前體細胞，有關骨骼肌成肌細胞的研究較早並有較多的動物和臨床研究。成肌細胞容易識別、培養和繁殖，這使其成為臨床使用的最佳選擇。成肌細胞具有多向分化潛能，在體外能分化成脂肪細胞，並且具有成骨能力。大鼠成肌細胞能否向神經細胞轉分化，目前國內外少見報導。銀杏葉提取物(Extract of Ginkgo bilobo, EGb)是從銀杏科植物葉子中經多步驟分離、純化獲得的一種混合物，成份複雜，其主要有效成份為黃酮糖類和烯內酯類。已知前者具有清除氧自由基功能，而後者中的內酯B是血小板活化因子受體的專一拮抗劑。日前國內、外都有EGb的藥劑，主要用於防治心血管系統疾病。最近國內、外也用於治療老年性痴呆症(Alzheimer’s disease,AD)等神經退行性疾病，並取得一定的療效。銀杏內酯B能否促進神經-幹細胞分化為神經元，在國內外未見正式文獻報導，更未研究銀杏內酯B的這種作用是否有量效關係。本發明的目的是克服現有研究方法上的不足，設計一種應用銀杏內酯B促進體內外肌肉間充質幹細胞分化為神經元的方法，為臨床促進受損傷的中樞神經結構和功能修復和藥物新應用提供指導。本發明的基本方案包括:(1)將銀杏內酯B直接作用體外培養的肌肉間充質幹細胞，使肌肉間充質幹細胞分化為神經元和星形膠質細胞。(2)研究以不同濃度的銀杏內酯B直接作用體外培養的肌肉間充質幹細胞，在不同時間觀察肌肉間充質幹細胞分化為神經元和星形膠質細胞的情況。(3)進一步，將不同濃度的銀杏內酯B注射到動物體內，觀察銀杏內酯B是否能誘導肌肉間充質幹細胞增殖及分化為神經元和神經膠質細胞，從而更好地促進受損傷的中樞神經結構和功能修復。所述的銀杏內酯B是血小板活化因子受體的專一拮抗劑，能促進培養的肌肉間充質幹細胞分化為神經元。肌肉間充質幹細胞是指肌肉組織中相對未分化的、具有增殖和分化潛能的細胞，可從發育中甚至成體內分離出來。

發明內容
(1)將銀杏內酯B直接作用體外培養的肌肉間充質幹細胞，使其分化為神經無和星形膠質細胞。(2)研究以不同濃度的銀杏內酯B直接作用體外培養的肌肉間充質幹細胞，在不同時間觀察其分化為神經元和星形膠質細胞的情況。(3)進一步，將不同濃度的銀杏內酯B注射到動物體內，觀察銀杏內酯B是否能誘導中樞神經本身的神經幹細胞增殖及分化為神經元和神經膠質細胞，替換受損傷的細胞或死亡的細胞，從而更好地促進受損傷的中樞神經結構和功能修復。所述的銀杏內酯B是血小板活化因子受體的專一拮抗劑，能促進培養的神經幹細胞分化為神經無。肌肉間充質幹細胞是指相對未分化的、具有增殖和分化潛能的細胞，可從發育中甚至成年的肌肉中分離出來。我們是從新生SD乳鼠的骨骼肌肉獲取肌肉間充質幹細胞。


附圖1.肌肉 間充質幹細胞分化A肌肉間充質幹細胞對照組；B肌肉間充質幹細胞分化為肌細胞；C肌肉間充質幹細胞分化為神經膠質細胞
具體實施例方式體外培養肌肉間充質幹細胞及其分化的細胞的制各方法如下:選用新生的SD大鼠，斷頭後取腿肌，剪碎後製成分離細胞懸液，分離細胞接種於細胞培養瓶/培養板中，放置於培養箱中培養。採取差速貼壁培養方式，3天後首次換液，10 14天後將原代培養所形成的肌肉間充質幹細胞進行傳代培養。第2代培養6 7天後，取部分細胞進行鑑定。收集第2代克隆的肌肉間充質幹細胞，並接種在24孔培養板中。實驗分成四組:對照組，20ug/ml銀杏內酯B (上海永葉生物科技有限公司，90164)組，40ug/ml銀杏內酯B組和60ug/ml銀杏內酯B組。於體外分別培養7d和14d後，用免疫細胞化學方法檢測神經元的特異性標記物、生長相關蛋白、星形膠質細胞特異性標記物和少突膠質細胞特異性標記物的表達，並計數分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞的百分率。本發明詳細的具體操作技術說明如下:1.體外分離肌肉間充質幹細胞(1)在無菌條件下取出SD大鼠的大腿骨骼肌肉，放入70%酒精中消毒；(2)用剪刀去掉脂肪和肌腱，用剪刀將肌肉塊剪成lmm3的小塊，加入Iml胰酶，製成細胞懸液後置入離心管中；(3)37°C下，消化30min,再1200rpm離心5min,倒去上清液；(4)加入DMEM-F12 (Gibco公司，11330032)的培養液，用吸管吹打成單細胞懸液，移入培養瓶中培養，隔3d首次半量置換培養基；(5)培養10 14天後進行傳代。2、肌肉間充質幹細胞分化為肌細胞(1)將培養的第3-5代肌肉間充質幹細胞收集，以2X 105/cm2的細胞密度接種於兩塊24孔培養板各孔中的蓋玻片上；(2)每塊培養板分對照、肌細胞分化實驗組。(3)對照組培養液用DMEM-F12，另加10%胎牛血清配製。實驗組培養基組成為對照組培養+加入2%馬血清；(4)將培養板置飽和溼度、5% C02培養箱37°C培養。每隔3d半量置換培養液，培養7d終止。3、銀杏內酯B對肌肉間充質幹細胞的誘導分化(1)將培養的第3-5代肌肉間充質幹細胞收集，以2X 105/cm2的細胞密度接種於兩塊24孔培養板各孔中的蓋玻片上；(2)每塊培養板分對照組、20ug/ml (培養液)銀杏內酯B組、40ug/ml (培養液)銀杏內酯B組和60ug/ml (培養液)銀杏內酯B組，每組6孔；(3)對照組培養液用DMEM-F12，另加10%胎牛血清配製。銀杏內酯B組的培養液是在對照組培養液中加入了銀杏內酯B，濃度分別為20ug/ml，40ug/ml和60ug/ml ；(4)將培養板置飽和溼度、5% C02培養箱37°C培養。每隔3d半量置換培養液，培養7d和14d終止。
權利要求
1.一種藥物誘導肌肉間充質幹細胞增殖和分化的方法，其特徵是:將銀杏內酯B作用培養的肌肉間充質幹細胞，誘導其分化為神經元和星形膠質細胞；應用銀杏內酯B作用肌肉間充質幹細胞，誘導其分化為神經元和星形膠質細胞。
2.根據權利要求1所述的藥物誘導肌肉間充質幹細胞增殖和分化的方法，其特徵是:在體外培養應用的銀杏內酯B濃度為20-60 μ g/ml。
3.根據權利要求1所述的藥物誘導肌肉間充質幹細胞增殖和分化的方法，其特徵是:肌肉間充質幹細胞的制各方法為:選用肌肉組織l_2g，剪碎後，經胰蛋白酶消化後製成分離細胞懸液，在基礎培養基DMEM-F12和20%胎牛血清的混合培養液條件下進行培養，培養液中加入表皮生長因子和鹼性成纖維細胞生長因子，採取懸浮培養方式放置於37°C，5%C02培養箱中進行培養；7-10d後將原代培養所形成的肌肉間充質幹細胞克隆用胰蛋白酶和EDTA混合液消化分離，進行傳代培養；細胞培養過程每隔3天半保留換液I次。
4.根據權利要求1所述的藥物誘導肌肉間充質幹細胞增殖和分化的方法，其特徵是: 該方法包括如下步驟: 將培養的第二代肌肉間充質幹細胞收集，以2X 105/cm2的細胞密度接種於24培養孔板中； 每塊培養板分對照組、20ug/ml (培養液)銀杏內酯B組、40 μ g/ml (培養液)銀杏內酯B組和60 μ g/ml (培養液)銀杏內酯B組，每組6孔；對照組培養液用DMEM-Fl2，另加10%胎牛血清配製。
銀杏內酯B組的培養液是在對照組培養液中加入了銀杏內酯B，濃度分別為20ug/ml，40 μ g/ml和60 μ g/ml ; 將培養板置飽和溼度、5% C02培養箱37°C培養；每隔3d半量置換培養液，培養7d和14d終止。
5.藥物誘導肌肉間充質幹細胞增殖和分化的方法的應用，其特徵是:在體內應用銀杏內酯B作用肌肉間充質幹細胞，誘導其增殖和分化為神經元和星形膠質細胞。
全文摘要
本發明涉及一種藥物誘導肌肉間充質幹細胞增殖和分化的方法。將銀杏內酯B作用體外的肌肉間充質幹細胞，誘導其分化為神經元細胞和星形膠質細胞。本發明在細胞水平上驗證銀杏內酯B可誘導肌肉間充質細胞向神經細胞分化，在參與神經網絡的重建，修復中樞神經的功能有重要作用。
文檔編號C12N5/079GK103087983SQ20111033095
公開日2013年5月8日 申請日期2011年10月27日 優先權日2011年10月27日
發明者田傑 申請人:北京清美聯創幹細胞科技有限公司