羥基茋類化合物及其製備方法和應用的製作方法

2023-05-31 00:02:31 1

專利名稱：羥基茋類化合物及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬中藥製藥領域，涉及羥基茋類化合物及其製備方法和抗病毒活性的應用，特別是化合物Scirpusin A、Scirpus in B、(-)-ε-viniferin和Cararosinol E的製備和抗HIV、HBV活性，以及在製備抗病毒藥物中的應用。
背景技術：
老的病毒性疾病如傳染性肝炎、流行性感冒的迅速蔓延，新的病毒性疾病如愛滋病、SARS、EboLa的不斷暴發，正嚴重威脅人類的健康和生存。而許多病毒性疾病由於其特殊的傳染途徑和病毒的變異，已引起國內外醫藥研究人員的密切關注，紛紛投入尋找更加有效的預防疫苗和治療藥物研究。有報導，在蔗草屬(Scirpus sp.)、山扁豆屬(Cassia sp.)和白千層屬(Melaleuca sp.)、馬鞍樹屬(Maackiasp.)等植物中，存在羥基茋類化合物成分，具有抑制5-脂氧化酶和蛋白激酶C(PKC)等作用，可作為抗過敏、抗炎、抗腫瘤藥物。分布於中國西北、華北地區的豆科錦雞兒屬植物，民間用於治療虛損勞熱，陰虛喘咳等症。已知含化學成分包括甾醇類、苯丙素類、黃酮類、三萜類等。

發明內容
本發明的目的是提供新的抗病毒活性物質，具體涉及抗愛滋病病毒(HIV)和B肝病毒(HBV)的活性物質及其進一步製備抗病毒藥物，特別涉及羥基茋類化合物的製備和抗HIV、HBV活性，以及在製備抗病毒藥物中的應用。
本發明根據多年的中醫臨床用藥經驗和「祛邪扶正」原則，應用現代藥理篩選方法，對植物藥中抑制愛滋病病毒(HIV)和B肝病毒(HBV)的活性物質進行研究，從豆科錦雞兒屬(Caragana sp.)中提取羥基茋類化合物並證實其抗病毒活性。
本發明涉及的羥基茋類化合物包括Scirpusin A、Scirpusin B、(-)-ε-viniferin和Cararosinol E。
本發明從豆科錦雞兒屬植物紅花錦雞兒(Caragana rosea)和錦雞兒(Caragana sinica)乙酸乙酯可溶部分提取活性羥基茋類化合物。
本發明的活性羥基茋類化合物具有如下式I的化學結構 其中R1＝H R2＝H7b＝E(-)-ε-viniferinR1＝OHR2＝H7b＝EScirpusin AR1＝OHR2＝OH 7b＝EScirpusin BR1＝OHR2＝H7b＝ZCararosinol E取紅花錦雞兒的乾燥全株，粉碎後用乙醇回流提取，提取浸膏懸浮於水中，分別用石油醚或環己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取。其中乙酸乙酯可溶部分約佔藥材幹重的千分之一至千分之十。該部位再經矽膠正相和反相柱層析，聚醯胺或凝膠層析，可分別獲得化合物Scirpusin A、B和Cararosinol E。
化合物Cararosinol E為淺棕色無定形粉末，[α]D23+3.5°(MeOH，C 0.23)。具有以下1H-NMR光譜(400MHz，(CD3)2CO)δ6.73(2a-H)，6.75(5a-H)，6.53(6a-H)，5.21(7a-H)3.99(8a-H)，6.03(10a，14a-H)，6.17(12a-H)，6.98(2b，6b-H)，6.63(2b，5b-H)，6.20(7b-H，J＝12.2)，5.97(8b-H，J＝12.2)，6.25(12b-H)，6.27(14b-H)。
化合物Scirpusin A，[α]D23+12.8°(MeOH，C 0.25)。具有以下1H-NMR光譜(400MHz，(CD3)2CO)δ6.82(2a-H)，6.79(5a-H)，6.67(6a-H)，5.34(7a-H)，4.42(8a-H)，6.20(10a-H)，6.20(12a-H)，6.20(14a-H)，7.15(2b，6b-H)，6.72(3b，5b-H)，6.89(7b-H，J＝16.4)，6.89(8b，J＝16.4)，6.31(12b-H)，6.70(14b-H)。
化合物Scirpusin B，[α]D23+3.17°(MeOH，C 0.63)。具有以下1H-NMR光譜(400MHz，(CD3)2CO)δ6.82(2a-H)，6.79(5a-H)，6.66(6a-H)，5.34(7a-H，J＝16.4)，4.41(8a-H，J＝16.4)，6.22(10a-H)，6.22(12a-H)，6.22(14a-H)，6.87(2b-H)，6.70(5b-H)，6.68(6b-H)，6.82(7b-H)，6.67(8b-H)，6.30(12b-H)，6.69(14b-H)。
錦雞兒(Caragana sinica)系豆科錦雞兒屬植物。在中國大多數省區有分布，其根入藥又名金雀根，具有清肺益脾、活血通脈的功效，民間主要用於治療虛損勞熱、高血壓、婦女白帶、關節痛風、跌打損傷等。所含化學成分主要為茋類和異黃酮類。錦雞兒地上部分95％乙醇回流提取，所得浸膏用石油醚、乙酸乙酯分別萃取。乙酸乙酯可溶部位含有豐富的茋類化合物，經過矽膠反覆柱層析，氯仿—甲醇和石油醚—乙酸乙酯洗脫，再經Sephadex LH-20層析，氯仿—甲醇洗脫，得到(-)-ε-viniferin。
(-)-ε-viniferin，[α]D23+26.8°(MeOH，C 0.40)。具有以下1H-NMR光譜(400MHz，(CD3)2CO)δ7.20(2a，6a-H)，6.83(3a，5a-H)，5.42(7a-H)，4.46(8a-H)，6.24(10a-H)，6.24(12a-H)，6.24(14a-H)，7.16(2b，6b-H)，6.73(3b，5b-H)，6.91(7b-H，J＝16.4)，6.7C(8b-H，J＝16.4)，6.33(12b-H)，6.72(14b-H)。
上述化合物經藥理試驗，結果表明羥基茋類化合物具有抗愛滋病病毒和B肝病毒的作用，且細胞毒性小。
本發明可取上述化合物Cararosinol E、Scirpusin A、ScirpusinB和(-)-ε-viniferin為原料，任一或任意二種或以上組合物組成配方，添加適量微晶纖維素、澱粉或其他賦形劑，按常規方法分別製成膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑、丸劑等內服劑型，或注射劑、軟膏等非口服劑。通常成人用量為所列化合物20~500mg，一日分數次給藥。


圖1是抗HIV試驗結果。
圖2是抗HIV試驗結果。
圖3是抗HIV活性試驗結果。
圖4是細胞毒試驗結果。
圖5是細胞毒試驗結果。
具體實施例方式
實施例1取紅花錦雞兒地上部分5kg，粉碎後，以95％EtOH回流提取，回流2~3次，每次1~2小時。提取液合併，減壓濃縮得浸膏450g。以環己烷、氯仿、乙酸乙酯對該浸膏的水混懸液依次萃取，得到乙酸乙酯部分45g。乙酸乙酯部分矽膠柱層析，以氯仿—甲醇為洗脫劑，逐步增加甲醇的比例，收集氯仿—甲醇為4∶1時的洗脫流份。用矽膠進一步分離，以環己烷—乙酸乙酯(1∶4)為洗脫劑。得到兩個主要流份A和B。流份A以反相矽膠(RP-18)，以乙醇—水(3∶2)洗脫，主要流份通過聚醯胺柱進一步分離，洗脫劑為乙醇—水(3∶2)，先後得到兩個淡棕色無定形粉末Cararosinol E 60mg和Scirpusin A76mg。流份B通過聚醯胺柱層析，乙醇—水(3∶2)洗脫，合併主要流份，得到另一淡黃色無定形粉末30mg，為化合物Scirpusin B。
實施例2取紅花錦雞兒乾燥全株5kg，粉碎後，以環己烷脫脂，然後以甲醇熱提，得到400g浸膏，該浸膏以乙酸乙酯萃取，萃取物分別以氯仿—甲醇(4∶1)和環己烷—乙酸乙酯(1∶4)溶劑系統進行層析，得到兩個主要流份C和D。對流份C和D的後續操作分別與實施例1中對流份A和B的操作方法相同。分別從流份C和流份D中分離得到化合物Cararosinol E 50mg、Scirpusin A 71mg和Scirpus in B 28mg。
實施例3取紅花錦雞兒地上部分5kg，粉碎後，以95％EtOH回流提取，提取物在石油醚和90％的甲醇中進行分配，充分靜置，分成上下兩層溶液，下層轉移，以乙酸乙酯萃取，得到280g浸膏。先後以氯仿—甲醇(4∶1)和環己烷—乙酸乙酯(1∶4)溶劑系統進行層析，得到兩個主要流份E和F。對流份E和F的後續操作分別與實施例1中對流份A和B的操作方法相同。分別從流份E和流份F中分離得到化合物Cararosinol E 60mg、Scirpusin A 70mg和Scirpusin B 30mg。
實施例4取紅花錦雞兒乾燥全株4kg，粉碎後用20倍重量的95％EtOH滲濾，滲濾所得到提取物通過大孔樹脂HP-20，以水和逐漸遞增的甲醇水洗脫，得到A、B、C、D四個部位，其中部位B，經過Sephadex LH-20氯仿—甲醇洗脫，再經製備矽膠薄層層析，分別獲得Cararosinol E71mg、Scirpusin A 110mg和Scirpusin B 57mg。
實施例5按實施例4方法，從4kg藥材中獲得相應的Sephadex LH-20洗脫部位，用反相矽膠ODS半製備柱，乙腈∶甲醇∶水洗脫，分別得到Cararosinol E 74mg、Scirpusin A 104mg和Scirpusin B 47mg。
實施例6錦雞兒(Caragana sinica)地上部分20kg乾燥後粉碎，95％乙醇回流提取，浸膏懸浮於水中，分別用石油醚、乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部分上矽膠柱層析，用石油醚—乙酸乙酯和氯仿—甲醇洗脫，粗品再上Sephadex LH-20柱，氯仿—甲醇洗脫得到(-)-ε-viniferin32mg。
實施例7錦雞兒乾燥根10kg，粉碎後用95％乙醇常溫滲漉，收集100kg滲漉液，60℃以下減壓濃縮至流浸膏。浸膏拌100~200目矽膠後，乾燥常法上矽膠柱，以氯仿—丙酮洗脫，薄層檢查，合併含(-)-ε-viniferin流份，再上矽膠柱和Sephadex LH-20柱，氯仿—甲醇洗脫得純品47mg實施例8分別取Cararosinol E、Scirpusin A、Scirpusin B和(-)-ε-viniferin為原料，單一或任意二種或以上組合物組成處方，添加適量微晶纖維素、澱粉或其他賦形劑，按常規方法分別製成膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑、丸劑等內服劑型，或注射劑、軟膏等非口服劑。通常成人用量為所列化合物20~500mg，一日分數次給藥。
下面用藥理試驗結果說明羥基茋類的抗病毒作用
試驗例1應用MT-2細胞，生長培養液由培養基RPMI加L-穀氨醯胺、胎牛血清、慶大黴素組成。在96孔板上加入培養液。經過DMSO助溶並稀釋的篩選樣品，樣品做8個稀釋度，相互之間為2倍稀釋，加上50μl稀釋的HIV-IIIB病毒液，再加入MT-2細胞(細胞計數調節至2×105/ml左右)，在39℃二氧化碳培養箱中培養，至第6天做XTT法細胞染色，確定天然產物樣品保護細胞的程度。結果表明本發明化合物能抑制病毒，並有保護宿主細胞的作用。
試驗例2篩選樣品的細胞毒性試驗，基本方法同試驗1，將生長培養液50μl/孔，代替病毒稀釋液50μl/孔。樣品的起始濃度比篩選起始濃度大2-500倍。結果表明本發明化合物對病毒的抑制作用大於對細胞的毒性作用。
試驗例3體外抗B肝病毒(HBV)試驗應用Hep G2的2.2.15細胞株，以每孔10×105個細胞接種於24孔板，培養基為DMEM，生長液含4％胎牛血清，380μg/ml G418，0.03％谷胺醯胺，青黴素、鏈黴素各100μg/ml，在5％CO2孵箱中37℃培養，24小時後，換成二甲基亞碸助溶的含藥物的培養液，每種藥物設4個濃度，每個濃度設4個平行孔，培養5天後，取上清液進行ELISA檢測HbsAg及HBeAg含量。同樣條件下以不含藥物的培養液上清作為對照組。同時用上述細胞株，用MTT法測定藥物的細胞毒性。結果證實本發明化合物能抑制病毒，並有保護宿主細胞的作用。
表1是羥基茋類化合物抗HBV的效果。
表1

權利要求
1.式I的羥基茋類化合物， 其中R1＝H R2＝H 7b＝E (-)-ε-viniferinR1＝OHR2＝H 7b＝E Scirpusin AR1＝OHR2＝OH7b＝E Scirpusin BR1＝OHR2＝H 7b＝Z Cararosinol E通過下述步驟製備①錦雞兒或紅花錦雞兒的根、地上部分或全株用乙醇或甲醇提取；②提取物的乙酸乙酯可溶部分經矽膠層析得羥基茋類化合物粗品；③上述粗品經反相矽膠或聚醯胺或Sephadex LH-20層析，獲得(-)-ε-viniferin，scirpusin A、scirpusin B和Cararosinol E。
2.權利要求1所述的羥基茋類化合物，其中單一化合物作為原料製成膠囊、片劑、顆粒劑、丸劑和針劑。
3.權利要求1所述的羥基茋類化合物，其中任意二種或以上組合物作為原料製成膠囊、片劑、顆粒劑、丸劑和針劑。
4.權利要求1所述的羥基茋類化合物，其中單一化合物在製備抑制愛滋病病毒藥物中的應用。
5.權利要求1所述的羥基茋類化合物，其中任意二種或以上組合物在製備抑制愛滋病病毒藥物中的應用。
6.權利要求1所述的羥基茋類化合物，其中單一化合物在製備抑制B肝病毒藥物中的應用。
7.權利要求1所述羥基茋類化合物，其中任意二種或以上組合物在製備抑制B肝病毒藥物中的應用。
8.權利要求1所述的羥基茋類化合物，其中單一化合物在製備防治病毒性肝炎藥物中的應用。
9.權利要求1所述羥基茋類化合物，其中任意二種或以上組合物在製備防治病毒性肝炎藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及具有C
文檔編號C07D307/00GK1537849SQ20031010807
公開日2004年10月20日 申請日期2003年10月21日 優先權日2003年10月21日
發明者胡昌奇, 楊國勳, 周金濤, 王曙光, 周紀瑩 申請人:復旦大學