一種快速微量檢測鮮河魨血液中ttx反相離子對hplc法的製作方法

2023-05-31 00:34:41 1

專利名稱：一種快速微量檢測鮮河魨血液中ttx反相離子對hplc法的製作方法
技術領域：
本發明屬於河飩魚河飩毒素檢測技術領域，具體涉及鮮河飩毒素微量快速高效檢測技術與河飩魚安全食用技術應用領域。
背景技術：
我國現在食用的河飩魚都屬於東方飩(I^akifugu )，是飩科("Tetrodanti dae )的一個屬，該屬魚類全世界約有20餘種，絕大多數分布於中、日近海，其肉味之美，有「魚中之王」的美譽，在我國沿海城市以及日本、韓國等地深受消費者歡迎，具有很高的經濟價值。 現已成為我國沿海地區的重要人工養殖對象。但因該魚類含有「河飩毒素」(Tetrodoxin TTX)，但在其美味的誘惑下，連日本食用河飩盛行、而且法規制度嚴格，每年仍有因吃河飩中毒事件發生。我國民間早就有「拼死吃河飩」的傳說，特別是在具有千百年飲食河飩魚歷史文化、已成為我國最大的河飩魚消費地，具有「河飩之鄉」美譽的江蘇省揚中地區，也偶有誤食有毒河飩而中毒事件發生。東方飩屬魚類皆有毒性，但其毒力大小，不僅隨河飩魚種類、個體、而且在河飩魚不同組織器官，毒性皆有很大差別，河飩魚的卵巢、肝臟(特別是繁殖期個體)、血液毒性最強，腸、精巢和皮膚次之，肌肉毒力最弱。因肌肉僅含微量毒素 (<5mu/g小鼠單位)的紅鰭東方飩、假睛東方飩、暗紋東方飩、菊黃東方飩等幾種則成為高經濟價值的重要食用飩類。河飩毒素是一種毒性很強的神經毒素，主要表徵是TTX能過與鈉離子通道受體結合，阻斷電壓依賴性鈉通道，從而阻滯動作電位導致與之相關的生理活動障礙，主要是神經肌肉麻痺。毒素作用於腦幹、運動神經、感覺神經和植物神經系統而引起中樞神經、肌肉神經、心血管和胃腸道功能障礙等臨床特徵。呼吸中樞麻痺而導致突然呼吸停止是TTX致死的直接原因之一。目前還沒有有效的解毒劑。河豚毒素的化學性質穩定， 一般的烹飪手段難以破壞。為了確保食用者的安全，同時又能享受河飩美味佳餚，建立快速微量檢測河飩中TTX的方法，可避免消費者食用有毒河飩導致中毒的事件發生。檢測河豚毒素方法很多各有其優缺點，大致分為生物檢測法、儀器分析法、免疫化學法等，其中採用儀器檢測TTX分析法最多。但目前主要採用帶有螢光檢測器與柱後衍生的液相色譜儀與液相色譜-串聯四極杆質譜儀的國家標準《水產品中河豚毒素測定液相色譜-螢光檢測法》和酶聯免疫法檢測的國家標準《鮮河豚魚中河豚毒素的測定》。因液-質聯用的檢測方法，質譜設備昂貴在國內普及率不高，檢測成本很高(僅所需TTX標準品10mg， 進口 TTX 4500元/lmg，IOmg量就需45000元)，難以普及應用。酶聯免疫法特異性強、檢測靈敏高，但是檢測過程繁雜、周期長(需近2天工作日)、難以掌握、試劑盒成本高，也難以普遍推廣應用。由於現行採用的檢測方法主要採用河飩魚肌肉與肝臟樣品，前處理過程複雜、 耗時耗材、TTX回收率較低，而且在分析檢測時常受樣品中雜質幹擾，極易造成TTX假陽性結果，因而仍不能滿足實際應用的需求。我國擁有豐富的河飩魚類資源，為了保障食用者的安全，國家目前禁止河飩魚的食用與銷售，僅在部分地區開設少數試食點，因而造成了這一資源的極大浪費。目前國際市場上河飩的價格很高，因此國內一些水產部門迫切希望開放河飩魚的經營，同時國內人工養殖河飩的規模也很大，因此迫切需要修訂、完善原有管理辦法，做到既發揮河飩資源在促進經濟發展中的作用，又保障消費者的身體健康。因此，急需建立一種先進的以科學、可靠、 簡便、快速、經濟、實用為基礎的河飩毒素檢測方法。

發明內容
本發明克服了河飩魚血液樣品難以採集的技術難題；建立一種新的快速微量檢測鮮河飩血液樣品中河飩毒素(Tetrodoxin TTX)含量的反相離子對高效液相色譜法；利用該法檢測結果判斷鮮河飩是否可以安全食用。為河飩魚的安全食用等方面提供了科學依據和新的檢測手段。本發明的目的在於改進傳統的僅以河飩魚肌肉與肝臟作為檢測TTX樣品的方法， 而以河飩魚血液作為檢測TTX樣品，減化樣品前處理耗時耗材的操作步驟，減少檢測成本， 不需高昂的檢測設備，達到適用於基層檢測中心高效快速微量檢測TTX目的。為河飩魚的安全食用提供準確定性定量依據。本發明的基本原理(1) TTX對人體的最低致死量為0. 5mg。理論上計算即一個人食用一條500g的河飩魚，只要在河飩樣品中檢出TTX含量超過1 μ g/g則不可食用。利用河飩魚血液TTX含量高於肌肉的特性；如在河飩血液樣品中檢出TTX含量低於0. 5 μ g/ mL則可安全食用，以其作為鮮河飩魚安全食用的檢測指標較為科學合理。(2)河飩毒素與庚烷磺酸鈉形成離子對後可在UV200nm處檢測；(3)河飩毒素為弱鹼性，當與庚烷磺酸鈉形成離子對後在反相色譜柱能很好的分離；(4)根據檢測TTX標準品的保留時間和峰面積，可對所檢測樣品中TTX準確定性定量分析；(5)根據檢結果即可判斷河飩魚是否可以安全食用。本發明所述快速微量檢測鮮河飩血液中TTX反相離子對HPLC法，包括以下5個步驟1.鮮河飩魚血液樣品採集與前處理；2.配製流動相；3.配製標準樣品；4.設置色譜分析條件；5.進樣檢測分析與結果判斷。所述步驟1，鮮河飩魚血液樣品採集與前處理鮮河飩魚血液樣品採集與前處理 以無菌注射器吸取約50 μ L肝素鈉注射液，於解剖的河飩腹腔動脈吸取血樣ImL於1. 5mL 離心管中，離心IOmin後取0. 5mL上清液過SupeLcLean LC-18柱，所述SupeLcLean LC-18 柱使用前分別用3mL甲醇、3mL 0. 2%乙酸活化，流速lmL/min ；然後用0. 75mL 0. 2%乙酸淋洗C18小柱，合併兩次收集液於1. 5mL離心管中13000rpm/min離心lOmin，取1. OmL上清液於做好標記的樣品瓶中待分析。所述步驟2，配製流動相50mmol/L磷酸二氫銨、lOmmol/L庚烷磺酸鈉分別用磷酸將pH調至4. 0後用0. 22 μ m濾膜過濾；分別量取磷酸二氫銨和庚烷磺酸鈉溶液890mL與 HPLC級的乙腈IlOmL,合併混勻後超聲波脫氣。 所述步驟3，配製標準樣品配製100 μ g/mL TTX標準儲備液。取Img TTX凍幹標準品加純水溶解定容到10mL，4°C貯存。取標準儲備液，加純水分別配製成濃度為0. 2μ g/ mL>0. 5μ g/mLU. 0μ g/mL>5. 0μ g/mLUO. 0μ g/mL>50. 0μ g/mLU00. 0μ g/mL 的梯度標準工作液。所述步驟 4，色譜條件色譜柱Agilent Poroshell 120 EC-C18 4. 6mmX 150mm 2. 7 μ m ；流動相11%乙腈-89% 50mmol/L磷酸二氫銨-10mmol/L庚烷磺酸鈉(pH 4. 0)(V/V)；進樣量20 μ L ；柱溫250C ；檢測波長200nm ；流速0. 6mL/min。所述步驟5，進樣分析檢測，根據色譜工作站獲得的TTX標準曲線，對目標樣品進行定性定量分析，檢測結果TTX含量<0. 5 μ g/mL判斷河飩魚可以安全食用。本發明主要特點體現在7個方面1.以鮮河飩魚血液作為TTX檢測樣品，大幅減少了樣品前處理的複雜步驟和所需時間、耗材，既簡便又快速(如按常規鮮河飩魚肌肉或肝臟樣品方法檢測，僅前處理10個樣品，因工作量大，操作步驟複雜，就需耗時8 10小時； 而檢測10個血液樣品從採樣、樣品前處理到完成分析僅需2. 5小時左右)；2.檢測方法線性好，0. 2 μ g/mL 100 μ g/mL的範圍內峰面積與測定濃度呈良好的線性關係，相關係數 ^=0. 99999 ；3.顯著提高檢測方法準確度，TTX的回收率達到95%以上，7P5ZK2. 09% ；4.方法重現性好，TTX檢測峰的保留時間7 5ZK0.007%，TTX檢測峰的含量7Ρ5ΖΧ1. 0828 ；5.最低檢測限為0. 135 μ g/mL Wn= ,. 1)；最低定量限約為0. 5 μ g/mL (5//7=11. 7)可滿足河飩魚安全食用的檢測需求；6.與現行TTX檢測方法相比無需昂貴的質譜儀或螢光檢測器、柱後衍生裝置(螢光檢測法，用4N NaOH 100°C的條件將TTX水解成C9鹼進行檢測，雖然檢測靈敏度高，但儀器長時間在高溫、強鹼性條件下使用，很容易腐蝕螢光檢測器)，具有操作簡單、 快速、定性定量準確、適合基層檢測單位應用；7.減少了檢測人員的工作量，節省了檢測費用。本發明為檢測河飩魚TTX提供了新的檢測手段，為安全食用鮮河飩魚提供了科學依據，使消費者不再為享用河飩美味時而為「拼死吃河飩」擔憂。同時將為進一步修訂、完善原有管理辦法、促進河飩開禁、推動河飩經濟產業、河飩飲食文化的發展發揮重要作用。


圖1 檢測TTX標準樣品7種濃度線性色譜圖。圖2 :TTX檢測方法線性範圍與方程。
3 =TTX 最低檢測限 s/n=3. 3 濃度 0. 135 μ g/mL。圖4 =TTX 最低定量限 s/n=ll. 7 濃度 0. 5 μ g/mL。圖5 菊黃東方飩血液對照樣品與加三種濃度TTX標樣後血液樣品的色譜圖。
具體實施例方式本發明具體檢測TTX實例如下 1儀器與材料
1.1 儀器 Agilent HPLC 1100 Series(美國安捷倫1100高效液相色譜儀):QuatPump G1311A (四元泵)、DEGASSER G1379A (脫氣裝置)、DAD G1315B (二級管陣列檢測器)、C0LC0M G1316A (柱溫控制器)、ALS G1313A (自動進樣器)、Agilent HPLC 1100化學工作站。臺式離心機(美國Thermos)、循環水式多用真空泵、電子天平、旋渦振蕩器、固相萃取裝置。耗材SupeLcLean LC-18 SPE Tubes 3mL/500mg (美國 SUPELC0)，2mL —次性使用無菌注射器。藥品與試劑純度為85%河飩毒素標準品Img (河北省水產研究所)；純度為98. 5% 河飩毒素標準品Img (上海洽姆儀器科技有限公司)；乙腈HPLC級；磷酸二氫銨分析純；乙酸分析純；甲醇HPLC級；肝素鈉注射液2mL 12500單位。
實驗材料人工養殖暗紋東方飩、菊黃東方飩 2實驗方法
2.1 試劑配製0. 2%醋酸水溶液；流動相50mmol/L磷酸二氫銨-lOmmol/L庚烷磺酸鈉(用磷酸將PH調至4. 0後用0. 22 μ m濾膜過濾);100 μ g/mL TTX標準儲備液(標品TTX Img 溶於IOmL純水，4°C保存)；梯度標準工作液(取TTX儲備液分別配製成0. 2 μ g/mL、0. 5 μ g/ mL>1. 0 μ g/mL>5. 0 μ g/mL、10. 0 μ g/mL>50. 0 μ g/mL、100. 0 μ g/mL)。色譜條件色譜柱AgilentPoroshell 120 EC-C18 4. 6mmX 150mm 2· 7 μ m ；流動相11%乙腈-89% 50mmol/L磷酸二氫銨-IOmmol/L庚烷磺酸鈉CpH 4. 0)；進樣量20 μ L ； 柱溫25 °C ；檢測波長200nm ；流速0. 6mL/min。樣品前處理以無菌注射器吸取約50 μ L肝素鈉注射液，於解剖的菊黃東方飩腹腔動脈吸取血樣ImL於1. 5mL離心管中，離心IOmin後取0. 5mL上清液過SupeLcLean LC-18 柱(使用前分別用3mL甲醇、3mL 0. 2%乙酸活化，流速lmL/min)，後用0. 75mL 0. 2%乙酸淋洗C18小柱，合併兩次收集液於1. 5mL離心管中13000rpm/min離心lOmin，取1. OmL上清液於做好標記的樣品瓶中待分析。結果與分析 3.1色譜條件確定
3.1. 1固定相的確定以8 5 %純度T T X標準品進樣，在流動相、柱溫、U V檢測波長以及流速都不變的條件下，通過對85%純度TTX標品與雜質的分離度以及保留時間對比，對 Agilent ZORBAX SB-C18 4. 6mm X 250mm 5ym，Beckman ULTRASPHRE-ODS C18 4. 6mmX250mm 5 μ m ,Waters Symmetry C18 4. 6mmX 250mm 5 μ m ,Agilent Poroshell 120 EC-C18 4. 6mmX 150mm 2. 7 μ m四種固定相進行選擇。結果表明使用Agilent Poroshell 120 EC-C18 4. 6mmX 150mm 2.7 μ m作為固定相，可將85%純度TTX標準品與相鄰的雜質峰有效分離。且色譜峰的對稱性較好。流動相的確定以Agilent Poroshell 120 EC-C18 4. 6mmX 150mm 2.7 μπι 作為固相，在柱溫、流速、UV檢測波長均不變的條件下，通過對乙腈-乙酸銨、乙腈-0. 1%甲酸、 50mmol/L磷酸二氫銨-10mmol/L庚烷磺酸鈉、50mmol/L磷酸氫二鈉-5mmol/L磷酸二氫鈉-庚烷磺酸鈉5mmOl/L[、0. 05mol/L磷酸氫二鈉-0. 05mol/L磷酸二氫鈉-庚烷磺酸鈉 2. 5mmol/L、乙腈-磷酸二氫銨-庚烷磺酸鈉六種流動相以及pH對樣品的分離度與保留時間的影響，最終確定以11%乙腈-89% 50mmol/L磷酸二氫銨-lOmmol/L庚烷磺酸鈉(磷酸調 PH 4.0)為色譜流動相，可將85%純度TTX標準品與相鄰的雜質峰有效分離，而且流動相中含有>10%有機相對反相色譜柱有較好的保護作用。柱溫的確定在流動相、流速和檢測波長固定的條件下，觀察200C、25°C、30°C時柱溫對色譜柱分離TTX與雜質效果的影響，當柱溫升高TTX與雜質分離效果降低，保留時間縮短，柱溫降低分離度增加，但保留時間延長。柱溫為25°C時，色譜柱對TTX與雜質分離較好， 柱壓為160bar左右，樣品分析時間可在IOmin內完成。
3. 1.4檢測波長的確定在固定相、流動相、流速、柱溫下確定的條件下，分別比較 196nm、198nm、200nm、204nm、205nm檢測波長下對分離TTX的響應值影響，結果表明以200nm 為檢測波長時信噪比較好，色譜積分準確。流速的確定在固定相、流動相、柱溫、檢測波長確定的條件下，分別比較0.5mL/min、0. 6 mL/min、0. 7 mL/min、0. 8 mL/min、0. 9 mL/min 流速條件長下對分離 TTX 與雜質分離度的影響，結果表明以0. 6 mL/min流速條件下TTX與雜質能較好的分離，色譜積分準確， 檢測河飩樣品時色譜圖較好。方法評價
3. 2. 1 方法線性範圍與檢測限取純度98. 5%TTX標準品用純水配製成0. 2 μ g/mL、 0. 5μ g/mLU. 0μ g/mL、5· 0 μ g/mL、10. 0 μ g/mL、50. 0 μ g/mL、100. 0 μ g/mL 7 種濃度的標準溶液，以TTX進樣濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，化學工作站給出面積-濃度標準曲線。結果表明在0. 2 μ g/mL 100 μ g/mL的範圍內峰面積與測定濃度呈良好的線性關係(圖 1)，相關係數#=0. 99999 (圖2)。運用該方法檢測TTX標準品，當濃度為0. 135 μ g/mL時， 化學工作站計算信噪比為3. 3，濃度為0. 5 μ g/mL時，化學工作站計算信噪比為11. 7，因此， 本法的最低檢測限約為0. 135 μ g/mL (圖3)，最低定量限約為0. 5 μ g/mL (圖4)。方法重現性配製TTX樣品檢測液低、中、高三種濃度，即0.2 μ g/mL,5.0 μ g/ mL、100. 0 μ g/mL三種濃度，每個濃度做3個平行，用本方法，經連續五天的檢測，統計檢測 TTX含量與保留時間，並計算標準偏差，結果見表1。
權利要求
1.一種快速微量檢測鮮河飩血液中TTX反相離子對HPLC法，依次包括下列步驟(1) 鮮河飩魚血液樣品採集與前處理；( 配製流動相；C3)配製標準樣品；(4)設置色譜分析條件；(5)進樣檢測分析與結果判斷。
2.根據權利要求1中所述的快速微量檢測鮮河飩血液中TTXHPLC法，(1)鮮河飩魚血液樣品採集與前處理以無菌注射器吸取約50 μ L肝素鈉注射液，於解剖的河飩腹腔動脈吸取血樣ImL於1. 5mL離心管中，離心IOmin後取0. 5mL上清液過SupeLcLean LC-18柱， 所述SupeLcLean LC-18柱使用前分別用3mL甲醇、3mL 0. 2%乙酸活化，流速lmL/min ；然後用0. 75mL 0. 2%乙酸淋洗C18小柱，合併兩次收集液於1. 5mL離心管中13000rpm/min離心 lOmin，取1. OmL上清液於做好標記的樣品瓶中待分析。
3.根據權利要求1中所述的快速微量檢測鮮河飩血液中TTXHPLC法，其特徵在於所述步驟⑵配製流動相50mmol/L磷酸二氫銨、lOmmol/L庚烷磺酸鈉分別用磷酸將pH調至 4. 0後用0. 22 μ m濾膜過濾；分別量取磷酸二氫銨和庚烷磺酸鈉溶液890mL與HPLC級的乙腈IlOmL,合併混勻後超聲波脫氣。
4.根據權利要求1中所述的快速微量檢測鮮河飩血液中TTXHPLC法，其特徵在於步驟 (4)色譜條件色譜柱Agilent Poroshell 120 EC-C18 4. 6mmX 150mm2. 7 μ m ；流動相 11%乙腈-89% 50mmol/L磷酸二氫銨-10mmol/L庚烷磺酸鈉(V/V)，pH 4. 0 ；進樣量20 μ L ； 柱溫25 °C ；檢測波長200nm ；流速0. 6mL/min。
全文摘要
本發明屬於河魨魚河魨毒素檢測技術領域，具體涉及一種快速微量檢測鮮河魨血液中TTX反相離子對HPLC法，該方法包括下列步驟(1)鮮河魨魚血液樣品採集與前處理；(2)配製流動相；(3)配製標準樣品；(4)設置色譜分析條件；(5)進樣檢測分析與結果判斷。本發明方法與現行TTX檢測的國家標準等方法相比具有取樣簡便、樣品製備簡單、省時快速、檢測成本低，微量、定性定量準確度高，重現性好，無需質譜或其它高昂設備、易於基層檢測中心推廣應用等特點，為安全食用鮮河魨提供又一新的檢測手段和科學依據，必將為促進我國河魨開禁、推動河魨產業、河魨飲食文化的發展發揮重要作用。
文檔編號G01N30/02GK102445509SQ20111031750
公開日2012年5月9日 申請日期2011年10月19日 優先權日2011年10月19日
發明者何百彩, 劉子列, 尹紹武 申請人:南京師範大學, 揚中市河豚協會