副溶血弧菌外膜蛋白ompK亞單位疫苗及其製備方法

2023-05-30 18:10:56 4

專利名稱：：副溶血弧菌外膜蛋白ompK亞單位疫苗及其製備方法
技術領域：
：本發明涉及一種副溶血弧菌外膜蛋白ompK亞單位疫苗及其製備方法。
背景技術：
：副溶血弧菌(P76n'o/ara/zaemo/;^'CMS)最初引起人們的重視是因為該菌是一種重要的人類腸道病原，常由食入未經烹煮的海產品而導致感染，出現嘔吐、腹瀉等症狀。近年來，國內養殖的多種海水經濟動物受到該菌的危害，包括大黃魚、牙鮃、對蟲下、蟹類和養殖貝類等，導致嚴重的損失。目前普遍認為該菌為海水環境中的常在菌，是養殖動物的條件性病原。早期的研究中已經觀察到了該菌主要外膜蛋白的免疫原性，但因為人類可以通過避免吃入不潔的水產品有效地預防該菌的傳染，因此，與霍亂弧菌不同，並未開展針對該菌的免疫預防研究。近幾年，國內對水產動物的弧菌病原及弧菌病的免疫預防研究已成為一個熱點，部分學者對該菌外膜蛋白的組成及免疫反應性開展了初步研究，測試了對該菌脂多糖及全菌疫苗的免疫保護性，但有關該菌保護性抗原方面的系統研究尚未開展，該菌外膜蛋白對魚類的免疫原性也尚未明確。在1995年的時候，Inoue等研究者在弧菌中發現一種分子量約28kDa的外膜蛋白，該蛋白自然突變缺失的副溶血弧菌菌株對噬菌體KVP-40變得不敏感，從而確認該蛋白為此噬菌體的受體蛋白，所以命名為ompK。該蛋白在弧菌中廣泛存在，針對該蛋白的免疫血清可以識別來源於多種弧菌的分子量相近的蛋白條帶，而與對噬菌體KVP-40是否敏感並無關係。Inoue等在1995年己克隆到副溶血弧菌ompK的基因，其ORF全長792bp，編碼的蛋白分子量約為28kDa,序列分析表明該蛋白是弧菌種類中獨有的一種外膜蛋白。在腸桿菌科種類中，與ompK最接近的蛋白為Tsx孔蛋白，為核苷酸轉運蛋白，也可能作為腸桿菌素或部分噬菌體的受體蛋白。本實驗室對哈維氏弧菌(K/^rv宇')的ompK已開展了部分研究，該蛋白的基因序列與副溶血弧菌同源蛋白高度相似，為一種熱修飾性的孔蛋白，可能在物質運輸方面具有重要的生物功能；已驗證了該蛋白在大黃魚中具有良好的免疫原性。弧菌病是危害養殖海水魚類的重要感染性疾病，尤其在高溫季節，由副溶血弧菌導致的弧菌病常造成嚴重的死亡。養殖生產上，目前由於對出口水產品中抗生素殘留的嚴格檢測及農業部漁業司對多數抗生素類藥物的禁用規定，老百姓基本無藥可用，發病了往往只好聽之任之，損失慘重。以主動免疫的方法針對性地預防疾病的發生，為海水養殖業受弧菌病嚴重侵害的窘境提供了一條解決措施，已成為目前迫切需要解決的難題。
發明內容本發明的目的是提供一種副溶血弧菌外膜蛋白ompK亞單位疫苗及其製備方法。副溶血弧菌重組ompK蛋白亞單位疫苗為轉化了重組原核表達質粒pET30a-ompK的大腸桿菌表達的重組蛋白ompK經純化後的PBS溶液，其濃度為0.25-0.5mg/ml。所述的原核表達質粒pET30a-ompK為以pET30a作為原核表達載體，含有以下編碼序列的ompK基因的重組載體，該重組載體的保存號為CGMCCNa2153;GCAGATTACTCTGACGGCGATATCCACAAAAACGATTACA40AGTGGATGCAATTTAACCTAATGGGTGCATTCAACGAGAA80AGGTTATGCTGAATCTTCTCATGATTACCTAGAGATGGAA120TTCGGCGGTCGCTCTGGTATTTTCGATCTTTACGGTTACG160ATGTCTCTAGACGCGCTAACTGGTAAAGACCTATCTTTCG280GTCCTGTTCAAGAGCTATACGTTTCTACTCTAATGGAGTG320GGGCGGTAACTCTGACGTTAACTCTCAAAAAATCGGTCTA360GGTTCTGACGTGATGGTACCTTGGTTAGGCAAAATCGGCC400TAAACCTATACGGTACTTACGATGGCAACAAGAAAGATTG440TTCTTCTTCGAGAACGGTTCATTCATTTCTTACCAAGGTT520ACATCGATTACCAATTCGGTATGGATGACGACAAAGGTAA560CAAGTTCAACACTACAGCGTCTAACGGCGGTGCAATGTTC600AACGGTATCTACTGGCACTCTGACCGCTTTGCAGTTGGTT640CGGCGAAGCTCTACCATGGGGTCACAAACCAGAATCTTCT720GGTGCAGGTCACTACATCGCAGTAACTTACAAGTTCTAA759長度為759個核苷酸，類型為核苷酸，拓撲結構為線型，鏈性為單鏈，全長為ompK蛋白成熟肽編碼區。所述的以pET30a作為原核表達載體，含有權利要求1所述的原核表達質粒pET30a-ompK的水溶液濃度為l-20pg^1。所述的原核表達質粒pET30a-ompK在大腸桿菌中表達的副溶血弧菌ompK外膜蛋白，重組ompK外膜蛋白所佔重量比為0.25-0.5%。。副溶血弧菌重組ompK蛋白亞單位疫苗的製備方法包括如下步驟1)首先提取副溶血弧菌基因組DNA，設計引物P1即5，-GCAGCACAGATTGCGTGTTC-3，和P2即5，-GCAAGGATAATGAGGGGAGA-3'，PCR擴增ompK全基因，然後將ompK全基因序列接連接於pGEM-TeasyVector;2)重新設計引物P3(5，-CG^O^IffiGCAGATTACTCTGACGGCGATAT-3，)和P4(5，-CCCAA2CIITTAGAACTTGTAAGTTACTGCGA-3，)，PCR擴增ompK成熟肽編碼序列DNA，將ompK成熟肽編碼序列克隆入pET30a，構建成pET30a-ompK原核表達質粒；3)重組質粒pET30a-ompK轉化大腸桿菌BL21，在IPTG誘導下表達目標蛋白。表達蛋白經尿素法初步純化後再經鎳柱親和層析法進一步純化得到重組蛋白。所述的首先提取副溶血弧菌基因組DNA，設計引物Pl即5，-GCAGCACAGATTGCGTGTTC-3，禾口P2即5，誦GCAAGGATAATGAGGGGAGA-3'，PCR擴增ompK全基因，然後將ompK全基因序列接連接於pGEM-TeasyVector:(1)取超低溫凍存的副溶血弧菌甘油菌一支，室溫融化後接種於Zobell2216E培養基，28。C振蕩培養12h以上；取1.5mL菌液於Ependoff離心管中，5000r/min，離心lmin，棄上清；滅菌(1膽20懸浮細菌，6000r/min，離心4min，洗滌兩次；加入35|止ddH20和35pLTZ溶液,-2(TC放置30-40min;沸水浴10min;冰浴10min;5000r/min，離心5min，收集上清作為PCR模板；(2)設計引物P1即5，—GCAGCACAGATTGCGTGTTC-3，和P2艮卩5，-GCAAGGATAATGAGGGGAGA-3，，PCR擴增ompK全基因條件為94°C預變性5min，9fC變性30s，52.7。C退火30s，72'C延伸60s，72。C延伸10min，共30個循環。擴增出大約950bp的特異性片段，PCR產物回收後，直接克隆於pGEM-TeasyVector，將重組質粒命名為T-ompK。所述的重新設計引物P3即5，~CGGGATCCGCAGATTACTCTGACGGCGATAT-3，，P4即5，-CCCAAGCTTTTAGAACTTGTAAGTTACTGCGA-3，，PCR擴增ompK成熟肽編碼序列DNA，將ompK成熟肽編碼序列克隆入pET30a，構建成pET30a-ompK原核表達質粒(1)以在線軟體SingalP預測ompK蛋白的信號肽切割位點為N端第20個和第21個胺基酸殘基之間，則成熟肽編碼序列為自起始密碼子後第61個核苷酸序列開始至終止密碼子，在此兩端重新設計引物P3即5，-CGGGATCCGCAGATTACTCTGACGGCGATAT-3，P4即5、CCCAAGCTTTTAGAACTTGTAAGTTACTGCGA-3，引物兩端分別引入酶切位點5am/n和歷V^in，以T-ompK為模版，P3和P4為引物，按以下PCR循環程序擴增ompK成熟肽編碼序列DNA:94。C預變性5min，94'C變性30s，51.9。C退火30s，72。C延伸60s，72。C延伸10min，共30個循環；(2)低熔點膠回收ompK成熟肽編碼基因，S"w7n和歷"^ni雙酶切後，直接克隆入pET30a的^W7//I和/f/Win多克隆位點處，構建成pET30a-ompK原核表達質粒。所述的重組質粒pET30a-ompK轉化大腸桿菌BL21，在IPTG誘導下表達。表達蛋白經初步純化後再經鎳柱親和層析法進一步純化得到重組蛋白(1)重組質粒pET30a-ompK轉化CaCb法製備的大腸桿菌BL21,經鑑定的陽性克隆pET30a-ompK在含有50ug/ml卡那黴素的LB液體培養基中培養至OD值達0.5-0.6,加入IPTG至終濃度為1.0mmol/L,37'C誘導表達3-4小時，離心收集菌細胞，部分在冰浴條件下超聲波裂解菌體，功率300W，直至溶液變為半透明菌，1500化離心30min，收集上清液和沉澱，蛋白以不溶的包涵體形式存在；(2)包涵體的純化以尿素法進行，經初步純化的包涵體再經鎳柱親和層析法進一步純化得到重組蛋白。所述的經初步純化的包涵體再經鎳柱親和層析法進一步純化得到重組蛋白為收集經IPTG誘導的培養物，用適量PBS重懸沉澱，冰浴條件下超聲波裂解細菌，功率300W，直至溶液變為半透明，1500xg離心30min,收集包涵體沉澱，將包涵體沉澱用緩衝液I、II、III分別超聲洗滌一次，緩衝液I:50MmTris-HCl，pH8.0;2mMEDTA,1OOmMNaCl,0.5%TritonX-100(V/V)，4M尿素；緩衝液II:50MmTris-HCl，pH8.0;2mMEDTA,lOOmMNaCl,3%TritonX-100(V/V);緩衝液m:100MmTris-HCl，pH8.0;100mM巰基乙醇，2mMEDTA及脫氧膽酸鈉，1500xg離心30min,收集包涵體沉澱，然後用含高濃度尿素的緩衝液m懸浮沉澱，室溫放置30min，1500xg離心30min，留上清。將溶解後的蛋白質適當稀釋，磁力攪拌，以pH7.4的PBS低溫透析48h,中途勤換透析液，因重組蛋白N端存在6個連續的組氨酸His序列，用鎳螯合的瓊脂糖柱Ni-IDA進行親合純化，首先將初步純化的包涵體蛋白溶液以0.45pm孔徑的濾器過濾，加到平衡好的Ni-IDA上，以含50mMPB,200mMNaCl，pH7.8的緩衝液A洗3-5個柱體積；然後以含有50mMPB，200mMNaCl，10-400mM咪唑，pH7.8的緩衝液B各洗3個柱體積，釋放重組蛋白，重組蛋白的純化率通過SDS-PAGE測定，包涵體蛋白上樣到鎳柱後，掛柱率較高，PBS和低濃度的咪唑洗脫液中僅有少量目的蛋白洗出;在咪唑濃度300mmol/L以上時從柱上洗脫下來，濃縮後得到單一的蛋白，純化率在95%以上。本發明提供的副溶血弧菌外膜蛋白ompK亞單位疫苗作為魚類弧菌病疫苗的優勢表現在(1)原核表達系統生產的重組ompK蛋白，不僅保留了天然蛋白的免疫原性，而且製備成本相對低廉；(2)ompK蛋白在不同血清型的同種菌株及不同弧菌種類中較為保守，能夠抵抗多種血清型副溶血弧菌及多種弧菌致病菌的侵襲，達到使用一種疫苗抵抗多種病原的目的；(3)重組ompK蛋白組成單一，作為疫苗使用不存在對魚類具有毒副作用的成份，使用過程安全簡單。圖l是本發明使用PCR擴增出包含819bp的副溶血弧菌zj2003株ompK全基因的條帶圖2是本發明提供的副溶血弧菌zj2003株ompKpGEM-T載體重組質粒T-ompK的酶切鑑定圖3是本發朋提供的副溶血弧菌zj2003株ompKpGEM-T載體重組質粒T-ompK的構建圖4是本發明提供的副溶血弧菌zj2003株ompK全基因的核苷酸序列；圖5是本發明使用PCR擴增出759bp的副溶血弧菌zj2003株ompK蛋白成熟肽編碼序列的條帶圖6是本發明提供的副溶血弧菌zj2003株ompK重組質粒pET30a-ompK的酶切鑑定圖7是本發明提供的副溶血弧菌zj2003株ompK重組質粒pET30a-ompK的構建圖8是本發明提供的的副溶血弧菌zj2003株ompK表達產物的SDS-PAGE檢測圖9是本發明提供的的副溶血弧菌zj2003株ompK包涵體重組蛋白經鎳柱純化過程產物的SDS-PAGE檢測圖10是本發明採用ELISA法對重組ompK蛋白免疫後大黃魚的血清抗體水平檢測圖ll是本發明提供的的重組ompK蛋白免疫4周後採用4株不同來源的副溶血弧菌攻擊對大黃魚的免疫保護率數據圖。具體實施例方式本發明所要解決的技術問題是提供一種副溶血弧菌亞單位疫苗的製備方法，其成本經濟，便於推廣應用。為此，本發明採用以下方案它為以下重組蛋白(副溶血弧菌ompK)的水溶液，其濃度為250-500iig/ml，由一含原核表達質粒(pET30a-ompK)的大腸桿菌五sc/^n'c/w'aco/fBL21(DE3)菌株表達獲得。該原核表達質粒為以pET30a作為表達載體，含有以圖1的副溶血弧菌zj2003株ompK成熟肽編碼序列的重組載體，該重組載體的保存號為CGMCCNo.2153，保存日期為2007年9月4日，該序列全長759個核苷酸，類型為核苷酸，拓撲結構為線型，鏈性為單鏈，全長為去除信號肽後的成熟肽編碼區。雖然副溶血弧菌ompK的基因早在1995年已被克隆到，但對該蛋白生物功能和免疫原性的研究比較滯後。本發明對副溶血弧菌zj2003株ompK基因的分子生物學進行了研究，克隆出zj2003株ompK基因、構建了該基因的原核表達質粒，在此基礎上，大量表達和純化重組蛋白，進一步對其在大黃魚中的免疫原性進行了較深入的研究，不僅有助於了解該蛋白的生物學功能，而且對亞單位疫苗、複合疫苗等魚用新型疫苗的研製等都具有十分重要的理論和應用價值。本發明中原核表達質粒以pET30a作為表達載體，表達的重組蛋白N端攜帶6個His標籤，在重組標籤和目標序列之間含有蛋白酶切割位點(凝血酶和腸激酶)，可以在純化後選擇性去除重組標籤，便於下遊純化；帶有由宿主細胞提供的T7RNA聚合酶驅動的T7早期啟動子系統，插入基因的表達效率很高，經IPTG誘導後數小時內重組蛋白的表達量可達總蛋白含量的50%以上。本發明提供的副溶血弧菌外膜蛋白ompK亞單位疫苗可應用於預防包括副溶血弧菌引起的魚類弧菌病，也有可能預防溶藻弧菌(Ka/g/wo/;;&"s)、哈維氏弧菌等數種同源性較高的致病弧菌引起的魚類弧菌病。本發明提供的原核表達質粒(pET30a-ompK)保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.2153。實施例l本實施例描述了本發明提供的副溶血弧菌zj2003株ompK基因的獲得方法，包括以下步驟(1)副溶血弧菌基因組DNA的製備取超低溫凍存的副溶血弧菌甘油菌一支，室溫融化後接種於Zobdl2216E培養基，28"C振蕩培養12h以上；取1.5mL菌液於Ependof璃心管中，5000r/min，離心lmin，棄上清；滅菌ddH20懸浮細菌，6000r/min，離心4min，洗滌兩次；加入35^iLddH20和35^LTZ溶液，-20。C放置30-40min;沸水浴10min;冰浴10min;5000r/min，離心5min，收集上清作為PCR模板。TZ溶液的配方4%TritonX-100,5.0g/LNaN3,25匪ol/LTris-HCl，pH8.0。(2)PCR擴增ompK全基因已發表的副溶血弧菌標準菌株RIMD2210633基因組中ompK讀碼框(ORF)兩側序列設計一對引物Pl(5'-GCAGCACAGATTGCGTGTTC-3，)P2(5，-GCAAGGATAATGAGGGGAGA-3，)引物由上海英駿生物技術公司合成。經優化的循環條件為94t:預變性5min，94。C變性30s，52.7"退火30s，72"C延伸60s，72-C延伸10min，共30個循環。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑑定。結果表明副溶血弧菌zj2003株基因組DNA經PCR後，即可擴增出大約950bp的特異性片段(見附圖l，附圖l中l表示陰性對照，2，3表示950bp大小的包含ompK全基因的條帶；M表示DNAMarkerDL2000)，PCR產物回收後，直接克隆於pGEM-TeasyVector(可購自Promega公司),將重組質粒命名為T-ompK(見附圖2，附圖2中l表示A^I單酶切重組質粒T-ompK結果，2表示空載體酶切對照，M表示DNAMarker)。用iVoZI分別進行單酶切，可見大小分別為3.0kb和950bp左右的條帶(見附圖2)。(3)OmpK全基因序列的亞克隆和序列獲得低熔點膠回收目的片段，利用T-A克隆策略直接連接於pGEM-TeasyVector(見附圖3),連接產物轉化大腸桿菌DH5(x感受態細胞，培養於含有Amp、IPTG和X-gal(均可購自Gibco公司)的LB平板，挑取白色菌落進行PCR鑑定和酶切鑑定。序列鑑定由上海英駿生物技術公司進行。序列測定結果表明克隆的ompK基因開放閱讀框ORF全長共819個核苷酸，編碼273個胺基酸，其胺基酸序列如附圖4所示。實施例2本實施例描述了ompK成熟肽編碼序列原核表達質粒pET30a-ompK的獲得方法，其步驟包括(1)OmpK成熟肽編碼序列的擴增以在線軟體SingalP預測ompK蛋白的信號肽切割位點為N端第20個和第21個胺基酸殘基之間，則成熟肽編碼序列為自起始密碼子後第61個核苷酸序列開始至終止密碼子，在此兩端重新設計引物(全長共759bp，編碼253個胺基酸)P3(5'-CGGGATCCGCAGATTACTCTGACGGCGATAT-3，)P4(5，-CCCAAGCTTTTAGAACTTGTAAGTTACTGCGA誦3，)引物兩端分別引入酶切位點&m/n(P3劃線處)和/^'"JI11(P4劃線處)，弓i物在上海英駿生物技術公司合成。以T-ompK為模版，P3和P4為引物，按以下PCR循環程序擴增ompK成熟肽編碼序列DNA:94"C預變性5min，94。C變性30s，51.9°C退火30s，72。C延伸60s，72。C延伸10min，共30個循環。PCR產物用P/。瓊脂糖凝膠電泳鑑定。(2)OmpK成熟肽編碼序列原核表達質粒pET30a-ompK的構建低熔點膠回收759bp的ompK成熟肽編碼基因，5aw/fI和歷V^III雙酶切後，直接克隆入pET30a的Bflw/7I和州7^in多克隆位點處。結果表明將包括759bp的ompK成熟肽編碼基因(見附圖5，附圖5中1表示陰性對照、2表示759bp的目的條帶，3表示DNAMarker)克隆入pET30a，構建成pET30a-ompK原核表達質粒(見附圖7)，&附//1和7//"^11雙酶切能切出5.41^和760bp左右的條帶，PCR能擴增出約760bp的條帶(見附圖6，附圖6中1表示空載體對照，2顯示萬am/n和歷m/in雙酶切的目的片段，M表示DNAMarker)實施例3本實施例描述了ompK蛋白的獲得方法。包括以下步驟OmpK成熟肽編碼序列原核表達質粒pET30a-ompK在大腸桿菌中的表達重組質粒pET30a-ompK轉化CaCl2法製備的大腸桿菌BL21(DE3)，經鑑定的陽性克隆pET30a-ompK在含有卡那黴素(50ug/ml)的LB液體培養基中培養至OD值達0.5-0.6,加入IPTG至終濃度為1.0mmol/L，37"C誘導表達3-4小時，離心收集菌細胞，部分在冰浴條件下超聲波裂解菌體，功率300W，直至溶液變為半透明菌，1500xg離心30min，收集上清液和沉澱；取菌細胞、菌細胞超聲破碎後的沉澱與上清，加入5x上樣緩衝液，10(TC煮沸5min，進行SDS-PAGE電泳鑑定。結果如圖8所示，轉化了pET30a-ompK的大腸桿菌BL21總蛋白中，在預期分子量33kDa位置處出現了特別濃的新增條帶，而僅轉化了原始pET30a的對照菌株沒有此種現象，表明了重組蛋白得到表達；目的蛋白條帶在菌細胞和超聲波破碎沉澱中均觀察到，而上清液中沒有，表明了該蛋白以不溶的包涵體形式表達(見附圖8，M表示蛋白marker;泳道l是pET30a-ompK轉染的BL21總蛋白；泳道2是pET30a轉染的對照菌細胞；泳道3是重組蛋白經鎳柱純化後的產物；泳道4和5分別為pET30a-ompK轉染的BL21菌體超聲波破碎沉澱物和上清)(2)重組蛋白的純化包涵體的純化以尿素法進行，經初步純化的包涵體再經鎳柱親和層析法進一步純化得到重組蛋白。主要步驟如下收集經IPTG誘導的培養物，用適量PBS重懸沉澱。冰浴條件下超聲波裂解細菌，功率300W，直至溶液變為半透明。1500xg離心30min,收集包涵體沉澱。將包涵體沉澱用緩衝液I、II、III分別超聲洗滌一次。緩衝液I:50MmTris-HCl(pH8.0),2mMEDTA,100mMNaCl，0.5%TritonX-100(V/V),4M尿素；緩衝液II:50MmTris-HCl(pH8.0)，2mMEDTA，100mMNaCl，3%TritonX-100(V/V);緩衝液III:100MmTris誦HCl(pH8.0)，100mM巰基乙醇，2mMEDTA及脫氧膽酸鈉。1500xg離心30min,收集包涵體沉澱，然後用含高濃度尿素的緩衝液in懸浮沉澱，室溫放置30min,1500xg離心30min，留上清。將溶解後的蛋白質適當稀釋，磁力攪拌，以PBS(pH7.4)低溫透析48h,中途勤換透析液。因重組蛋白N端存在6個連續的組氨酸His序列，用鎳螯合的瓊脂糖柱Ni-IDA(卓冠生物技術公司，北京)進行親合純化，純化步驟依照產品說明書進行。首先將初步純化的包涵體蛋白溶液以0.45,孔徑的濾器過濾，加到平衡好的Ni-IDA上，以緩衝液A(50mMPB，200mMNaCl,pH7.8)洗3-5個柱體積；然後以含有梯度濃度咪唑的緩衝液B(50mMPB,200mMNaCl，10-400mM咪唑，pH7.8)各洗3個柱體積，釋放重組蛋白。重組蛋白的純化率通過SDS-PAGE測定。結果如附圖9，圖中l表示經尿素法得到的包涵體蛋白，2表示穿透液，3表示PBS洗脫產物，4為50mmol/L咪唑濃度緩衝液洗脫產物，5為300mmol/L咪唑濃度緩衝液洗脫產物，M表示蛋白分子量標準。包涵體蛋白上樣到鎳柱後，掛柱率較高，PBS和低濃度的咪唑洗脫液中僅有少量目的蛋白洗出；在咪唑濃度300mmol/L以上時從柱上洗脫下來。濃縮後得到單一的蛋白，純化率在95%以上。實施例4本實施例描述了本發明提供的ompK蛋白對大黃魚的免疫原性，免疫接種該蛋白賦予了試驗魚對副溶血弧菌不同來源株攻擊的有效保護。(1)ompK免疫激發試驗魚的血清抗體水平逐漸升高實驗用l+齡大黃魚，購自象山港養殖網箱，平均體重為120士10g。選擇遊動活潑，體表無損傷的健康魚，在3mx2mx2m的水泥池中充氣暫養，一周後開始試驗。每組魚40尾。純化的重組蛋白以0.01MPBS(pH7.4)調整濃度至0.5mg/ml，每尾腹腔注射0.2ml。試驗期間投餵海水魚類溼顆粒餌料，投餌率5%，每日換水清汙一次。在免疫後4-8周，從每組中隨機取5尾試驗魚，採取血清，4。C保存，檢測抗體效價。ELISA檢測按照常規方法進行。在預備試驗中以方陣法分別測定重組ompK的合適包被濃度為5ug/ml，包被到96孔酶標板。大黃魚抗血清以2倍系列稀釋度加到各孔中，初始稀釋度為1:8，每個稀釋度加並排的兩孔作為重複；第12孔加100uLPBS作為空白對照。以兔抗大黃魚免疫球蛋白血清(稀釋度1:500)和HRP標記的羊抗兔IgG(稀釋度1:1000，鼎國生物，北京)檢測結合到抗原上的特異性抗體。以鄰苯二胺OPD顯色緩衝液顯色30min後，力Q2MH2S04中止反應。在酶標儀(Thermolabsystems)492nm波長處讀取OD值。試驗血清吸光度值(P"待檢血清OD值-空白OD值，陰性對照血清吸光度值(N"陰性血清OD值-空白OD值，當兩者比值P/N〉2.1時，則判斷為陽性；陽性孔的最大稀釋度即為抗體效價。以Student試驗在置信度水平PO.05計算顯著性差異。免疫後4-8周,重組蛋白ompK免疫組產生了顯著的特異性抗體效價(圖IO)。試驗魚中ompK特異性的抗體效價在測試期間持續上升，在第8周試驗結束時，抗體效價達到log228°以上。而陰性對照組PBS注射組在同期內抗體效價始終未超過10&22(>。按方差分析法對抗體效價水平數據進行統計學處理，顯著水平為P<0.05。結果提示了ompK注射免疫大黃魚能夠引起顯著的體液免疫應答。(2)OmpK免疫提供了對不同來源的副溶血弧菌人工攻擊的有效保護在免疫後第4周(28d)，從上述試驗魚中每組隨機取10尾，每尾腹腔注射0.2mLlxl(A:ells/mL的副溶血弧菌zj2003、VP1、VP2、VP3株活菌懸液(試驗菌株zj2003株自象山港養殖大黃魚分離，菌株VPl-3購自中科院微生物所菌種保藏中心)；另從未免疫組中取10尾魚注射相同劑量的滅菌PBS作為健康對照組，觀察14d，記錄試驗魚的發病與死亡情況，對瀕死魚進行無菌解剖，分離病原菌。按卡方分析法對死亡率數據進行統計學處理，顯著水平為P〈0.05。免疫保護率(relativepercentsurvival,RPS)的計算參照Amend(1981)，艮卩RPS=(1-免疫組死亡率/對照組死亡率)x100表1經不同來源副溶血弧菌菌株人工攻擊後14天內試驗大黃魚的總死亡率和免疫保護率(RPS)tableseeoriginaldocumentpage16*表示與對照組相比存在顯著性差異，P<0.05。結果見表l所示，ompK重組蛋白免疫組經不同來源的副溶血弧菌人工攻擊後，在14天內出現了一定的死亡，死亡率達10-20%，同期對照組死亡率則高達80-100%，顯著高於免疫組。重組蛋白免疫組免疫保護率(RPS)達75-卯％，獲得了有效保護。部分發病魚出現體表充血發紅的症狀，從瀕死魚肝、腎中重新分離到了副溶血弧菌，確認死於攻擊引起的感染。(3)人工感染存活魚的血清在免疫印跡中識別重組的ompK蛋白以亞致死濃度的副溶血弧菌zj003人工感染健康的未免疫大黃魚，2周後採取存活魚血清作為一抗識別重組的外膜蛋白，如圖11所示，重組ompK蛋白與抗血清產生了反應，在NC膜上呈現出清晰的著色條帶，表明感染副溶血弧菌的大黃魚能夠產生針對ompK的抗體。綜合上述研究結果表明，以副溶血弧菌重組外膜蛋白ompK免疫大黃魚，魚體產生了較強的免疫應答，激發了保護性免疫。並且，免疫印跡進一步表明，感染副溶血弧菌的魚體產生了ompK蛋白的抗體，即在自然免疫中ompK也是暴露於菌體表面的，並為魚體免疫系統識別，因此是副溶血弧菌的重要保護性抗原。同時，研究結果業己表明，雖然上述4株不同來源的副溶血弧菌菌株主要外膜蛋白條帶的組成存在差異，但均擁有分子量約為28kDa(對應於ompK)的主要條帶。因此，OmpK是4菌株的共同保護性抗原。本研究結果證實，該外膜蛋白可作為亞單位疫苗免疫大黃魚對抗副溶血弧菌的感染；同時，由於該蛋白在弧菌屬種類中廣泛分布，胺基酸序列較為保守，也可能作為亞單位疫苗對抗多種弧菌感染，具有良好的開發前景。權利要求1.一種副溶血弧菌重組ompK蛋白亞單位疫苗，其特徵在於其為轉化了重組原核表達質粒pET30a-ompK的大腸桿菌表達的重組蛋白ompK經純化後的PBS溶液，其濃度為0.25-0.5mg/ml。2.如權利要求1所述的一種副溶血弧菌重組ompK蛋白亞單位疫苗，其特徵在於所述的原核表達質粒pET30a-ompK為以pET30a作為原核表達載體，含有以下編碼序列的ompK基因的重組載體，該重組載體的保存號為CGMCCNo.2153;GCAGATTACTCTGACGGCGATATCCACAAAAACGATTACA40AGTGGATGCAATTTAACCTAATGGGTGCATTCAACGAGAA80AGGTTATGCTGAATCTTCTCATGATTACCTAGAGATGGAA120TTCGGCGGTCGCTCTGGTATTTTCGATCTTTACGGTTACG160ATGTCTCTAGACGCGCTAACTGGTAAAGACCTATCTTTCG280GTCCTGTTCAAGAGCTATACGTTTCTACTCTAATGGAGTG320GGGCGGTAACTCTGACGTTAACTCTCAAAAAATCGGTCTA360GGTTCTGACGTGATGGTACCTTGGTTAGGCAAAATCGGCC400TAAACCTATACGGTACTTACGATGGCAACAAGAAAGATTG440TTCTTCTTCGAGAACGGTTCATTCATTTCTTACCAAGGTT520ACATCGATTACCAATTCGGTATGGATGACGACAAAGGTAA560AACGGTATCTACTGGCACTCTGACCGCTTTGCAGTTGGTT640ACGGTCTAAAACTTTACAAAGACGTGTACGGTTTCAAAGA680CGGCGAAGCTCTACCATGGGGTCACAAACCAGAATCTTCT720GGTGCAGGTCACTACATCGCAGTAACTTACAAGTTCTAA759長度為759個核苷酸，類型為核苷酸，拓撲結構為線型，鏈性為單鏈，全長為ompK蛋白成熟肽編碼區。3.如權利要求1所述的一種副溶血弧菌重組ompK蛋白亞單位疫苗，其特徵在於所述的以pET30a作為原核表達載體，含有權利要求1所述的原核表達質粒pET30a-ompK的水溶液濃度為l-20jLig/pl。4.如權利要求1所述的一種副溶血弧菌重組ompK蛋白亞單位疫苗，其特徵在於所述的原核表達質粒pET30a-ompK在大腸桿菌中表達的副溶血弧菌ompK外膜蛋白，重組ompK外膜蛋白所佔重量比為0.25-0.5%。。5.—種如權利要求l所述的副溶血弧菌重組ompK蛋白亞單位疫苗的製備方法，其特徵在於包括如下步驟1)首先提取副溶血弧菌基因組DNA,設計引物P1即5，-GCAGCACAGATT-GCGTGTTC-3，和P2艮卩5，-GCAAGGATAATGAGGGGAGA-3，，PCR擴增ompK全基因，然後將ompK全基因序列接連接於pGEM-TeasyVector;2)重新設計弓I物P3即5，-CGGGATCCGCAGATTACTCTGACGGCGATAT-3，和P4即5，-CCCAAGCTTTTAGAACTTGTAAGTTACTGCGA-3',PCR擴增ompK成熟肽編碼序列DNA，將ompK成熟肽編碼序列克隆入pET30a，構建成pET30a-ompK原核表達質粒；3)重組質粒pET30a-ompK轉化大腸桿菌BL21，在IPTG誘導下表達目標蛋白。表達蛋白經尿素法初步純化後再經鎳柱親和層析法進一步純化得到重組蛋白。6.如權利要求5所述的一種副溶血弧菌重組ompK蛋白亞單位疫苗的製備方法，其特徵在於所述的首先提取副溶血弧菌基因組DNA，設計引物P1即5'-GCAGCACAGATTGCGTGTTC-3，和P2即5，-GCAAGGATAATGAGGGGAGA-3'，PCR擴增ompK全基因，然後將ompK全基因序列接連接於pGEM-TeasyVector:(1)取超低溫凍存的副溶血弧菌甘油菌一支，室溫融化後接種於Zobdl2216E培養基，28。C振蕩培養12h以上；取1.5mL菌液於Ependoff離心管中，5000r/min，離心lmin,棄上清；滅菌ddH20懸浮細菌，6000r/min，離心4min，洗滌兩次；加入35^iLddH20和35^LTZ溶液,-2(TC放置30-40min;沸水浴10min;冰浴10min;5000r/min，離心5min，收集上清作為PCR模板；(2)設計引物P1即5'-GCAGCACAGATTGCGTGTTC-3，和P2艮卩5，-GCAAGGATAATGAGGGGAGA-3，，PCR擴增ompK全基因條件為94"C預變性5min，94。C變性30s，52.7。C退火30s，72。C延伸60s，72。C延伸10min，共30個循環。擴增出大約950bp的特異性片段，PCR產物回收後，直接克隆於pGEM-TeasyVector，將重組質粒命名為T-ompK。7.如權利要求5所述的一^f^副溶血弧菌重組ompK蛋白亞單位疫苗的製備方法，其特徵在於所述的重新設計一對引物P3即5，-CGGGATCCGCAGATTACTCTGACGGCGATAT-3，，P4艮卩5，國CCCAAGCTTTTAGAACTTGTAAGTTACTGCGA-3，，PCR擴增ompK成熟肽編碼序列DNA，將ompK成熟肽編碼序列克隆入pET30a，構建成pET30a-ompK原核表達質粒(1)以在線軟體SingalP預測ompK蛋白的信號肽切割位點為N端第20個和第21個胺基酸殘基之間，則成熟肽編碼序列為自起始密碼子後第61個核苷酸序列開始至終止密碼子，在此兩端重新設計引物P3即5，《GGGATCCGCAGATTACTCTGACGGCGATAT-3,P4即5，-CCCAAGCTTTTAGAACTTGTAAGTTACTGCGA-3'引物兩端分別引入酶切位點肋m/n和歷"^in，以T-ompK為模版，P3和P4為引物，按以下PCR循環程序擴增ompK成熟肽編碼序列DNA:94"C預變性5min，9fC變性30s，51.9X:退火30s，72。C延伸60s，72。C延伸10min，共30個循環；(2)低熔點膠回收ompK成熟肽編碼基因，5ami/I和歷"^III雙酶切後，直接克隆入pET30a的^wWI和歷^III多克隆位點處，構建成pET30a-ompK原核表達質粒。8.如權利要求5所述的一種副溶血弧菌重組ompK蛋白亞單位疫苗的製備方法，其特徵在於所述的重組質粒pET30a-ompK轉化大腸桿菌BL21，在IPTG誘導下表達。表達蛋白經尿素法初步純化後再經鎳柱親和層析法進一步純化得到重組蛋白(1)重組質粒pET30a-ompK轉化CaCl2法製備的大腸桿菌BL21，經鑑定的陽性克隆pET30a-ompK在含有50ug/ml卡那黴素的LB液體培養基中培養至OD值達0.5-0.6,加入IPTG至終濃度為1.0mmol/L,37。C誘導表達3-4小時，離心收集菌細胞，部分在冰浴條件下超聲波裂解菌體，功率300W，直至溶液變為半透明菌，1500xg離心30min，收集上清液和沉澱，蛋白以不溶的包涵體形式存在；(2)包涵體的純化以尿素法進行，經初步純化的包涵體再經鎳柱親和層析法進一步純化得到重組蛋白。9.如權利要求8所述的一種副溶血弧菌重組ompK蛋白亞單位疫苗的製備方法，其特徵在於所述的經初步純化的包涵體再經鎳柱親和層析法進一步純化得到重組蛋白為收集經IPTG誘導的培養物，用適量PBS重懸沉澱，冰浴條件下超聲波裂解細菌，功率300W，直至溶液變為半透明，1500xg離心30min,收集包涵體沉澱，將包涵體沉澱用緩衝液I、H、III分別超聲洗滌一次，緩衝液I:50MmTris-HCl，pH8.0;2mMEDTA,1OOmMNaCl,0.5%TritonX-l00(V/V)，4M尿素；緩衝液II:50MmTris-HCl，pH8.0;2mMEDTA，100mMNaCl,3%TritonX-100(V/V);緩衝液III:100MmTris-HCl，pH8.0;100mM巰基乙醇，2mMEDTA及脫氧膽酸鈉，1500xg離心30min，收集包涵體沉澱，然後用含高濃度尿素的緩衝液ni懸浮沉澱，室溫放置30min，1500xg離心30min，留上清。將溶解後的蛋白質適當稀釋，磁力攪拌，以pH7.4的PBS低溫透析48h,中途勤換透析液，因重組蛋白N端存在6個連續的組氨酸His序列，用鎳螯合的瓊脂糖柱Ni-IDA進行親合純化，首先將初步純化的包涵體蛋白溶液以0.45jim孔徑的濾器過濾，加到平衡好的M-IDA上，以含50mMPB，200mMNaCl，pH7.8的緩衝液A洗3-5個柱體積；然後以含有50mMPB,200mMNaCl，10-400mM咪唑，pH7.8的緩衝液B各洗3個柱體積，釋放重組蛋白，重組蛋白的純化率通過SDS-PAGE測定，包涵體蛋白上樣到鎳柱後，掛柱率較高，PBS和低濃度的咪唑洗脫液中僅有少量目的蛋白洗出；在咪唑濃度300mmol/L以上時從柱上洗脫下來，濃縮後得到單一的蛋白，純化率在95°/。以上。全文摘要本發明公開了一種副溶血弧菌外膜蛋白ompK亞單位疫苗及其製備方法。疫苗為轉化了重組原核表達質粒pET30a-ompK的大腸桿菌經誘導表達的重組蛋白ompK經純化後的PBS溶液，其濃度為0.25-0.5mg/ml。方法的步驟為1)副溶血弧菌全基因組的抽提、外膜蛋白ompKDNA全長和成熟肽編碼序列的克隆；2)包含ompK成熟肽編碼序列的原核表達質粒的構建；3)重組ompK蛋白的獲得方式；4)重組ompK蛋白對大黃魚的免疫途徑和免疫效果的檢測。本發明提供了一種副溶血弧菌ompK蛋白亞單位疫苗的製備方法，同時提供了ompK蛋白免疫大黃魚後免疫效果的檢測方法，該方法製備簡單、使用方便。文檔編號A61K39/106GK101172157SQ20071007136公開日2008年5月7日申請日期2007年9月21日優先權日2007年9月21日發明者漣於,張祟文,毛芝娟,由振強,魏永偉申請人:浙江大學