單核苷酸多態性rs6871626在檢測麻風病易感基因中的應用的製作方法
2023-05-31 01:06:21
專利名稱：單核苷酸多態性rs6871626在檢測麻風病易感基因中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及單核苷酸多態性rs6871626在檢測麻風病易感基因中的應用。
背景技術：
單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)指基因組單個核苷酸的變異，它是最微小的變異單元，是由單個核苷酸對置換、顛換、插入或缺失所形成的變異形式。單核苷酸多態性是基因組上高密度的遺傳標誌，在人類基因組中已發現的SNP數量超過3000萬。作為第三代遺傳標記SNP數量眾多、分布密集，易於檢測，因而是理想的基因分型目標。SNP分型檢測在疾病基因組(如疾病易感性)，藥物基因組(藥效、藥物代謝差異和不良反應)和群體進化等研究中具有重大意義。目前已有多種方法可用於SNP檢測，如DNA測序、限制性酶切片段長度多態性、單 鏈構象多態性、變性高效液相色譜、SNP晶片。其中，SNP晶片包括基於核酸雜交反應的晶片、基於單鹼基延伸反應的晶片、基於等位基因特異性引物延伸反應的晶片、基於「一步法」反應的晶片、基於引物連接反應的晶片、基於限制性內切酶反應的晶片、基於蛋白DNA結合反應的晶片，及基於螢光分子DNA結合反應的晶片(張小燕等。用基因晶片檢測單核苷酸多態性反應原理。中國生物工程雜誌。2005，25(11):52 56)。麻風病是一種由麻風分枝桿菌感染所致的慢性傳染病，在發展中國家這仍然是一個嚴重的健康問題，每年全球新發病例數為250000。主要侵犯皮膚和外周神經，並導致不可逆性的神經功能損害和慢性致畸致殘。這已被證明在麻風的流行中環境因素和宿主遺傳因素起著至關重要的作用，估計遺傳因素高達57%。世界衛生組織的方案把麻風病的臨床表現分為結核型和瘤型，分別對應了 Thl (細胞介導)和Th2 (體液介導)組織的人體的免疫應答。麻風病多樣性的臨床表現反映出人體對同種病原體的兩種截然不同的免疫應答，這就說明遺傳易感性在麻風發病中的重要性。遺傳研究的結果表明遺傳與麻風易感性和其臨床亞型的病情進展都有關聯。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供單核苷酸多態性rs6871626在麻風病方面的新用途。本發明所提供的新用途是下述I) -9)中的至少一種I)檢測人基因組中rs6871626的多態性或基因型的物質在製備檢測與麻風病相關的單核苷酸多態性的產品中的應用；2)檢測人基因組中rs6871626的多態性或基因型的物質在製備鑑定或輔助鑑定與麻風病相關的單核苷酸多態性的產品中的應用；3)檢測人基因組中rs6871626的多態性或基因型的物質在製備篩查麻風病患者產品中的應用；
4)檢測人基因組中rs6871626的多態性或基因型的物質在製備檢測麻風病易感性產品中的應用；5)人基因組中的單核苷酸多態性在製備檢測麻風病易感基因的產品中的應用，其中，所述單核苷酸多態性是refSNP ID為rs6871626的DNA序列多態性；6)人基因組中的單核苷酸多態性在製備鑑定或輔助鑑定麻風病易感基因的產品中的應用，其中，所述單核苷酸多態性是refSNP ID為rs6871626的DNA序列多態性；7)人基因組中rs6871626的多態性在製備篩查麻風病患者產品中的應用；8)人基因組中rs6871626的多態性在製備檢測麻風病易感性產品中的應用；9)包括檢測人基因組中rs6871626多態性的物質的產品，為a)_d)中的任一種產品
a)檢測與麻風病相關的單核苷酸多態性的產品，b)鑑定或輔助鑑定與麻風病相關的單核苷酸多態性的產品，c)篩查麻風病患者產品，d)檢測麻風病易感性產品。 在本發明的實施例中，所述麻風病具體為中國漢族及少數民族人群麻風病。Rs6871626是人染色體5q33上的一個二等位多態性的SNP位點，該變異是轉換(A/C，在其互補鏈上則為T/G)。所述rs6871626基因型是AA、AC或CC。所述AA是rs6871626位點為A的純合型，所述CC是rs6871626位點為C的純合型，所述AC是rs6871626位點為A和C的雜合型。所述檢測人基因組中rs6871626的多態性或基因型具體可為檢測rs6871626的核苷酸種類。實驗證明，rs6871626在由5503個麻風病患者組成的病例群體和由4971個正常人組成的病例對照群體的P值是3. 95X 10_18，相對危險度是O. 75，說明rs6871626是與麻風病相關的單核苷酸多態性。實驗證明，rs6871626的三個基因型中，CC基因型的個體在正常人群體中的比例是45. 5%，明顯低於麻風病患者群體中的比例51. 5%。在實際應用中，可將檢測rs6871626的多態性的物質與其它物質(如檢測其它的與麻風病相關的單核苷酸多態性的物質)聯合在一起製備篩查麻風病患者的產品。其中，檢測人基因組中rs6871626的多態性的物質可為通過下述至少一種方法確定rs6871626的多態性所需的試劑和/或儀器DNA測序、限制性酶切片段長度多態性、單鏈構象多態性、變性高效液相色譜和SNP晶片。其中，SNP晶片包括基於核酸雜交反應的晶片、基於單鹼基延伸反應的晶片、基於等位基因特異性引物延伸反應的晶片、基於「一步法」反應的晶片、基於引物連接反應的晶片、基於限制性內切酶反應的晶片、基於蛋白DNA結合反應的晶片，及基於螢光分子DNA結合反應的晶片。所述產品可為試劑或試劑盒，還可為試劑或試劑盒和儀器的組合產品，如由引物和DNA測序儀組成的組合產品，由PCR試劑和DNA測序試劑和DNA測序儀組成的組合產品。本發明的一個實施例中，採用PCR引物擴增包括rs6871626在內的基因組DNA片段，以得到的PCR擴增產物為模板，採用單鹼基延伸引物進行單鹼基延伸反應，對得到的延伸產物的序列進行檢測，確定rs6871626的多態性和基因型。所述PCR引物在序列上沒有特殊要求，只要能擴增出包括rs6871626在內的基因組DNA片段即可，具體可為序列I和序列2所示的單鏈DNA。所述延伸引物根據人基因組中rs6871626上遊(不包括該SNP位點)設計，所述延伸引物的最後I位核苷酸對應於人基因組中rs6871626的前I位核苷酸，如所述延伸引物具體可為序列表中的序列5所示的單鏈DMNA，當然也可將序列5所示的單鏈DNA按照人基因組中rs6871626的下遊序列延長一個以上核苷酸，或按照人基因組中rs6871626的下遊序列缺失一個以上核苷酸，只要能使該單鹼基延伸引物的3'末端延伸出rs6871626位點的核苷酸即可。本發明在一個來自中國人群的樣本(5503個麻風病患者和4971個健康者)中發現rs6871626是與麻風病相關的單核苷酸多態性。可將檢測rs6871626的多態性的物質與其它物質(如檢測其它的與麻風病相關的單核苷酸多態性的物質)聯合在一起製備篩查麻風病患者的產品。
圖I為rs2058660的關聯區域。 左側縱軸顯示為SNP的P值，右側縱軸顯示為重組率，橫軸顯示其物理位置。各區域中SNP與本實驗陽性SNP位點rs2058660的相關係數(r2)用不同顏色標記，箭頭指示的為本實驗的陽性SNP rs2058660、區域中P值最小SNP位點以及以往報導過的SNP，P值最小的SNP位點rsl916307、以往報導與哮喘相關的位點rs3771166均與本實驗陽性SNP位點rs2058660無關聯，與乳糜瀉相關的位點rs917997、rsl3015714與陽性位點強關聯(r2 >0.8)。重組率的估算基於千人基因組中中國及日本人群樣本。圖中注釋的基因源於(http://genome, ucsc. edu/)。圖2為rs6871626的關聯區域。左側縱軸顯示為SNP的P值，右側縱軸顯示為重組率，橫軸顯示其物理位置。各區域中SNP與本實驗陽性SNP位點rs6871626的相關係數(r2)用不同顏色標記，箭頭指示的為本實驗的陽性SNP rs6871626、區域中P值最小SNP位點以及以往報導過的SNP，P值最小的位點rsl422877以及與克羅恩氏病相關的rsl0045431，多發性硬化症相關的rs2546890，銀屑病相關的rs2546890、rs3213094、rs2082412,關節病型銀屑病相關的rsl2188300，強直性脊柱炎相關的rs6556416均與陽性SNP位點rs6871626無關聯(r2 < O. 01)。重組率的估算基於千人基因組中中國及日本人群樣本。圖中注釋的基因源於(http://genome, ucsc.edu/)ο
具體實施例方式以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例I、rs6871626是與麻風病相關的單核苷酸多態性2009年發明人所在研究小組採用全基因組關聯研究(GWAS)在中國漢族人群中發現了麻風病的7個易感基因(CCDC122，C13orf31, N0D2, TNFSF15, HLA-DR、RIPK2和LRRK2)，其中5個基因以N0D2為中心建立起一個信號通路(Zhang, F.R.，Huang, W.，Chenj S，Μ.，Sun, L. D.，Liuj H.，Li，Y.，Cuij Y.，Yanj X. X.，Yang, Η.Τ. , Yang, R. D. et al. (2009)Genomewide association study of leprosy. N. Engl.J. Med.，361，2609-2618.)，2011 年繼 GffAS 後又發現了 2 個麻風易感基因(IL23R 和 RAB32)(Zhang, F. , Liu, H. , Chen, S. , Low, H. , Sun, L. , Cui, Y. , Chu, T. , Li, Y. , Fu, X. , Yu, Y. etal. (2011)Identification of two new loci at IL23R and RAB32that influence)。麻風病作為一類多個微效基因共同起作用的複雜性疾病，目前發現的9個易感基因位點僅是其易感基因譜的冰山一角，更多的麻風易感基因尚待進一步發現。候選基因及SNP的選擇發明人通過PUBMED 的 GWAS 官網(http://www. genome, gov/26525384)，查閱了 12個⑶(克羅恩病)的GWAS研究和2個UC (潰瘍性結腸炎)的GWAS研究。從中選出位於118個基因上的155個與⑶或UC或兩者相關的SNPs (ρ〈5. 0Χ1(Γ8)。排除位於MHC區域的7個SNP和15個位於5個已知的麻風易感基因(N0D2，TNFSFl5, IL23R, C130RF31和LRRK2)上的SNPs。剩餘的133個SNPs，包括75個CD的相關SNPs，54個UC相關的SNPs，41個IBD(MM266600)(⑶和UC)相關的SNPs。這些點將在來自中國人群的4個獨立樣本中被驗證。
倫理聲明本研究通過了山東省醫學科學院皮膚病與性病學研究機構倫理委員會批准，所有麻風病患者及健康對照者均籤署了知情同意書。研究對象來自中國人群的四個獨立樣本，這四個獨立樣本中共有4971名麻風病患者，5503名健康對照者。他們均為無血緣關係的獨立個體。臨床分型、家族史情況及發病年齡等信息通過病歷採集。樣本均通過標本的質控。麻風病患者的診斷至少由兩名皮膚科專家同時確診(臨床依據包括爪形手、畸形足及病理依據等)。健康對照者均無麻風家族史及其他面議疾病病史。其中，中國麻風病患者的診斷標準是符合下述4條中的2條或2條以上，或符合第3條者確立診斷1、皮損伴有感覺障礙及閉汗，或有麻木區；2、周圍神經受累，表現為神經幹粗大伴相應功能障礙；3、皮損組織切片或組織液塗片查到麻風桿菌；4、病理可見特徵性改變。健康對照者的診斷標準無麻風病史及其他傳染病病史，無其他自身免疫性疾病病史及家族史。表I顯不了樣本1-4的基本信息。表1、4971名中國麻風病患者和5503名健康對照者的基本情況
權利要求
1.檢測人基因組中rs6871626的多態性或基因型的物質在製備檢測與麻風病相關的單核苷酸多態性的產品中的應用。
2.檢測人基因組中rs6871626的多態性或基因型的物質在製備鑑定或輔助鑑定與麻風病相關的單核苷酸多態性的產品中的應用。
3.檢測人基因組中rs6871626的多態性或基因型的物質在製備篩查麻風病患者產品中的應用。
4.檢測人基因組中rs6871626的多態性或基因型的物質在製備檢測麻風病易感性產品中的應用。
5.人基因組中的單核苷酸多態性在製備檢測麻風病易感基因的產品中的應用，其特徵在於所述單核苷酸多態性是refSNP ID為rs6871626的DNA序列多態性。
6.人基因組中的單核昔Ife多態性在製備鑑定或輔助鑑定麻風病易感基因的廣品中的應用，其特徵在於所述單核苷酸多態性是refSNP ID為rs6871626的DNA序列多態性。
7.人基因組中rs6871626的多態性在製備篩查麻風病患者產品中的應用。
8.人基因組中rs6871626的多態性在製備檢測麻風病易感性產品中的應用。
9.含有檢測人基因組中rs6871626多態性的物質的產品，為a)-d)中的任一種產品 a)檢測與麻風病相關的單核苷酸多態性的產品； b)鑑定或輔助鑑定與麻風病相關的單核苷酸多態性的產品； c)篩查麻風病患者產品； d)檢測麻風病易感性產品。
10.根據權利要求9所述的產品，其特徵在於所述檢測人基因組中rs6871626的多態性的物質含有擴增包括rs6871626在內的基因組DNA片段的PCR引物和單鹼基延伸引物。
全文摘要
本發明公開了單核苷酸多態性rs6871626在檢測麻風病易感基因中的應用。本發明所保護的一個技術方案是檢測人基因組中rs6871626的多態性或基因型的物質在製備檢測與麻風病相關的單核苷酸多態性的產品中的應用。可將檢測rs6871626的多態性的物質與其它物質(如檢測其它的與麻風病相關的單核苷酸多態性的物質)聯合在一起製備篩查麻風病患者的產品。
文檔編號C12Q1/68GK102876794SQ201210375609
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月29日 優先權日2012年9月29日
發明者劉紅, 劉健, 張福仁 申請人:山東省皮膚病性病防治研究所