非肽基聚合物-胰島素多聚體和生產其的方法
2023-05-30 20:39:16
非肽基聚合物-胰島素多聚體和生產其的方法
【專利摘要】本發明涉及非肽基聚合物-胰島素多聚體，其包括兩個或更多個通過經共價鍵連接非肽基聚合物和胰島素製備的非肽基聚合物-胰島素綴合物，其中該綴合物與鈷離子絡合以形成多聚體；製備該多聚體的方法和試劑盒；包括該多聚體作為有效成分用於預防或治療糖尿病的藥物組合物；和通過給對象施用該組合物預防或治療糖尿病的方法。
【專利說明】非肽基聚合物-胰島素多聚體和生產其的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及非肽基聚合物-胰島素多聚體，其包括兩個或更多個通過經共價鍵連接非肽基聚合物和胰島素製備的非肽基聚合物-胰島素綴合物，其中綴合物與鈷離子絡合以形成多聚體；製備該多聚體的方法和試劑盒；包括該多聚體作為有效成分預防或治療糖尿病的藥物組合物；和通過給對象施用該組合物預防或治療糖尿病的方法。
【背景技術】
[0002]胰島素由51個胺基酸組成，並且分子量為5808道爾頓(Da)。胰島素在胰腺中胰島的β細胞中產生，並且儲存為六聚體(六個胰島素分子的單元)，然後以生物活性單體形式吸收入血管。通過鋅離子的配位和三個二聚體之間的疏水相互作用促進六聚體形成。六聚體中，存在兩個金屬離子結合位點並且源自三個二聚體的三個組氨酸殘基涉及每個位點。根據胰島素六聚體的結構狀態(Τ或R狀態)，結合位點位於六聚體的兩端或自表面穿過中心的通道結構(tunnel structure)的底部。
[0003]目前，大部分商業重組體胰島素和胰島素類似物作為六聚體製劑存在。即，它們通過在包含六聚體-穩定化合物、鋅和苯酚(或甲酚)的緩衝液中包括3mg/mL或更多的胰島素進行配製。與單體形式相比，六聚體製劑提供卓越的原纖維形成和脫氨抗性，從而提高胰島素的穩定性並且延長有效期。而且，皮下注入之後，六聚體製劑顯示比單體形式更緩慢從注入位點吸收入血液，並且因此它們具有持續作用的優勢。根據之前的研究，分子大小和在貯留(cbpot)處毛細管滲透性之間的反比關係解釋該緩慢吸收速率。六聚體的這些性質應用於近來開發的長效胰島素類似物，以使得在皮下注入之後延遲或持續吸收胰島素。代表性例子是地特胰島素(insulin detemir),其通過將脂肪酸鏈附連至在天然胰島素B鏈29位處的賴氨酸製備(Havel und等，2004)。根據該研究，儘管注入的地特胰島素在體內形成雙六聚體(dihexamer),其通過與白蛋白的疏水相互作用形成大的分子絡合物。因此,皮下半衰期一皮下注入藥物的一半經過毛細管壁所用的時間一比天然胰島素六聚體長4倍。
[0004]但是，六聚體製劑是有劣勢的，因為它們不能被應用於在天然胰島素的B鏈上的第一胺基酸苯丙氨酸處具有修飾的胰島素類似物，這是因為苯丙氨酸殘基涉及六聚體的結構穩定性。根據之前使用聚乙二醇化胰島素的研究(Hinds等，2000)，當通過UV-圓二色性和沉降平衡分析通過將750Da或2，OOODa大小的PEG附連至天然胰島素的B鏈的氨基末端製備的胰島素類似物時，它們的大部分作為單體在0.1-1.0mM的濃度範圍內存在。相反，天然胰島素大部分作為六聚體在相應濃度範圍內存在。因此，使用配製的聚乙二醇化胰島素六聚體在皮下注入之後難以具有持續吸收胰島素的優勢。胰島素類似物的其他例子是白蛋白-胰島素綴合物、糖基化胰島素或類似物。
[0005]所以，急需開發誘導胰島素類似物的多聚體形成的製劑，用於提高它們的藥學性質，比如穩定性和持續性。
【發明內容】
[0006]技術問題
[0007]所以，本發明人使用鈷離子誘導PEG-胰島素六聚體的形成，並且然後分析它們的藥學性質。結果，發現根據從微摩爾(μΜ)至納摩爾(ηΜ)的逐漸濃度變化發生PEG-胰島素六聚體解離成單體，其流體力學體積與PEG-胰島素綴合物和胰島素六聚體相比大大增加，並且與商業長效胰島素相比，PEG-胰島素六聚體保持穩定的六聚體形式，從而完成本發明。
[0008]問題的解決方案
[0009]本發明的一個目的是提供非肽基聚合物-胰島素多聚體，其包括兩個或更多個通過經共價鍵連接非肽基聚合物和胰島素製備的非肽基聚合物-胰島素綴合物，其中綴合物與鈷離子絡合以形成多聚體。
[0010]本發明的另一目的是提供非肽基聚合物-胰島素多聚體的製備方法，包括使非肽基聚合物-胰島素綴合物與包含鈷離子的溶液反應以產生非肽基聚合物-胰島素多聚體。
[0011]本發明的仍另一目的是提供預防或治療糖尿病的藥物組合物，其包括非肽基聚合物-胰島素多聚體作為有效成分。
[0012]本發明的仍另一目的是提供預防或治療糖尿病的方法，其包括向患有糖尿病或懷疑患有糖尿病的對象施用所述藥物組合物的步驟。
[0013]本發明的仍另一目的是提供製備非肽基聚合物-胰島素多聚體的試劑盒，其包括通過經共價鍵連接非肽基聚合物和胰島素製備的非肽基聚合物-胰島素綴合物；和包含鈷離子的溶液，其中所述溶液包含通過在水溶液中溶劑化解離成二價鈷離子的鹽和氧化劑，通過在水溶液中溶劑化解離成二價鈷離子的鹽的水合物和氧化劑，或通過在水溶液中溶劑化解離成三價鈷離子的鹽，或其水合物。
[0014]本發明的有利效果
[0015]本發明的非肽基聚合物-胰島素多聚體是有優勢的，因為其與非肽基聚合物-胰島素綴合物和胰島素多聚體相比具有顯著大的流體力學體積和高的穩定性。所以，皮下注入之後，本發明的多聚體在通過自然稀釋解離成單體之前具有大的體積，並且因此不發生其快速吸收入血流。所以，可一次給予大量的藥物。另外，因為其具有緩慢解離成單體的性質，所以其可用於開發長效胰島素製劑。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1(A)顯示陽離子交換層析(CEC)分離胰島素的結果，其中PEG(5k)連接至其B鏈的氨基末端，和圖1(B)顯示陽離子交換層析分離胰島素的結果，其中PEG(20k)連接至其B鏈的氨基末端；
[0017]圖2顯示通過Glu-C肽作圖比較人天然胰島素片段(上)和PEG-胰島素綴合物(下)的色譜圖檢查PEG附連位點的結果；
[0018]圖3顯示體積排阻色譜(SEC)測量PEG-胰島素綴合物和鈷PEG-胰島素六聚體的流體力學體積的結果，其中回歸線由標準蛋白的洗脫時間計算(從左上方6個白圈中的每一個:抑酶肽，6.5kDa ;核糖核酸酶，13.7kDa ;伴清蛋白，75kDa ;免疫球蛋白G, 150kDa ;鐵蛋白，443kDa ;甲狀腺球蛋白，669kDa);和
[0019]圖4顯示通過Dulbecoo』 s磷酸緩衝鹽水(DPBS)稀釋純化以檢查其解離成單體的鈷PEG (5K)-胰島素六聚體(▲)、鈷PEG (20k)-胰島素六聚體(實心)和鈷胰島素六聚體(.)的體積排阻色譜的結果。
【具體實施方式】
[0020]一個方面中，本發明提供非肽基聚合物-胰島素多聚體，其包括兩個或更多個通過經共價鍵連接非肽基聚合物和胰島素製備的非肽基聚合物-胰島素綴合物，其中綴合物與鈷離子絡合以形成多聚體。
[0021]如本文所使用，術語「非肽基聚合物-胰島素綴合物」指其中非肽基聚合物和胰島素經共價鍵連接的綴合物。在本發明中，非肽基聚合物-胰島素綴合物用作組成非肽基聚合物-胰島素多聚體的單體。
[0022]優選地，非肽基聚合物-胰島素綴合物可以是經共價鍵通過連接非肽基聚合物與胰島素A鏈的氨基末端、胰島素B鏈的氨基末端或胰島素B鏈29位處的賴氨酸製備的綴合物，和更優選地，是經共價鍵通過連接非肽基聚合物與胰島素B鏈的氨基末端製備的綴合物。
[0023]如在本文中使用，術語「胰島素」是指響應於血液中升高的葡萄糖水平由胰腺分泌的肽，以攝取肝臟、肌肉或脂肪組織中的葡萄糖並且將其轉變成糖原，和停止利用脂肪作為能量來源，並且因此控制血糖水平。該肽包括天然胰島素、天然胰島素激動劑、天然胰島素前體、胰島素衍生物、其片段及其變體。
[0024]術語「天然胰島素」是由胰腺分泌以促進葡萄糖吸收並抑制脂肪分解並且因此起控制血糖水平作用的激素。在加工期間由稱為胰島素原的不參與調節血糖水平的前體形成胰島素。胰島素的胺基酸序列如下:
[0025]α 鏈:
[0026]Gly-1le-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-1le-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQ ID N0.1)
[0027]β 鏈:
[0028]Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(SEQ ID N0.2)
[0029]天然胰島素是通過經兩個間-二硫鍵(inter-disulfide bond)連接A鏈和B鏈形成的異源二聚體，其中在A鏈6位處的半胱氨酸和在B鏈7位處的半胱氨酸，以及在A鏈20位處的半胱氨酸和在B鏈19位處的半胱氨酸分別形成二硫鍵。
[0030]術語「胰島素激動劑」是指結合至胰島素受體以顯示與胰島素相等的生物活性的化合物，其與胰島素的結構不相關。
[0031]術語「胰島素變體」是與天然胰島素具有一個或更多個胺基酸序列不同的肽，並且指保持控制體內血糖水平功能的肽。胰島素變體可通過在天然胰島素胺基酸序列一部分中取代、加成、缺失和修飾的任何一種或通過其組合製備。
[0032]術語「胰島素衍生物」是指與天然胰島素具有至少80%胺基酸序列同源性的肽，其胺基酸殘基上可具有一些被化學取代(例如，α -甲基化、α -羥基化)、缺失(例如，脫氨)或修飾(例如，N-甲基化)的基團，並且具有調節體內血糖水平的功能。
[0033]術語「胰島素片 段」是指在天然胰島素的N-末端或C-末端處添加或缺失一個或多個胺基酸的片段，其中可以添加非天然存在的胺基酸(例如，D型胺基酸)，並且該片段具有調節體內血糖水平的功能。
[0034]如在本文中使用，術語「非肽基聚合物」是指包括通過除肽鍵以外的任何共價鍵彼此連接的兩個或更多個重複單元的生物相容性聚合物。該非肽基聚合物的分子量可在1-1OOkDa的範圍內，並且優選為l_20kDa。
[0035]另外，非肽基聚合物可具有能夠與蛋白質結合的單末端反應基團或雙末端反應基團。優選地，反應基團可選自:乙醛(aldehyde)、丙醛、丁醛、馬來醯亞胺和琥珀醯亞胺衍生物。具體地，當非肽基聚合物在其兩端均具有反應性醛基時，其在兩端與胰島素和免疫球蛋白連接是有效的，其中具有最小的非特異性反應。通過醛鍵(aldehyde bond)的還原性烷基化生成的最終產物比通過醯胺鍵連接的產物穩定得多。醛反應基團在低PH下選擇性地結合至N-末端，並且在高pH諸如pH9.0下結合至賴氨酸殘基以形成共價鍵。
[0036]優選地，在本發明中有用的非肽基聚合物可以選自:生物可降解聚合物、脂質聚合物、殼多糖、透明質酸及其組合，並且更優選地生物可降解聚合物可以是聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、聚乳酸(PLA)或聚乳酸-乙醇酸(PLGA)，且還要更優選地是聚乙二醇(PEG)。另外，本領域中已知的其衍生物和通過本領域中的已知方法容易製備的衍生物可以包括在本發明的範圍內。例如，當使用L- Y -穀氨酸酯-附連的非肽基聚合物時，由於L- Y -穀氨酸酯之間的相互作用可有利地發生聚合胰島素多聚體形成。
[0037]如本文所使用，術語「非肽基聚合物-胰島素多聚體」或「鈷非肽基聚合物-胰島素多聚體」是多聚體，其中非肽基聚合物-胰島素綴合物與鈷離子絡合，並且包括通過鈷離子與一分子的非肽基聚合物-胰島素多聚體配位形成。
[0038]優選地，非肽基聚合物-胰島素多聚體可以是二聚體、三聚體、四聚體、五聚體或六聚體，和優選地是非肽基聚合物-胰島素六聚體。
[0039]優選地，非肽基聚合物-胰`島素多聚體可以是由三價鈷陽離子形成的多聚體。非肽基聚合物-胰島素綴合物的非肽基聚合物-胰島素多聚體製劑通過使用三價鈷陽離子(Co(III))作為配位金屬離子形成。更優選地，綴合物與三價鈷陽離子絡合以形成非肽基聚合物-胰島素六聚體，其中三價鈷陽離子形成BlOHis的八面體配位(胰島素B鏈10位處的組氨酸)。
[0040]在本發明的【具體實施方式】中，非肽基聚合物-胰島素多聚體之一——非肽基聚合物-胰島素六聚體包括通過兩個或更多個三價鈷離子與一分子的胰島素多聚體配位形成的化合物。具有環形橫截面的圓柱狀胰島素六聚體通過二價鋅離子的配位鍵和天然的三個胰島素二聚體之間的疏水相互作用形成。在一個胰島素六聚體中，存在兩個金屬離子結合位點，並且源自三個二聚體的三個組氨酸殘基(在B鏈的10位)涉及它們的每一個。非肽基聚合物胰島素六聚體的金屬離子結合位點的兩個三價鈷離子穩定六聚體的結構。
[0041]本發明的非肽基聚合物-胰島素多聚體具有比非肽基聚合物-胰島素綴合物和鈷胰島素多聚體更大的流體力學體積，並且具有緩慢解離成單體的性質。因此，其顯示卓越的體內效力持久性和穩定性，從而可用於治療糖尿病。
[0042]在本發明的一種實例中，通過將PEG附連至胰島素B鏈的氨基末端製備單-聚乙二醇化非肽基聚合物-胰島素綴合物(實施例1和2)，並且證實該綴合物的體外活性(實施例3)。
[0043]進一步，當使用綴合物和鈷離子製備六聚體(鈷PEG-胰島素六聚體)時，其流體力學體積大大增加(實施例4和5)。在0.04 μ M的低濃度下，鈷PEG-胰島素六聚體顯示70%或更高的六聚體比率,而在該低濃度下,鈷胰島素六聚體顯示20%的六聚體比率。因此，鈷PEG-胰島素六聚體是穩定的，因為其在低濃度下可製備成六聚體製劑(實施例6)。另外，鈷PEG-胰島素六聚體顯示比商業上可獲得的長效胰島素比如由地特胰島素構成的諾和平(Levemir)和由在胰島素的B鏈中具有取代和插入的甘精胰島素六聚體構成的來得時(Lantus)更短的洗脫時間和更低的解離係數，這指示皮下注入之後，六聚體比商業胰島素具有更大的體積和穩定性(實施例7)。這些結果支持本發明的非肽基聚合物-胰島素多聚體具有卓越的體內效力持久性和穩定性，並且因此多聚體或包括該多聚體的組合物可用於治療糖尿病。
[0044]在另一方面中，本發明提供本發明的非肽基聚合物-胰島素多聚體的製備方法，包括使非肽基聚合物-胰島素綴合物與包含鈷離子的溶液反應以產生非肽基聚合物-胰島素多聚體的步驟。
[0045]在本發明中，製備的非肽基聚合物-胰島素綴合物與包含鈷離子的溶液反應，從而製備根據本發明的非肽基聚合物-胰島素多聚體，其中可通過共價連接胰島素與具有選自醛、馬來醯亞胺和琥珀醯亞胺衍生物的反應性基團的非肽基聚合物和從反應混合物分離非肽基聚合物-胰島素綴合物製備非肽基聚合物-胰島素綴合物。
[0046]非肽基聚合物的反應性基團中的琥珀醯亞胺衍生物可以是丙酸琥珀醯亞胺酯、羥基琥珀醯亞胺基、琥珀醯亞胺基羧甲基或琥珀醯亞胺基碳酸酯。
[0047]鈷離子與非肽基聚 合物-胰島素綴合物的摩爾比可以是0.1至I。
[0048]可非限制性地使用任何溶液，只要該溶液包含鈷離子。優選地，溶液可包含通過在水溶液中溶劑化解離成二價鈷離子的鹽、其水合物，通過在水溶液中溶劑化解離成二價鈷離子的鹽和氧化劑，通過在水溶液中溶劑化解離成二價鈷離子的鹽的水合物和氧化劑，或通過在水溶液中溶劑化解離成三價鈷離子的鹽或其水合物。更優選地，溶液可包含通過在水溶液中溶劑化解離成二價鈷離子的鹽和氧化劑，通過在水溶液中溶劑化解離成二價鈷離子的鹽的水合物和氧化劑，或通過在水溶液中溶劑化解離成三價鈷離子的鹽或其水合物。
[0049]解離成二價鈷離子的鹽可以是氯化鈷(II) (CoCl2)，並且解離成三價鈷離子的鹽可以是氯化鈷(III) (CoCl3)。
[0050]另外,本發明有用的氧化劑可包括比如過氧化氫的物質,其具有將水溶液中和非肽基聚合物-胰島素多聚體中的二價鈷離子轉化成三價鈷離子的氧化力(oxidizingpower)。優選地,氧化劑與二價鈷離子的摩爾比可以是0.5至5。
[0051]優選地，反應可在pH5_9的緩衝液中進行，和更優選地，在pH7.5-8.5的緩衝液中進行。
[0052]在仍另一方面中，本發明提供預防或治療糖尿病的藥物組合物，包括本發明的非肽基聚合物-胰島素多聚體作為有效成分。
[0053]進一步，在仍另一方面中，本發明提供預防或治療糖尿病的方法，其包括向具有糖尿病或懷疑具有糖尿病的對象施用本發明的藥物組合物。
[0054]如在本文中使用，術語「糖尿病」是指由胰島素的分泌或功能異常導致的代謝性疾病。向對象施用本發明的組合物，以控制血糖水平，從而治療糖尿病。
[0055]如在本文中使用，術語「預防」是指通過施用該組合物抑制糖尿病的症狀或阻止糖尿病的發生的所有行為，並且術語「治療」是指通過施用該組合物將糖尿病的症狀變好或有利地改變的所有行為。治療糖尿病可以應用於可能患有糖尿病的任何哺乳動物，並且其實例包括人和靈長類以及家畜諸如牛、豬、綿羊、馬、狗和貓，而沒有限制，並且優選是人。
[0056]如在本文中使用，術語「施用」是指將預定量的物質通過某些合適方法引入患者。非肽基聚合物-胰島素多聚體可以經由任意常用途徑施用，只要其能夠到達期望的組織。考慮多種施用模式,包括腹膜內、靜脈內、肌肉內、皮下、皮內、口服、局部、鼻內、肺內和直腸內，但本發明不限於這些例舉的施用模式。然而，由於肽在口服施用後被消化，用於口服施用的組合物的活性成分應當被包衣或配製以保護免於在胃中降解。優選地，多聚體可以以可注射形式施用。另外，藥物組合物可以使用能夠將活性成分輸送至靶細胞中的某些設備進行施用。
[0057]本發明的非肽基聚合物-胰島素多聚體在低濃度範圍中保持其形式而不解離成單體，從而顯示卓越的作為藥物組合物的存儲性(圖4)。所以，本發明的藥物組合物可包括本發明的非肽基聚合物-胰島素多聚體，其濃度為0.0111|1至10(^1，優選地0.111皿至100 μ Μ，更優選地I μ M至100 μ Μ，和非常更優選地10 μ M至100 μ Μ。
[0058]本發明的藥物組合物可以包括藥學上可接受的載體。對於口服施用，藥學上可接受的載體可以包括粘合劑、潤滑劑、崩解劑、賦形劑、增溶劑、分散劑、穩定劑、懸浮劑、著色劑和風味劑。對於可注射製劑，藥學上可接受的載體可以包括緩衝劑、防腐劑、止痛劑、增溶劑、等滲劑和穩定劑。對於局部施用的製劑，藥學上可接受的載體可以包括基質(base)、賦形劑、潤滑劑和防腐劑。本發明的藥物組合物可以與上述的藥學上可接受的載體組合配製成多種劑型。例如，對於口服施用，藥物組合物可以被配製成片劑、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿或薄片(wafer)。對於可注射製劑，藥物組合物可以被配製成單位劑型，諸如多劑量容器或作為單劑量劑型的安瓿。藥物組合物也可以被配製成為溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊和長效製劑。
[0059]另一方面，適合於藥物製劑的載體、賦形劑和稀釋劑的實例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、澱粉、阿拉伯膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。另外，藥物製劑可以進一步包括填料、抗凝劑、潤滑劑、溼潤劑、風味劑和消毒劑。
[0060]可以以藥學上有效量施用本發明的組合物。如本文所使用，術語「藥學上有效量」指足以用於治療疾病的量，其與適於醫學治療的合理益處/風險比相稱。可基於對象和疾病的嚴重性、年齡、性別、藥物活性、藥物敏感性、施用時間、施用途徑、排洩速率、治療持續時間、同時使用的藥物和藥學上已知的其他因素確定本組合物的有效劑量。
[0061]根據本發明的非肽基聚合物-胰島素多聚體比非肽基聚合物-胰島素綴合物和胰島素多聚體具有更卓越的體內效力持久性和穩定性，從而可用於預防和治療糖尿病。因此，施用包括其的藥物組合物促進疾病的預防和治療。
[0062]在仍另一方面中，本發明提供用於製備本發明的非肽基聚合物-胰島素多聚體的試劑盒，其包括通過經共價鍵連接非肽基聚合物和胰島素製備的非肽基聚合物-胰島素綴合物；和包含鈷離子的溶液，其中該溶液包含通過在水溶液中溶劑化解離成二價鈷離子的鹽和氧化劑；通過在水溶液中溶劑化解離成二價鈷離子的鹽的水合物和氧化劑；或通過在水溶液中溶劑化解離成三價鈷離子的鹽，或其水合物。
[0063]在用於製備本發明的非肽基聚合物-胰島素多聚體的試劑盒中，鹽或其水合物和氧化劑可存儲在單個容器中或分別存儲在各自的容器中。
[0064]進一步，本發明的試劑盒可進一步包括描述最佳反應條件的說明書和藥學上可接受的載體。說明書可包括指南，比如小冊子或宣傳材料、貼在試劑盒上的標籤和在包含試劑盒的包裝表面上的說明。另外，指南可包括通過電子介質比如網際網路發布或提供的信息。
[0065]本發明的模式
[0066]下文中，將參照下面的實施例更詳細地描述本發明。然而，這些實施例僅用於例證性目的，並且本發明不意欲由這些實施例限制。
[0067]實施例1.合成和分離PEG-胰島素綴合物
[0068]為了連接分子量為5k或20k的mPEG-醛(單甲氧基聚乙二醇-醛)與人天然胰島素B鏈的氨基末端，將胰島素和mPEG-醛以1:2的摩爾比與濃度為2mg/mL的胰島素在4°C下反應12h。此時，反應在pH6.0下的IOOmM檸檬酸鈉緩衝液中進行，並且向其添加20mM氰基硼氫化鈉(SCB)作為還原劑。使用填充至HR柱(GE Healthcare)的S0URCE15S(GEHealthcare)樹脂從反應混合物分離在B鏈氨基末端處單-聚乙二醇化的胰島素。如圖1中顯示，在主峰處觀察到PEG (5k或20k)_胰島素綴合物(圖1)。
[0069]柱:填充在HR 柱(GE Healthcare)中的 Sourcel5S 介質
[0070]流速:1.8mL/min
[0071]梯度:A0—50%100min B (A:20mM檸檬酸鈉(檸檬酸鈉)ρΗ3.0+60% 乙醇，B:Α+0.5ΜKCl)
[0072]實施例2.PEG-胰島素綴合物的肽作圖
[0073]使用Glu_C(Roche Applied Science)切割PEG-胰島素綴合物或人天然胰島素。反應在pH8.2下的20mM HEPES緩衝液中和25°C條件下進行12h。通過反相高效液相色譜分析反應物。在 Agilentl200Series 模塊上操作 Jupiter5 微米 C18 柱(Phenomenex, Inc.)。如圖2中顯示，發現大部分PEG連接至胰島素B鏈的氨基末端(圖2)。
[0074]柱:Jupiter5微米 C18 (Phenomenex, Inc.)
[0075]流速:lmL/min
[0076]梯度:A10— 30%65min B, A30 — 40%5min B (A:20mM 硫酸鈉 ρΗ2.0，B:A+100% 乙
腈)
[0077]實施例3.體外效力檢測
[0078]為了將鼠成纖維細胞3T3-L1分化成脂肪細胞，在包含含有地塞米松、IBMX和胰島素的10%FBS/DMEM培養基的48-孔板中以1.0X IO5每孔的細胞密度接種細胞。用DPBS衝洗分化的細胞三次，並且在無血清的DMEM中培養4h。在合適濃度範圍內包含糖的DMEM中準備人天然胰島素、PEG (5k)_胰島素和PEG (20k)_胰島素，並且然後添加至包含分化的脂肪細胞的48-孔板。在37°C下培養24h之後,使用D-葡萄糖試驗試劑盒(Megazyme)測量培養基中殘留的糖濃度，並且計算EC5tl值並且顯示在表1中。
[0079]表1[0080][表1]
[0081]
【權利要求】
1.一種非肽基聚合物-胰島素多聚體，其包括兩個或更多個通過經共價鍵連接非肽基聚合物和胰島素製備的非肽基聚合物-胰島素綴合物，其中所述綴合物與鈷離子絡合以形成多聚體。
2.根據權利要求1所述的多聚體，其中通過經共價鍵連接所述非肽基聚合物與胰島素A鏈的氨基末端、B鏈的氨基末端或B鏈29位處的賴氨酸製備所述非肽基聚合物-胰島素綴合物。
3.根據權利要求1所述的組合物，其中所述胰島素是天然胰島素、通過所述天然胰島素的胺基酸序列的取代、加成、缺失、修飾或其組合中製備的胰島素變體、胰島素衍生物或其片段。
4.根據權利要求1所述的多聚體，其中所述非肽基聚合物選自生物可降解聚合物、月旨質聚合物、殼多糖、透明質酸和其組合。
5.根據權利要求4所述的多聚體，其中所述生物可降解聚合物選自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、聚乳酸和聚乳酸-乙醇酸。
6.根據權利要求5所述的多聚體，其中所述生物可降解聚合物是聚乙二醇。
7.根據權利要求1所述的多聚體，其中共價結合所述胰島素的所述非肽基聚合物的反應性基團選自乙醛、丙醛、丁醛、馬來醯亞胺和琥珀醯亞胺衍生物。
8.根據權利要求1所述的多聚體，其中所述非肽基聚合物-胰島素綴合物經三價鈷陽離子形成多聚體。
9.根據權利要求1所述的多聚體，其中所述非肽基聚合物-胰島素多聚體是非肽基聚合物-胰島素六聚體。
10.權利要求1-9任一項所述的非肽基聚合物-胰島素多聚體的製備方法，包括使非肽基聚合物-胰島素綴合物與包含鈷離子的溶液反應以產生非肽基聚合物-胰島素多聚體的步驟。
11.根據權利要求10所述的製備方法，其中所述溶液包含通過在水溶液中溶劑化解離成二價鈷離子的鹽和氧化劑；通過在水溶液中溶劑化解離成二價鈷離子的鹽的水合物和氧化劑；或通過在水溶液中溶劑化解離成三價鈷離子的鹽或其水合物。
12.根據權利要求11所述的製備方法，其中解離成二價鈷離子的所述鹽是氯化鈷(II)(CoCl2),和解離成三價鈷離子的所述鹽是氯化鈷(III) (CoCl3)。
13.根據權利要求11所述的製備方法，其中所述氧化劑與所述二價鈷離子的摩爾比是0.5 至 5。
14.根據權利要求10所述的製備方法，其中所述鈷離子與所述非肽基聚合物-胰島素綴合物的摩爾比是0.1至I。
15.根據權利要求10所述的製備方法，其中所述反應在PH5-9的緩衝液中進行。
16.預防或治療糖尿病的藥物組合物，其包括權利要求1-9任一項所述的非肽基聚合物-胰島素多聚體作為有效成分。
17.根據權利要求16所述的組合物，其中所述非肽基聚合物-胰島素多聚體以0.01 μ M至100 μ M的濃度包括。
18.預防或治療糖尿病的方法，包括向具有糖尿病或懷疑具有糖尿病的對象施用權利要求16所述的藥物組合物。
19.製備權利要求1至9任一項所述的非肽基聚合物-胰島素多聚體的試劑盒，其包括通過經共價鍵連接非肽基聚合物和胰島素製備的非肽基聚合物-胰島素綴合物；和包含鈷離子的溶液，其中所述溶液包含通過在水溶液中溶劑化解離成二價鈷離子的鹽和氧化劑；通過在水溶液中溶劑化解離成二價鈷離子的鹽的水合物和氧化劑；或通過在水溶液中溶劑化解離成三價鈷離子的鹽或其水合物。
20.根據權利要求19所述的試劑盒，其中所述鹽或所述其水合物和所述氧化劑分別存儲在各自 的容器中。
【文檔編號】A61K38/28GK103747806SQ201280038302
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2012年6月1日 優先權日:2011年6月2日
【發明者】林聖仁, 張明賢, 金大振, 鄭聖燁, 權世昌 申請人:韓美科學株式會社