抗茶鹼抗體及使用方法

2023-05-30 21:03:11

抗茶鹼抗體及使用方法
【專利摘要】本發明提供抗茶鹼抗體及其使用方法。
【專利說明】抗茶鹼抗體及使用方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及抗茶鹼抗體及使用抗茶鹼抗體的方法。

【背景技術】
[0002] 半抗原結合抗體可以用作治療和診斷應用的捕獲模塊。例如，半抗原結合實體 (如螢光團、螯合試劑、肽、核酸、蛋白質、脂質、納米顆粒和許多其他活性劑）可以與半抗原 結合抗體和抗體衍生物反應。這使得能夠進行這類"有效負載"的有效檢測，以及捕獲、在希 望的位置累積、交聯和其他抗體介導的作用。由於半抗原的特徵和組成可以影響半抗原結 合實體的組成和"行為"（包括大小、溶解度、活性、生物物理特性、PK、生物學作用及更多）， 高度希望發展多種不同的半抗原結合實體。從而可能用給定的有效負載匹配所選擇的半抗 原來產生優化的半抗原綴合物。隨後，可以將最適半抗原結合實體與該綴合物組合來產生 最適的抗體-半抗原-有效負載複合物。還希望得到半抗原結合實體，如人源化的抗體衍 生物。這使得能夠以顯著降低的幹擾風險（如治療性應用中的免疫原性）應用。
[0003] 在W0 2010/119704中，報導了特異性結合3寡聚物的抗體及其用途。US 4,855,226中報導了茶鹼的新的競爭測定及其中所用的試劑。W02010/045388中報導了 MMP-9和MMP-12結合蛋白質在治療和預防系統性硬化病中的用途。US 6, 881，536中報導 了基於顆粒的電化學發光測定。
[0004] 發明概述
[0005] 本發明提供抗茶鹼抗體及使用抗茶鹼抗體的方法。
[0006]本文報導的一個方面是人源化抗茶鹼抗體，其中該抗體包含：(a)含有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的HVR-H3 ; (b)含有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的HVR-L3 ;和（c)含 有SEQ ID N0:10的胺基酸序列的HVR-H2。
[0007] 在一個實施方案中，該抗體對人茶鹼具有l(T12mol/l或更小的解離常數（親和 力）。
[0008] 在一個實施方案中，該抗體還包含：（a)含有SEQ ID N0:09的胺基酸序列的 HVR-H1 ; (b)含有SEQ ID N0:10的胺基酸序列的HVR-H2 ;和（c)含有SEQ ID N0:11的氨基 酸序列的HVR-H3。
[0009] 在一個實施方案中，該抗體還包含：（a)含有SEQ ID N0:13的胺基酸序列的 HVR-L1 ; (b)含有SEQ ID N0:14的胺基酸序列的HVR-L2 ;和（c)含有SEQ ID N0:15的氨基 酸序列的HVR-L3。
[0010] 在一個實施方案中，該抗體是人源化抗體，且在按照Kabat編號的重鏈可變結構 域的71位包含胺基酸殘基精氨酸。
[0011] 在一個實施方案中，該抗體是人源化抗體，且在按照Kabat編號的輕鏈可變結構 域的46位包含胺基酸殘基亮氨酸。
[0012] 在一個實施方案中，該抗體是人源化抗體，且在按照Kabat編號的重鏈可變結構 域的71位包含胺基酸殘基精氨酸，在按照Kabat編號的輕鏈可變結構域的46位包含氨基 酸殘基亮氨酸。
[0013] 在一個實施方案中，該抗體包含：（a)與SEQ ID N0:12的胺基酸序列具有至少 95%序列同一性的VH序列；(b)與SEQ ID N0:16的胺基酸序列具有至少95%序列同一性 的VL序列；或（c) (a)中的VH序列和（b)中的VL序列，其中按照Kabat編號的重鏈可變結 構域的71位的胺基酸殘基是精氨酸，按照Kabat編號的輕鏈可變結構域的46位的胺基酸 殘基是殼氣酸。
[0014] 在一個實施方案中，該抗體包含SEQ ID N0:12的VH序列。
[0015] 在一個實施方案中，該抗體包含SEQ ID N0:16的VL序列。
[0016] 本文報導的一個方面是包含SEQ ID N0:12的VH序列和SEQ ID N0:16的VL序列 的抗體。
[0017] 在一個實施方案中，該抗體是全長IgGl抗體或全長IgG4抗體。
[0018] 在一個實施方案中，該抗體是單克隆抗體。
[0019] 在一個實施方案中，該抗體是結合茶鹼的抗體片段。
[0020] 本文報導的一個方面是包含本文報導的抗體和可藥用載體的藥物製劑。
[0021] 本文報導的一個方面是本文報導的抗體用作藥物。
[0022] 本文報導的一個方面是本文報導的抗體在製備藥物中的用途。
[0023] 附圖簡述
[0024] 圖1.結合茶鹼的嵌合抗體和人源化抗體的表達：還原型SDS PAGE顯示用蛋白A 和SEC純化後嵌合抗體（中央泳道）和人源化抗體（右側泳道）的組成和同質性。分子量 標記加在左側泳道中。抗體H鏈（50k處的上方條帶）和L鏈（25k處的下方條帶）可作為 單一條帶檢測到，不存在可見量的額外的蛋白質汙染。
[0025] 圖2.證明抗體與固定的茶鹼的特異和有效的結合的茶鹼ELISA。
[0026] 圖3.茶鹼結合抗體在SPR實驗中的結合概況。
[0027] 圖4. a)茶鹼-Cys-Cy5的組成、結構和分子量；b)大小排阻層析證明所純化的茶 鹼結合抗體變體的純度和同質性；峰#2顯示純化的產物，峰#1的缺乏表明這類製劑不含聚 集體；c)通過非還原型（左側泳道）和還原型（右側泳道）SDS PAGE證明茶鹼結合抗體和 茶鹼-Cys_Cy5之間形成共價複合物；Cy5似乎僅在包含茶鹼-Cys_Cy5和cys突變抗體的樣 品中在非還原條件下與H鏈偶聯，這些共價綴合物在還原時分裂（右側泳道）；泳道1:分子 量標記；2-4非還原型-2:抗茶鹼抗體（不含cys突變）+茶鹼-Cys_Cy5(複合物）；3: 抗茶鹼抗體-cys_55+茶鹼-Cys-Cy5 (綴合物）；4:抗茶鹼抗體-cys_54+茶鹼-Cys-Cy5 (綴 合物）；5_7還原型--5:抗茶鹼抗體（不含cys突變）+茶鹼-Cys_Cy5 (複合物）；6 :抗 茶鹼抗體-cys_55+茶鹼-Cys-Cy5 (綴合物）；7:抗茶鹼抗體-cys_54+茶鹼-Cys-Cy5 (綴 合物）。
[0028] 圖5.通過表面等離振子共振（BIAcore)實驗評價茶鹼結合抗體的親和力。通 過抗-huFab將抗體的Fab片段捕獲在晶片上，然後暴露於含有單茶鹼的有效負載（茶 鹼-肽）。形成確定的1:1複合物（Fab:茶鹼-有效負載）。除快速結合（結合速率）夕卜， 我們未觀察到可檢測到的解離速率，即結合抗原無相關釋放。
[0029] 發明詳述
[0030] I ?定義
[0031] 用於本文目的的"受體人構架"是包含衍生自下文定義的人免疫球蛋白構架或人 共有構架的輕鏈可變結構域（VL)構架或重鏈可變結構域（VH)構架的胺基酸序列的構架。 "衍生自"人免疫球蛋白構架或人共有構架的受體人構架可以包含其相同的胺基酸序列，或 者它可以包含胺基酸序列改變。在一些實施方案中，胺基酸改變的數目是10個或更少、9個 或更少、8個或更少、7個或更少、6個或更少、5個或更少、4個或更少、3個或更少、或2個或 更少。在一些實施方案中，VL受體人構架在序列上與VL人免疫球蛋白構架序列或人共有 構架序列相同。
[0032] "親和力"指分子（例如抗體）的單個結合部位與其結合配偶體（例如抗原）之間 非共價相互作用的總和的強度。除非另有說明，本文所用的"結合親和力"指內在的結合親 和力，其反映結合對（例如抗體和抗原）的成員之間的1:1相互作用。分子X對其配偶體Y 的親和力一般可以通過解離常數（Kd)來表示。親和力可以通過本領域公知的方法來測量， 包括本文中描述的那些。用於測量結合親和力的具體的說明性和示例性實施方案在下文中 描述。
[0033] "親和力成熟"抗體指與不具有這類改變的親本抗體相比在一個或多個高變區 (HVR)中具有一個或多個改變的抗體，這類改變導致抗體對抗原的親和力的改善。
[0034] 術語"抗茶鹼抗體"和"結合茶鹼的抗體"指這樣的抗體，其能夠以足夠的親和力結 合茶鹼，使得該抗體可以在靶向茶鹼中用作診斷劑和/或治療劑。在一個實施方案中，如例 如通過放射免疫測定（RIA)測量，抗茶鹼抗體與不相關的非茶鹼蛋白質結合的程度小於該 抗體與茶鹼的結合的約10%。在某些實施方案中，結合茶鹼的抗體具有彡luM、彡100nM、 彡10nM、彡InM、彡0? InM、彡O.OlnM、或彡O.OOlnM(例如10_8M或更小，例如從10_8M至 1(T 13M，例如從10_9M至10_13M)的解離常數（Kd)。
[0035] 術語"抗體"在本文中以最廣泛的含義使用並涵蓋多種抗體結構，包括但不限於單 克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體（例如雙特異性抗體）和抗體片段，只要它們顯示希 望的抗原結合活性。
[0036] "抗體片段"指除完整抗體以外的包含完整抗體的部分的分子，其結合該完整抗體 所結合的抗原。抗體片段的實例包括但不限於Fv、Fab、Fab'、Fab' -SH、F(ab'）2 ;雙抗體； 線性抗體；單鏈抗體分子（例如scFv);及從抗體片段形成的多特異性抗體。
[0037] 與參考抗體"結合相同表位的抗體"指在競爭測定中將參考抗體與其抗原的結合 阻斷50%或更多的抗體，相反，參考抗體在競爭測定中將抗體與其抗原的結合阻斷50%或 更多。本文提供示例性競爭測定。
[0038] 術語"嵌合"抗體指這樣的抗體，其中部分重鏈和/或輕鏈衍生自特定來源或物 種，而重鏈和/或輕鏈的其餘部分衍生自不同的來源或物種。
[0039] 抗體的"種類"指其重鏈所具有的恆定結構域或恆定區的類型。存在五個主要種 類的抗體：184、18〇、1 §￡、1§6和1§]?，這些種類中的幾種可以還劃分為亞類（同種型），例如 IgGpIgG2、IgG3、IgG4、IgAi和IgA2。對應於不同種類的免疫球蛋白的重鏈恆定結構域分別 稱為a、6、e、y和]i。
[0040] 本文所用的術語"細胞毒劑"指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞死亡或破 壞的物質。細胞毒劑包括但不限於放射性同位素（例如At 211、I131、I125、Y9°、Re186、Re 188、 Sm153、Bi212、P32、Pb 212和Lu的放射性同位素）；化療劑或化療藥物（例如氨甲喋呤、阿黴素 (adriamicin)、長春花生物鹼（長春花新鹼（vincristine)、長春滅癌鹼（vinblastine)、依 託泊苷（etoposide))、多柔比星（doxorubicin)、苯丙氨酸氮芥（melphalan)、絲裂黴素C、 苯丁酸氮芥（chlorambucil)、柔紅黴素（daunorubicin)或其他嵌入劑）；生長抑制劑；酶 及其片段，如核溶解酶；抗生素；毒素，如細菌、真菌、植物或動物來源的小分子毒素或酶活 性毒素，包括其片段和/或變體；及下文公開的多種抗腫瘤或抗癌劑。
[0041]"效應子功能"指可歸因於抗體的Fc區且隨抗體種類而變的那些生物學活性。抗 體效應子功能的實例包括：Clq結合和依賴補體的細胞毒性（CDC) ;Fc受體結合；依賴抗體 的細胞毒性（ADCC);吞噬作用；細胞表面受體（例如B細胞受體）的下調；及B細胞激活。 [0042]活性劑（例如藥物製劑）的"有效量"指對在劑量和需要的時期內達到希望的治 療或預防結果有效的量。
[0043] 本文的術語"Fc區"用來定義免疫球蛋白重鏈的C端區域，其包含至少部分恆定 區。該術語包括天然序列Fc區和變體Fc區。在一個實施方案中，人IgG重鏈Fc區從Cys226 或從Pr 〇230延伸至重鏈的羧基端。但是，Fc區的C端賴氨酸（Lys447)可以存在或不存在。 除非本文另有說明，Fc區或恆定區中的胺基酸殘基的編號按照Kaba t，E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991，NIH 公開 91-3242 中所述的 EU 編號系統，也稱 為EU指數。
[0044]"構架"或"FR"指高變區（HVR)殘基之外的可變結構域殘基。可變結構域的FR - 般由四個FR結構域組成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列一般按以下順序出現 在 VH (或 VL)中：FR1-H1 (LI) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4。
[0045] 術語"全長抗體"、"完整抗體"和"全抗體"在本文中可互換使用，指具有基本上類 似於天然抗體結構的結構或具有包含本文定義的Fc區的重鏈的抗體。
[0046] 術語"宿主細胞"、"宿主細胞系"和"宿主細胞培養物"可互換使用，指已將外源核 酸引入其中的細胞，包括這類細胞的後代。宿主細胞包括"轉化體"和"轉化細胞"，其包括 最初轉化的細胞及從其衍生的後代，而不考慮傳代數。後代的核酸含量可以並非與親本細 胞完全相同，而是可以包含突變。本文包括具有與在最初轉化的細胞中篩選或選擇的功能 或生物學活性相同的功能和生物學活性的突變體後代。
[0047]"人抗體"是具有這樣的胺基酸序列的抗體，該胺基酸序列對應於由人或人細胞產 生或衍生自利用人抗體庫或其他人抗體編碼序列的非人來源的抗體的胺基酸序列。人抗體 的此定義明確排除了包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。
[0048]"人共有構架"是代表人免疫球蛋白VL或VH構架序列的選擇中最常出現的胺基酸 殘基的構架。通常，該人免疫球蛋白VL或VH構架序列的選擇來自可變結構域序列亞組。通 常，該序列亞組是 Kabat，E. A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第 5版，NIH Publication91-3242，Bethesda MD(1991)，l-3卷中的亞組。在一個實施方案 中，對於VL，該亞組是Kabat等，上文中的亞組kI。在一個實施方案中，對於VH，該亞組是 Kabat等，上文中的亞組III。
[0049]"人源化"抗體指包含來自非人HVR的胺基酸殘基和來自人FR的胺基酸殘基的嵌 合抗體。在某些實施方案中，人源化抗體將包含至少一個且通常為兩個可變結構域的基本 上全部，其中全部或基本上全部HVR(例如⑶R)對應於非人抗體的那些，而全部或基本上全 部FR對應於人抗體的那些。人源化抗體可以可選地包含源自人抗體的抗體恆定區的至少 一部分。抗體（例如非人抗體）的"人源化形式"指已進行了人源化的抗體。
[0050] 本文所用的術語"高變區"或"HVR"指抗體可變結構域的在序列上高變和/或形 成結構上定義的環（"高變環"）的區域中的每一個。通常，天然四鏈抗體包含六個HVR; 三個在VH中（HI、H2、H3)，三個在VL中（LI、L2、L3)。HVR -般包含來自高變環和/或 來自"互補決定區"（CDR)的胺基酸殘基，後者具有最高的序列變異性和/或涉及抗原 識別。示例性高變環存在於胺基酸殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、 53-55(H2)和 96-101 (H3)(Chothia C?和 Lesk，A.M.，J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。 示例性⑶R (⑶R-L1、⑶R-L2、⑶R-L3、⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3)存在於L1的胺基酸殘基 24-34、L2的胺基酸殘基50-56、L3的胺基酸殘基89-97、H1的胺基酸殘基31-35B、H2的 氛基酸殘基 50-65 和 H3 的氛基酸殘基 95-102 (Kabat，E. A?等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) NIH 公開 91-3242)。除 VH 中的 CDR1 外，CDR -般包含形成高變 環的胺基酸殘基。⑶R還包含"特異性決定殘基"或"SDR"，其是接觸抗原的殘基。SDR包含 在CDR的稱為縮短的CDR或a-CDR的區域內。示例性a-CDR (a-CDR-Ll、a-CDR-L2、a-CDR-L3、 a-CDR-Hl、a-CDR-H2和a-CDR-H3)存在於LI的胺基酸殘基31-34、L2的胺基酸殘基50-55、 L3的胺基酸殘基89-96、HI的胺基酸殘基31-35B、H2的胺基酸殘基50-58和H3的胺基酸 殘基 95-102 (見 Almagro 和 Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008))。除非另有說 明，本文按照Kabat等，上文編號可變結構域中的HVR殘基和其他殘基（例如FR殘基）。
[0051] "免疫綴合物"是與一種或多種異源分子（包括但不限於細胞毒劑）綴合的抗體。
[0052] "個體（individual) "或"對象（subject) "是哺乳動物。哺乳動物包括但不限於 飼養的動物（例如牛、綿羊、貓、狗和馬）、靈長類（例如人類和非人靈長類，如猴）、兔和齧 齒類（例如小鼠和大鼠）。在一些實施方案中，該個體或對象是人。
[0053] "分離的"抗體是已從其天然環境的成分分開的抗體。在一些實施方案中，將抗體 純化至通過例如電泳（例如SDS-PAGE、等電聚焦（IEF)、毛細管電泳）或層析（例如離子交 換或反相HPLC)測定的純度大於95%或99%。評估抗體純度的方法的綜述見例如Flatman 等，J. Chrom. B848:79-87 (2007)。
[0054] "分離的"核酸指已從其天然環境的成分分開的核酸分子。分離的核酸包括包含在 通常含有該核酸分子的細胞中的核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或不同於其天然 染色體位置的染色體位置上。
[0055] "分離的編碼抗茶鹼抗體的核酸"指編碼抗體重鏈和輕鏈（或其片段）的一個或多 個核酸分子，包括單個載體或分開的載體中的這種（類）核酸分子，及存在於宿主細胞中的 一個或多個位置的這種（類）核酸分子。
[0056] 本文所用的術語"單克隆抗體"指獲自基本上同質的抗體群體的抗體，即除了例如 包含天然存在的突變或在產生單克隆抗體製劑期間出現的可能的變體抗體（這類變體通 常以較小的量存在）外，包含該群體的單種抗體相同和/或結合相同的表位。與通常包含 抗不同決定簇（表位）的不同抗體的多克隆抗體製劑不同，單克隆抗體製劑的每種單克隆 抗體抗抗原上的單個決定簇。因此，修飾詞"單克隆"指抗體獲自基本上同質的抗體群體的 特徵，而不解釋為需要通過任意具體的方法來產生抗體。例如，將要按照本發明使用的單克 隆抗體可以通過多種技術來製備，其包括但不限於雜交瘤法、重組DNA法、噬菌體展示法和 利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的轉基因動物的方法，本文描述了用於製備單克 隆抗體的這類方法和其他示例性方法。
[0057] "裸抗體"指未與異源部分（例如細胞毒性部分）或放射性標記綴合的抗體。裸抗 體可以存在於藥物製劑中。
[0058] "天然抗體"指天然存在的具有不同結構的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體 是由形成二硫鍵的兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈組成的約150, 000道爾頓的異源四 聚體糖蛋白。從N端至C端，每條重鏈具有可變區（VH)，也稱為可變重鏈結構域或重鏈可變 結構域，隨後是三個恆定結構域（CHI、CH2和CH3)。類似地，從N端至C端，每條輕鏈具有 可變區（VL)，也稱為可變輕鏈結構域或輕鏈可變結構域，隨後是恆定輕鏈（CL)結構域。根 據其恆定結構域的胺基酸序列，可以將抗體的輕鏈分配至兩個類型之一，稱為k和入。
[0059] 術語"包裝說明書"用來指通常包含在治療性產品的商業包裝中的說明，其包含關 於適應症、用法、劑量、施用、聯合治療、禁忌症的信息和/或有關這類治療性產品的用途的 警告的信息。
[0060] 就參考多肽序列而言的"百分比（％ )胺基酸序列同一性"定義為在比對序列並在 必要時引入缺口來達到最大百分比序列同一性，而不將任意保守取代視為序列同一性的部 分之後，候選序列中與參考多肽序列中的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分比。可以以 本領域技術之內的多種方式來達到以測定百分比胺基酸序列同一性為目的的比對，例如， 使用公開可得的計算機軟體，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域 技術人員可以確定用於比對序列的適當參數，包括在所比較的序列的全長內達到最大比對 所需的任意算法。但是，為了本文的目的，用序列比較電腦程式ALIGN-2來產生％胺基酸 序列同一'I"生值。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech, Inc.編寫，原始碼已隨用戶文 件提交美國版權辦公室，Washington D. C.，20559,它在美國版權辦公室註冊在美國版權注 冊號 TXU510087 之下。ALIGN-2 程序從Genentech, Inc.，South San Francisco, California 公開可得，或者可以從原始碼編譯。ALIGN-2程序應編譯用在UNIX作業系統上，包括數字 UNIX V4.0D。所有序列比較參數由ALIGN-2程序設定且不變動。
[0061] 在利用ALIGN-2來進行胺基酸序列比較的情況下，按以下計算給定胺基酸序列A 與給定胺基酸序列B的％胺基酸序列同一性（其可以備選地敘述為，具有或包含與給定氨 基酸序列B的某％胺基酸序列同一性的給定胺基酸序列A) :
[0062] 100乘以分數X/Y
[0063] 其中X是在該程序的A和B的比對中通過序列比對程序ALIGN-2評分為相同的匹 配的胺基酸殘基的數目，且其中Y是B中的胺基酸殘基的總數。應理解，在胺基酸序列A的 長度不等於胺基酸序列B的長度時，A與B的％胺基酸序列同一性將不等於B與A的％氨 基酸序列同一性。除非明確地另有說明，本文中使用的所有％胺基酸序列同一性值都是用 ALIGN-2電腦程式按前一段落中所述獲得。
[0064] 術語"藥物製劑"指這樣的製備物，其處於這樣的形式，使得包含在其中的活性成 分的生物學活性有效，且不包含對將要施用該製劑的個體具有不可接受的毒性的額外成 分。
[0065] "可藥用載體"指藥物製劑中除活性成分外的成分，其對個體無毒性。可藥用載體 包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
[0066] 術語"茶鹼"、縮寫"THE0"表示1，3-二甲基-7H-嘌呤-2, 6-二酮。茶鹼也稱為二 甲基黃嘌嶺。
[0067] 本文所用的"處理"（及其語法變形）指改變所處理的個體的自然過程的嘗試中 的臨床幹預，且可以為了預防而進行或在臨床病理的過程中進行。希望得到的處理作用包 括但不限於防止疾病的發生或復發、減輕症狀、減少疾病的任意直接或間接的病理結果、防 止轉移、降低疾病進展的速率、改善或緩和疾病狀態及消退或改善的預後。在一些實施方案 中，用本發明的抗體來延遲疾病的發展或減慢疾病的進展。
[0068] 術語"可變區"或"可變結構域"指抗體重鏈或輕鏈的涉及該抗體與抗原結合的 結構域。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變結構域（分別為VH和VL)通常具有相似的結構， 每個結構域包含四個保守的構架區（FR)和三個高變區（HVR)(見例如Kindt，T.J.等Kuby Immunology,第 6 版，W. H. Freeman and Co.，N. Y. (2007)，第 91 頁）。單個 VH 或 VL 結構 域可以足以賦予抗原結合特異性。此外，可以分別用來自結合該抗原的抗體的VH或VL結 構域篩選互補的VL或VH結構域的文庫來分離結合特定抗原的抗體（見例如Portolano, S. 等，J. Immunol. 150 (1993) 880-887 ;Clackson, T?等，Nature 352 (1991) 624-628)。
[0069] 本文所用的術語"載體"指能夠繁殖與它連接的另一核酸的核酸分子。該術語包 括作為自主複製核酸結構的載體，以及摻入它所引入的宿主細胞的基因組中的載體。某些 載體能夠指導與它們有效連接的核酸的表達。這類載體在本文中稱為"表達載體"。
[0070] 術語"半抗原"指只有在附著於諸如蛋白質的大載體時才能引出免疫反應的小分 子。示例性半抗原是苯胺、鄰_、間-和對-氨基苯甲酸、醌、肼苯噠嗪、氟烷、螢光素、生物 素、洋地黃毒苷、茶鹼和二硝基苯酚。在一個實施方案中，該半抗原是生物素或洋地黃毒苷 或茶鹼或碳硼烷。
[0071] 術語"與…綴合的半抗原"或"半抗原化的化合物"指與其他部分（如多肽或標記） 共價連接的半抗原。常用活化的半抗原衍生物作為起始物質來形成這類綴合物。在一個實 施方案中，該半抗原是洋地黃毒苷，且它通過接頭與部分綴合（在一個實施方案中，通過其 3-輕基）。在一個實施方案中，該接頭包含：a) -個或多個（在一個實施方案中，三個至六 個）亞甲基-羧基-甲基（-CH2-C(0)_);和/或b)l至10個（在一個實施方案中，1至5 個）胺基酸殘基（在一個實施方案中，選自甘氨酸、絲氨酸、穀氨酸、0 -丙氨酸、Y -氨基丁 酸、e -氨基己酸或賴氨酸）；和/或c) 一個或多個（在一個實施方案中，一個或兩個）具 有結構式NH2-[(CH2) n0]xCH2_CH2-C00H的化合物，其中n是2或3，x是1至10,在一個實施 方案中，是1至7。最後一個元件（至少部分）產生式-NH-[(CH 2)n0]xCH2-CH2-C(0)_的接頭 (部分）。這種化合物的一個實例是例如12-氨基-4, 7, 10-三氧雜月桂酸（產生TEG(三 乙二醇）接頭）。在一個實施方案中，該接頭還包含馬來醯亞胺基。該接頭具有穩定和增 溶的作用，因為它包含電荷或/和可以形成氫橋。此外，它可以在空間上便於抗-半抗原抗 體與半抗原綴合的多肽的結合。在一個實施方案中，該接頭定位在多肽的胺基酸的側鏈上 (例如，通過氨基或巰基與賴氨酸或半胱氨酸側鏈綴合）。在一個實施方案中，該接頭定位 在多肽的氨基端或羧基端。通常在不影響多肽的生物學活性的區域選擇接頭在多肽上的位 置。因此，接頭的附著位置取決於多肽及負責生物學活性的相關結構元件的性質。半抗原 所附著的多肽的生物學活性可以在體外測定法中測試。
[0072] 術語"共價複合物形成"指在形成非共價複合物，例如在抗茶鹼抗體和茶鹼之間 後，在複合物中的兩個配偶體之間形成共價鍵。共價鍵的形成在無需加入其他反應物的情 況下發生。
[0073] II.組合物和方法
[0074] 在一方面，本發明基於結合茶鹼的抗體。本文提供這些抗體。本發明的抗體可用 作例如用於結合茶鹼化的化合物的單特異性抗體和用於通過用與茶鹼化的化合物的結合 特異性作為抗體的通用有效負載特徵來診斷或治療所有種類的疾病的多特異性抗體。
[0075] A?示例性抗茶鹼抗體
[0076] 在一方面，本發明提供分離的結合茶鹼的抗體。在某些實施方案中，該抗茶鹼抗體 是人源化抗茶鹼抗體。在某些實施方案中，本文報導的抗茶鹼抗體與茶鹼化的化合物結合 而不幹擾與茶鹼綴合併通過茶鹼殘基由抗體特異性結合的化合物的生物學活性。因此，如 果該抗體是單特異性抗體，則可以用這些抗體來改善與茶鹼綴合的化合物（茶鹼化的化合 物）的藥物代謝動力學。另外，如果該抗體是雙特異性或多特異性抗體，則這些抗體可以用 於茶鹼化的化合物的靶向遞送，因為一種結合特異性針對茶鹼，且可以用作通用有效負載 特異性，而第二結合特異性特異性結合例如細胞表面分子，並提供該雙特異性或多特異性 抗體的祀向特徵/成分。
[0077] 在一方面，本發明提供包含選自以下的至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個 爪^的抗茶鹼抗體 ：（&)含有5￡〇10勵:01的胺基酸序列的狀1?11;〇3)含有5￡〇10勵 :02 的胺基酸序列的HVR-H2 ; (c)含有SEQ ID N0:03的胺基酸序列的HVR-H3 ; (d)含有SEQ ID N0:05的胺基酸序列的HVR-L1 ; (e)含有SEQ ID N0:06的胺基酸序列的HVR-L2 ;和（f)含 有SEQ ID N0:07的胺基酸序列的HVR-L3。
[0078] 在一方面，本發明提供包含選自以下的至少一個、至少兩個或全部三個VH HVR序 列的抗茶鹼抗體：（a)含有SEQ ID N0:01的胺基酸序列的HVR-H1 ;(b)含有SEQ ID N0:02 的胺基酸序列的HVR-H2;和（c)含有SEQ ID N0:03的胺基酸序列的HVR-H3。在一個實施 方案中，該抗體包含含有SEQ ID N0:03的胺基酸序列的HVR-H3。在另一實施方案中，該抗 體包含含有3￡〇10勵:03的胺基酸序列的爪^-113和含有3￡〇10勵 :07的胺基酸序列的 HVR-L3。在另一實施方案中，該抗體包含含有SEQ ID N0:03的胺基酸序列的HVR-H3、含有 5￡〇10勵:07的胺基酸序列的爪^-13和含有3￡〇10勵 :02的胺基酸序列的爪^-112。在另 一實施方案中，該抗體包含：（a)含有SEQ ID N0:01的胺基酸序列的HVR-H1 ; (b)含有SEQ ID N0:02的胺基酸序列的HVR-H2 ;和（c)含有SEQ ID N0:03的胺基酸序列的HVR-H3。
[0079] 在另一方面，本發明提供包含選自以下的至少一個、至少兩個或全部三個VL HVR 序列的抗茶鹼抗體：（3)含有3￡〇10勵:05的胺基酸序列的爪^-11 ;〇3)含有5￡〇10勵:06 的胺基酸序列的HVR-L2 ;和（c)含有SEQ ID勵:07的胺基酸序列的爪^-13。在一個實施方 案中，該抗體包含：（3)含有3￡〇10勵 :05的胺基酸序列的爪^-11;〇3)含有5￡〇10勵:06 的胺基酸序列的HVR-L2 ;和（c)含有SEQ ID N0:07的胺基酸序列的HVR-L3。
[0080] 在另一方面，本發明的抗茶鹼抗體包含：(a)含有選自以下的至少一個、至少兩個 或全部三個VH HVR序列的VH結構域：（i)含有SEQ ID勵:01的胺基酸序列的狀1?-111、（^) 含有3￡〇10勵:02的胺基酸序列的狀1?12和（1^)含有3￡〇10勵 :03的胺基酸序列的 HVR-H3 ;和（b)含有選自以下的至少一個、至少兩個或全部三個VL HVR序列的VL結構域： (i)含有SEQ ID N0:05的胺基酸序列的HVR-L1、（ii)含有SEQ ID N0:06的胺基酸序列的 HVR-L2和（iii)含有SEQ ID N0:07的胺基酸序列的HVR-L3。
[0081] 在另一方面，本發明提供包含以下的抗茶鹼抗體：（a)含有SEQ ID N0:01的氨基 酸序列的HVR-H1 ; (b)含有SEQ ID N0:02的胺基酸序列的HVR-H2 ; (c)含有SEQ ID N0:03 的胺基酸序列的HVR-H3 ; (d)含有SEQ ID N0:05的胺基酸序列的HVR-L1 ; (e)含有SEQ ID N0:06的胺基酸序列的HVR-L2 ;和（f)含有SEQ ID N0:07的胺基酸序列的HVR-L3。
[0082] 在一個實施方案中，該抗茶鹼抗體是人源化的。
[0083] 在一方面，本發明提供包含選自以下的至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個 HVR的人源化抗茶鹼抗體：（a)含有SEQ ID N0:09的胺基酸序列的HVR-H1 ; (b)含有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的HVR-H2 ; (c)含有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的HVR-H3 ; (d)含有 5￡〇10勵：13的胺基酸序列的爪^-11;(6)含有5￡〇10勵 ：14的胺基酸序列的爪^-12;和 (f)含有SEQ ID N0:15的胺基酸序列的HVR-L3。
[0084] 在一方面，本發明提供包含選自以下的至少一個、至少兩個或全部三個VH HVR序 列的人源化抗茶鹼抗體：（a)含有SEQ ID N0:09的胺基酸序列的HVR-H1 ; (b)含有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的HVR-H2 ;和（c)含有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的HVR-H3。在一個 實施方案中，該抗體包含含有SEQ ID N0:11的胺基酸序列的HVR-H3。在另一實施方案中， 該抗體包含含有3￡〇10勵：11的胺基酸序列的爪^-113和含有5￡〇10勵 ：15的胺基酸序 列的HVR-L3。在另一實施方案中，該抗體包含含有SEQ ID勵:11的胺基酸序列的狀1?-113、 含有3￡〇10勵：15的胺基酸序列的爪^-13和含有3￡〇10勵 ：10的胺基酸序列的爪^-112。 在另一實施方案中，該抗體包含：（a)含有SEQ ID N0:09的胺基酸序列的HVR-H1 ;(b)含有 5￡〇10勵：10的胺基酸序列的狀1?12;和（(3)含有3￡〇10勵 ：11的胺基酸序列的爪^-113。
[0085] 在另一方面，本發明提供包含選自以下的至少一個、至少兩個或全部三個VL HVR 序列的人源化抗茶鹼抗體：（a)含有SEQ ID N0:13的胺基酸序列的HVR-L1 ; (b)含有SEQ ID 勵：14的胺基酸序列的爪^-12;和（〇)含有5￡〇10勵：15的胺基酸序列的爪^-1^。在一 個實施方案中，該抗體包含：（a)含有SEQ ID N0:13的胺基酸序列的HVR-L1 ; (b)含有SEQ ID N0:14的胺基酸序列的HVR-L2 ;和（c)含有SEQ ID N0:15的胺基酸序列的HVR-L3。
[0086] 在另一方面，本發明的抗體包含：(a)含有選自以下的至少一個、至少兩個或全部 三個VH HVR序列的VH結構域：⑴含有SEQ ID N0:09的胺基酸序列的HVR-H1、（ii)含有 3￡〇10從)：10的胺基酸序列的狀1?12和出1)含有5￡〇10勵 :11的胺基酸序列的爪^-113; 和（b)含有選自以下的至少一個、至少兩個或全部三個VL HVR序列的VL結構域：（i)含有 SEQ ID N0:13的胺基酸序列的HVR-Ll、（ii)含有SEQ ID N0:14的胺基酸序列的HVR-L2和 (c)含有SEQ ID N0:15的胺基酸序列的HVR-L3。
[0087] 在另一方面，本發明提供包含以下的人源化抗茶鹼抗體：（a)含有SEQ ID N0:09 的胺基酸序列的HVR-H1 ; (b)含有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的HVR-H2 ; (c)含有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的HVR-H3 ; (d)含有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的HVR-L1 ; (e)含有 SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的HVR-L2;和（f)含有選自SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的 HVR-L3。
[0088] 在另一方面，本發明提供包含以下的人源化抗茶鹼抗體：（a)含有SEQ ID N0:01 的胺基酸序列的HVR-H1 ; (b)含有SEQ ID N0:02的胺基酸序列的HVR-H2 ; (c)含有SEQ ID N0:03的胺基酸序列的HVR-H3 ; (d)含有SEQ ID N0:05的胺基酸序列的HVR-L1 ; (e)含有 SEQ ID N0:06的胺基酸序列的HVR-L2;和（f)含有選自SEQ ID N0:07的胺基酸序列的 HVR-L3 ;其中HVR-H2中60位的胺基酸殘基是A，且HVR-H2中61位的胺基酸殘基是Q。
[0089] 在一個實施方案中，人源化抗茶鹼抗體包含以上實施方案中任一個的HVR，且還包 含受體人構架，例如人免疫球蛋白構架或人共有構架。在一個實施方案中，人源化抗茶鹼抗 體包含以上實施方案中任一個的HVR，且還包含：
[0090] -71位的 R。
[0091] Kabat 71 位對應於 SEQ ID N0:04、12 和 20 的殘基編號 72。
[0092] 引入此改變（回復突變）來增加人源化抗茶鹼抗體的結合親和力。
[0093] 在另一方面，抗茶鹼抗體包含與SEQ ID N0:04的胺基酸序列具有至少90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重鏈可變結構域（￥11) 序列。在某些實施方案中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99 %同一性的VH序列相對於參考序列包含取代（例如保守取代）、插入或缺失，但包含該序 列的抗茶鹼抗體保留與茶鹼結合的能力。在某些實施方案中，在SEQ ID N0:04中取代、插入 和/或缺失了總計1至10個胺基酸。在某些實施方案中，取代、插入或缺失發生在HVR以 外的區域中（即FR中）。可選地，該抗茶鹼抗體包含SEQ ID N0:04中的VH序列，包括該序 列的翻譯後修飾。在具體實施方案中，該VH包含選自以下的一個、兩個或三個HVR:(a)含 有5￡〇10勵 :01的胺基酸序列的狀1?11;〇3)含有3￡〇10勵:02的胺基酸序列的爪^-112 ; 和（c)含有SEQ ID N0:03的胺基酸序列的HVR-H3。
[0094] 在一個實施方案中，人源化抗茶鹼抗體包含以上實施方案中任一個的HVR，且還包 含受體人構架，例如人免疫球蛋白構架或人共有構架。在一個實施方案中，人源化抗茶鹼抗 體包含含有以上實施方案中任一個的HVR-H的VH，且還包含：
[0095] -71位的 R。
[0096] Kabat 71 位對應於 SEQ ID N0:04、12 和 20 的殘基編號 72。
[0097] 在另一方面，提供抗茶鹼抗體，其中該抗體包含與SEQ IDN0:08的胺基酸序列具 有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的 輕鏈可變結構域（VL)。在某些實施方案中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97 %、98 %或99%同一性的VL序列相對於參考序列包含取代（例如保守取代）、插入 或缺失，但包含該序列的抗茶鹼抗體保留與茶鹼結合的能力。在某些實施方案中，在SEQ ID N0:08中取代、插入和/或缺失了總計1至10個胺基酸。在某些實施方案中，取代、插入或 缺失發生在HVR以外的區域中（即FR中）。可選地，該抗茶鹼抗體包含SEQ IDN0:08中 的VL序列，包括該序列的翻譯後修飾。在具體實施方案中，該VL包含選自以下的一個、兩 個或三個HVR : (a)含有SEQ IDN0:05的胺基酸序列的HVR-L1 ; (b)含有SEQ IDN0:06的 胺基酸序列的HVR-L2 ;和（c)含有SEQ IDN0:07的胺基酸序列的HVR-L3。
[0098] 在另一方面，提供抗茶鹼抗體，其中該抗體包含上文提供的實施方案中任一個的 VH，及上文提供的實施方案中任一個的VL。在一個實施方案中，該抗體包含分別在SEQ ID NO: 04和SEQ ID NO: 08中的VH和VL序列，包括那些序列的翻譯後修飾。
[0099] 在一個實施方案中，人源化抗茶鹼抗體包含以上實施方案中任一個的HVR，且還包 含受體人構架，例如人免疫球蛋白構架或人共有構架。在一個實施方案中，人源化抗茶鹼抗 體包含含有以上實施方案中任一個的HVR-L的VL，且還包含：
[0100] -46 位的 L。
[0101] Kabat 46 位對應於 SEQ ID N0:08、16 和 24 的殘基編號 51。
[0102] 引入此改變（回復突變）來增加人源化抗茶鹼抗體的結合親和力。
[0103] 在另一方面，人源化抗茶鹼抗體包含與SEQ ID N0:12的胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重鏈可變 結構域（VH)序列。在某些實施方案中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97 %、98 %或99%同一性的VH序列相對於參考序列包含取代（例如保守取代）、插入或 缺失，但包含該序列的抗茶鹼抗體保留與茶鹼結合的能力。在某些實施方案中，在SEQ ID NO: 12中取代、插入和/或缺失了總計1至10個胺基酸。在某些實施方案中，取代、插入或 缺失發生在HVR以外的區域中（即FR中）。可選地，該抗茶鹼抗體包含SEQ ID N0:12中 的VH序列，包括該序列的翻譯後修飾。在具體實施方案中，該VH包含選自以下的一個、兩 個或三個HVR : (a)含有SEQ ID N0:09的胺基酸序列的HVR-H1 ; (b)含有SEQ ID N0:10的 胺基酸序列的HVR-H2 ;和（c)含有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的HVR-H3。
[0104] 在另一方面，提供人源化抗茶鹼抗體，其中該抗體包含與SEQ ID N0:16的胺基酸 序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一 性的輕鏈可變結構域（VL)。在某些實施方案中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%或99%同一性的￥1序列相對於參考序列包含取代（例如保守取 代）、插入或缺失，但包含該序列的抗茶鹼抗體保留與茶鹼結合的能力。在某些實施方案中， 在SEQ ID N0:16中取代、插入和/或缺失了總計1至10個胺基酸。在某些實施方案中，取 代、插入或缺失發生在HVR以外的區域中（即FR中）。可選地，該抗茶鹼抗體包含SEQ ID N0:16中的VL序列，包括該序列的翻譯後修飾。在具體實施方案中，該VL包含選自以下的 一個、兩個或三個HVR : (a)含有SEQ ID N0:13的胺基酸序列的HVR-L1 ; (b)含有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的HVR-L2 ;和（c)含有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的HVR-L3。
[0105] 在另一方面，提供人源化抗茶鹼抗體，其中該抗體包含上文提供的實施方案中任 一個的VH，及上文提供的實施方案中任一個的VL。在一個實施方案中，該抗體包含分別在 SEQ ID N0:12和SEQ ID N0:16中的VH和VL序列，包括那些序列的翻譯後修飾。
[0106] 在本發明的另一方面，以上實施方案中任一個的抗茶鹼抗體是單克隆抗體，包括 嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。在一個實施方案中，抗茶鹼抗體是抗體片段，例如Fv、Fab、 Fab'、scFv、雙抗體或F(ab'） 2片段。在另一實施方案中，該抗體是全長抗體，例如完整的 IgGl或IgG4抗體或本文定義的其他抗體種類或同種型。
[0107] 在另一方面，以上實施方案中任一個的抗茶鹼抗體可以單獨或組合併入以下1-5 章節中所述的任意特徵：
[0108] 1 ?抗體親和力
[0109] 在某些實施方案中，本文提供的抗體具有彡0. OOlnM(例如1(T12M或更小、例如 1(T12M至1(T13M)的解離常數（Kd)。
[0110] 在一個實施方案中，通過用以下測定所述的Fab形式的目的抗體及其抗原進行的 放射性標記抗原結合測定法（RIA)來測量Kd。通過在未標記抗原的滴定系列的存在下用最 小濃度的（ 1251) _標記的抗原平衡Fab，然後用抗-Fab抗體包被的平板捕獲結合的抗原來測 量Fab對抗原的溶液結合親和力（見例如Chen, Y?等，J. Mol. Biol. 293(1999)865-881)。 為了確定用於測定法的條件，用50mM碳酸鈉（pH 9. 6)中的5 ii g/ml的捕獲抗-Fab抗 體（Cappel Labs)過夜包被iMICROT丨TER?多孔板（Thermo Scientific)，然後用 PBS中的2% (w/v)牛血清白蛋白在室溫（約23°C)下封閉2至5小時。在非吸附平板 (Nunc#269620)中，將100pM或26pM[125I]_抗原與目的Fab的系列稀釋混合（例如，與 Presta, L. G?等，Cancer Res. 57(1997)4593-4599 中的抗-VEGF 抗體，Fab-12 的評估一 致）。然後過夜孵育目的Fab ;但是，孵育可以持續更長時期（例如約65小時），以確保達 到平衡。然後，將混合物轉移至捕獲平板以在室溫下孵育（例如孵育1小時）。然後去除 溶液，用含〇. 1 %聚山梨酸酯20(TWEEN-20?)的pbs洗滌平板8次。平板乾燥時，加入 150 ill/孔的閃爍劑（MICR0SCINT-20? Packard)，在 TOPCOUNT 計數器（Packard)上 計數平板10分鐘。選擇給出小於或等於最大結合的20%的每種Fab的濃度用於競爭結合 測定法。
[0111] 根據另一實施方案，用?10個響應單位（RU)的固定化抗原CM5晶片，在25°C下使 用BIACORE?-2000或BIACORE ?-3000(BIAcore, Inc.，Piscataway, NJ)，用表 面等離振子共振測定法來測量Kd。簡言之，按照供應商的說明用N-乙基-N'-(3-二甲基氨 基丙基）_碳二亞胺鹽酸鹽（EDC)和N-羥基琥珀醯亞胺（NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物傳 感晶片（CM5, BIACORE, Inc.)。在按5 ill/分鐘的流速注入前，用10mM檸檬酸鈉pH 4. 8將 抗原稀釋至5 y g/ml (?0. 2 y M)，以達到約10個響應單位（RU)的偶聯蛋白質。注入抗原 後，注入1M乙醇胺來封閉未反應的基團。對於動力學測量，按約25 yl/分鐘的流速在25°C 下將兩倍系列稀釋的Fab (0. 78nM至500nM)注入含0. 05%聚山梨酸酯20 (TWEEN-20?)表面 活性劑的PBS(PBST)。通過同時擬合締合傳感圖和解離傳感圖，用簡單的一對一 Langmuir 結合模型（BIACORE @ Evaluation Software version 3.2)計算締合速率（kQn)和 解離速率GW)。將平衡解離常數（Kd)計算為比值。見例如Chen，Y.等，J. Mol. Biol. 293(1999)865-881。如果通過以上的表面等離子共振測定法締合速率超過lOH-1， 則可以通過使用螢光淬滅技術測定締合速率，所述螢光淬滅技術在如分光光度計（諸如配 有停留的分光光度計（Aviv Instruments)或具有攪拌的比色杯的8000系列SLM-AMINC0 TM分光光度計（ThermoSpectronic))測量的增加的濃度的抗原的存在下，測量25°C時PBS， pH 7. 2中的20nM抗-抗原抗體（Fab形式）的螢光發射強度（激發=295nm ;發射=340nm， 16nm帶通）的增加或降低。
[0112] 2?抗體片段
[0113] 在某些實施方案中，本文提供的抗體是抗體片段。抗體片段包括，但不限於， Fab、Fab'、Fab' -SH、F(ab'）2、Fv，和scFv片段，和下文描述的其他片段。某些抗體片段 的綜述參見Hudson, P.J.等人Nat.Med.9(2003):129-134。scFv片段的綜述參見例如 Plueckthun, A. , The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 和 Moore 編，Springer-Verlag, New York(1994),第 269-315 頁；也參見 W0 93/16185;和美國 專利號5, 571，894和5, 587, 458。關於包含補救受體結合表位殘基和具有增加的體內半壽 期的Fab和F(ab'）2片段的討論，參見美國專利號5, 869, 046。
[0114] 雙抗體是具有兩個抗原結合位點的抗體片段，其可為二價的或雙特異性的。參 見，例如，EP 0404, 097 ;W0 1993/01161 ;Hudson，P.J?等人 Nat. Med. 9 (2003): 129-134;和 Hollinger, P.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 (1993) :6444_6448。三鏈抗體和四鏈抗體 也在 Hudson, P. J.等人，Nat. Med. 9 (2003) : 129-134 中描述。
[0115] 單結構域抗體是包含抗體的全部或部分重鏈可變結構域或全部或部分輕 鏈可變結構域的抗體片段。在某些實施方案中，單結構域抗體是人單結構域抗體 (Domantis, Inc.，Waltham，MA ;參見，例如，美國專利號 6, 248, 516B1)。
[0116] 可以通過多種技術製備抗體片段，包括但不限於完整抗體的蛋白水解消化以及通 過重組宿主細胞（例如大腸桿菌或噬菌體）生產,如本文所述。
[0117] 3.嵌合抗體和人源化抗體
[0118] 在某些實施方案中，本文提供的抗體是嵌合抗體。例如，在美國專利號4, 816, 567 ; 和 Morrison, S.L.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(1984)6851-6855)中描述了某些嵌 合抗體。在一個實例中，嵌合抗體包含非人可變區（例如，源自小鼠、大鼠、倉鼠、兔、或非人 靈長動物，諸如猴的可變區）和人恆定區。在另外的實例中，嵌合抗體是"類別交換的"抗 體，其中類別或亞類已經從親本抗體的類別或亞類改變。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
[0119] 在某些實施方案中，嵌合抗體是人源化的抗體。通常，非人抗體經人源化以降低對 人的免疫原性，同時保持親本非人抗體的特異性和親和力。一般地，人源化的抗體包含一個 或多個可變結構域，其中HVR，例如，CDR(或其部分）源自非人抗體，並且FR(或其部分）源 自人抗體序列。人源化的抗體任選地也包含至少一部分人恆定區。在一些實施方案中，人 源化的抗體中的一些FR殘基被來自非人抗體（例如，HVR殘基源自的抗體）的對應的殘基 替換，例如，以恢復或提高抗體特異性或親和力。
[0120]人源化的抗體和製備其的方法在例如，Almagro, J. C?和Fransson, J.，Front. Biosci. 13(2008) 1619-1633 中綜述，並在例如，Riechmann, I.等人，Nature 332 (1988) 323-329 ;Queen，C.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033 ;US 專利號 5, 821，337, 7, 527, 791，6, 982, 321，和 7, 087, 409 ;Kashmiri, S. V.等人，Methods 36 (2005) 25-34 (描述 SDR (a-CDR)移植）；Padlan，E. A.，Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (描 述 了"表面重修"）；Dall'Acqua, W. F.等人，Methods 36 (2005) 43-60 (描述了 "FR 改 組"）；和 Osbourn, J.等人，Methods 36 (2005) 61-68 和 Klimka, A.等人，Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (描述了 FR改組的"導向選擇"方法）中進一步描述。
[0121] 可用於人源化的人框架區包括但不限於：使用"最適"方法選擇的框架區（參 見，例如，Sims, M.J.等人，J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308;源自特別亞組的輕鏈或重 鏈可變區的人抗體的共有序列的框架區（參見，例如，Carter, P.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(1992)4285-4289 ;和 Presta，L.G.等人，J. Immunol. 151 (1993)2623-2632 ; 人成熟（體細胞突變的）框架區或人種系框架區（參見，例如，Almagro, J. C?和 Fransson, J.，Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633);和源自篩選 FR 文庫的框架區（參見， 例如，Baca, M.等人，J. Biol. Chem. 272 (1997) : 10678-10684 和 Rosok, M. J.等人，了.81〇1. Chem. 271(1996)22611-22618)。
[0122] 4.多特異性抗體
[0123] 在某些實施方案中，本文提供的抗體是多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異 性抗體是具有對於至少兩個不同位點的結合特異性的單克隆抗體。在某些實施方案中，結 合特異性之一是對於茶鹼而另一種是對於任何其他抗原。在某些實施方案中，雙特異性抗 體可結合茶鹼的兩種不同表位。雙特異性抗體也可用於將細胞毒性劑定位至表達茶鹼的細 胞。雙特異性抗體可以作為全長抗體或抗體片段製備。
[0124] 用於製備多特異性抗體的技術包括，但不限於，重組共表達具有不同特異 性的兩條免疫球蛋白重鏈-輕鏈對（參見，Milstein，C.和Cuello, A. C.，Nature 305 (1983) 537-540, TO 93/08829,和 Traunecker, A.等人，EMBO J. 10 (1991) 3655-3659)， 和"結入孔（knob-in-hole)"改造（參見，例如，美國專利號5, 731,168)。也可以通 過改造靜電轉向效應以製備抗體Fc異二聚體分子（W0 2009/089004);交聯兩個或 多個抗體或片段（參見，例如，美國專利號4, 676, 980，和Brennan, M.等人，Science 229(1985)81-83 ;使用亮氨酸拉鏈生產雙特異性抗體（參見，例如，K〇stelny，S. A.等人，J. Immunol. 148(1992) 1547-1553 ;使用用於製備雙特異性抗體片段的"雙抗體"技術（參見， 例如，Holliger，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90(1993)6444-6448);和使用單鏈 Fv (sFv)二聚體（參見，例如 Gruber, M et al.，J. Immunol. 152(1994)5368-5374);和例如， 如Tutt, A.等人，J. Immunol. 147 (1991) 60-69中所述製備三特異性抗體，來製備多特異性 抗體。
[0125] 本文也包括具有三種或更多種功能性抗原結合位點的經改造的抗體，包括"章魚 抗體"（參見，例如 US 2006/0025576)。
[0126] 本文的抗體或片段也包括"雙作用Fab"或"DAF"，其包含結合茶鹼以及另一個，不 同抗原的抗原結合位點（參見，US 2008/0069820,例如）。
[0127] 本文的抗體或片段還可以包括W0 2009/080251、W0 2009/080252、W0 2009/080253、TO 2009/080254、TO 2010/112193、TO 2010/115589、TO 2010/136172、TO 2010/145792和W0 2010/145793中所述的多特異性抗體。
[0128] 5.抗體變體
[0129] 在某些實施方案中，設想本文提供的抗體的胺基酸序列變體。例如，提高抗體的結 合親和力和/或其他生物學性質可以是理想的。可以通過將適當的修飾引入編碼抗體的核 苷酸序列，或者通過肽合成製備抗體的胺基酸序列變體。此類修飾包括，例如，在抗體的氨 基酸序列內缺失，和/或插入和/或替換殘基。可以使得缺失、插入，和替換的任意組合達 到最終的構建體中，前提是最終構建體擁有期望的特徵，例如，抗原結合。
[0130] a)替換、插入，和缺失變體
[0131] 在某些實施方案中，提供了具有一個或多個胺基酸替換的抗體變體。替換誘變的 目標位點包括HVR和FR。在表1中標題"優選替換"下顯示保守替換。在表1中標題"示 例性替換"下提供更實質的改變，並如參考胺基酸側鏈類別在下文進一步描述的。可以將氨 基酸替換引入到目標抗體中並篩選產物的期望的活性，例如，保留的/提高的抗體結合，降 低的免疫原性，或提高的ADCC或CDC。
[0132]表 1
[0133]

【權利要求】
1. 抗茶鹼抗體，其中抗體包含：(a)含有SEQ ID N0:03的胺基酸序列的HVR-H3;(b) 含有SEQ ID N0:07的胺基酸序列的HVR-L3 ;和（c)含有SEQ ID N0:02的胺基酸序列的 HVR-H2。
2. 權利要求1的抗體，其中抗體包含：（a)含有SEQ ID N0:01的胺基酸序列的HVR-H1 ; (b)含有SEQ ID N0:02的胺基酸序列的HVR-H2 ;和（c)含有SEQ ID N0:03的胺基酸序列 的 HVR-H3。
3. 根據前述權利要求中任一項的抗體，其中抗體包含：（a)含有SEQ ID N0:05的氨 基酸序列的HVR-L1 ; (b)含有SEQ ID N0:06的胺基酸序列的HVR-L2 ;和（c)含有SEQ ID N0:07的胺基酸序列的HVR-L3。
4. 根據前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於它是人源化抗體，且在根據Kabat 編號的重鏈可變結構域的71位包含胺基酸殘基精氨酸。
5. 根據前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於它是人源化抗體，且在根據Kabat 編號的輕鏈可變結構域的46位包含胺基酸殘基亮氨酸。
6. 根據前述權利要求中任一項的抗體，其包含： (a) 與SEQ ID N0:04的胺基酸序列具有至少95%序列同一性的VH序列； (b) 與SEQ ID N0:08的胺基酸序列具有至少95%序列同一性的VL序列；或 (c) 如（a)中的VH序列和如（b)中的VL序列； 其中根據Kabat編號的重鏈可變結構域的71位胺基酸殘基是精氨酸，且根據Kabat編 號的輕鏈可變結構域的46位胺基酸殘基是亮氨酸。
7. 權利要求4的抗體，其包含SEQ ID NO:04的VH序列。
8. 權利要求4或7中任一項的抗體，其包含SEQ ID NO:08的VL序列。
9. 抗體，其包含3￡〇10勵:04的711序列和5￡〇10勵:08的￥1序列。
10. 前述權利要求中任一項的抗體，其是全長IgGl抗體或全長IgG4抗體。
11. 根據前述權利要求中任一項的抗體，其是單克隆抗體。
12. 根據前述權利要求中任一項的抗體，其是結合茶鹼的抗體片段。
13. 藥物製劑，其包含根據前述權利要求中任一項的抗體和可藥用載體。
14. 權利要求1至12中任一項的抗體，其用作藥物。
15. 權利要求1至12中任一項的抗體在製備藥物中的用途。
【文檔編號】C07K16/44GK104394886SQ201380034688
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2013年7月4日 優先權日:2012年7月4日
【發明者】U·布林克曼, G·喬治斯, E·霍夫曼 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司