一種羌活組織培養離體快速繁殖方法

2023-06-30 11:59:11

專利名稱：一種羌活組織培養離體快速繁殖方法
技術領域：
本發明涉及一種植物的組織培養和離體快速繁殖，尤其涉及一種羌活組織培養離體快速繁殖方法。
背景技術：
蕪;活是傘形科(UmbelIiferae)憲活屬iNotopterygium)多年生植物,為我國特有的重要瀕危植物，是中、藏、羌藥中最常用的藥材之一，也是市場缺口較大的中藏藥材。羌活以根狀莖及根入藥，味辛、性溫，有散表寒、祛風溼利關節等功效，主治感冒風溼、發熱頭痛、、皮膚瘙癢、風水浮腫等症。我國曆版藥典對羌活均有收載，據《中華人民共和國藥典》2005年版一部，為傘形科(Umbelliferae)多年生草本植物蕪;活incisum Tingex H. T. Chang)和寬葉憲活(A forbesii Boissieu)的乾燥根莖及根,用藥開發歷史悠久。依據藥材性狀一般劃分為蠶羌、竹節羌、大頭羌和條羌4個商品等級。按產地不同分為川羌(四川)和西羌(青海、甘肅等)。青海是羌活藥材的道地產區，暢銷全國並出口，主產果洛、玉樹、黃南、海東等地2800米以上的高海拔山區。羌活藥材長期依賴野生採挖來滿足國內外市場需求，種質資源破壞嚴重、蘊藏量急劇減少，羌活種群遭到了毀滅性破壞，致使其資源已無法滿足市場需要。尤其是近年來隨著國內外對羌活需求量的增加，供需矛盾日益突出，加之利益驅使，大量掠奪性採挖，使羌活逐漸成為瀕危植物，面臨物種喪失，資源枯竭的危險，進行種質資源保護和擴大羌活繁育勢在必行。植物組織培養技術是利用細胞的全能性(即個體的某個器官或組織已經分化的細胞再生成完整個體的遺傳潛力。)，取植物個體上的細胞團或組織，通過人工配製的培養基，使這些細胞團或組織形成成千上萬個植株。利用組織培養進行離體快速繁殖有以下幾方面重要意義⑴繁殖速度快，不受外界氣候因素影響，一年四季在室內均可快速大量繁殖；(2)便於保持優良生物學特性；⑶在保存和繁育優良突變體或優良雜種一代方面有非常重要的意義，一株具有明顯優勢的羌活突變體或一個具明顯優勢的後代經組織培養後可大面積推
I 寸寸。文獻報導了眾多高山野生藥材的組織培養，如雪蓮、紅景天等，但以野生羌活幼葉為外植體的組織培養尚未見報導。從野外採集的外植體，其表面滋生大量細菌和真菌等微生物，有的甚至長到組織內部；加之羌活所含醌類、酚類物質較多，很容易氧化褐變，因此對外植體材料的選擇和消毒處理方法都是非常關鍵。本發明首次採用幼葉外植體組織培養方法，開展野生羌活種質離體繁殖研究工作，這為挽救珍稀瀕危羌活種質資源，開展遺傳改良、促進羌活的工廠化育苗提供了一條新途徑。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種易於操作、可進行大規模工廠化生產的羌活組織培養離體快速繁殖方法。
為解決上述問題，本發明所述的一種羌活組織培養離體快速繁殖方法，包括以下步驟
⑴外植體的選擇和消毒處理以羌活的幼葉為外植體，經流水衝洗1(T20分鐘，再用體積濃度為75%的 酒精浸泡滅菌15 30秒，然後以無菌去離子水衝洗2 3次，再將衝洗後的外植體置於質量濃度為0. 19T0. 2%的升汞中，浸泡滅菌51分鐘，並用無菌去離子水衝洗3飛次，即得消毒後的外植體；
⑵外植體接種將所述消毒後的外植體切成0. ro. 5cm2的小塊，接種在愈傷組織誘導培養基上，其中每25ml所述愈傷組織誘導培養基中接種3小塊所述消毒後的外植體；在溫度為20V ±2°C、光源為日光燈、光強為30 60 umol . nT2. S—1、光照時間為12 h cf1的條件下培養10 25天，在幼葉切口處膨大形成愈傷組織；
⑶愈傷組織增殖將所述愈傷組織接種到愈傷組織增殖培養基上，其中每25ml所述愈傷組織增殖培養基中接種2塊所述愈傷組織；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為30^60 umol . nT2. S—1、光照時間為12 h cf1的條件下愈傷組織增殖20 35天，長出乳白色、顆粒狀緻密性的愈傷組織；
⑷愈傷組織的芽誘導將所述步驟⑶所得到的愈傷組織接種到誘芽培養基上，其中每25ml所述誘芽培養基中接種2塊所述愈傷組織；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為30 60 umol . nT2. S—1、光照時間為12 h cf1的條件下培養30 35天，形成叢生羌活苗；
(5)生根誘導將所述叢生羌活苗分株後轉入生根培養基中，其中每25ml所述生根培養基中接種I棵所述叢生羌活苗；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為3(T60 umol .m_2. s'光照時間為12 h .cf1的條件下培養2(T30天後，小苗基部出現白色、粗壯短根，並長出完整根系，即得完整再生小苗；
(6)育苗基質消毒將育苗基質在115 121°C溫度下進行高溫消毒，15 20min後即得消毒後的育苗基質；所述育苗基質是指腐殖質與珍珠巖按2 1重量比混合而成的混合基質；
(7)植株移栽將所述完整再生小苗直接移栽到所述消毒後的育苗基質中，煉苗後即長成正常羌活植株；所述一棵完整再生小苗種植在所述消毒後的育苗基質IOcm2的範圍內。所述步驟⑴中的羌活的基源植物為傘形科多年生草本植物羌活。所述步驟⑵中的愈傷組織誘導培養基是指在1000ml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液IOml,有機成分母液IOml,鐵鹽母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液5 20ml，濃度為
0.lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液2 10ml，後加雙蒸餾水至1000ml刻度處，攪勻後，加入ImMNaOH溶液調整pH值至5. 8，最後加入瓊脂粉6. 0^8. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經121°C高溫消毒即得。所述步驟⑶中的愈傷組織增殖培養基是指在1000ml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液IOml,有機成分母液IOml,鐵鹽母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液l(Tl5ml，濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5 10ml，後加雙蒸餾水至1000ml刻度處，攪勻後，加入ImMNaOH溶液調整pH值至5. 8，最後加入瓊脂粉6. 0^8. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經121°C高溫消毒即得。所述步驟⑷中的誘芽培養基是指在1000ml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液l(T20ml，濃度為0. Img/ml的萘乙酸(NAA)母液2 10ml，後加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻後，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最後加入瓊脂粉6. (T8. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經121°C高溫消毒即得。
所述步驟(5)中的生根培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液50ml，微量元素母液IOml，有機成分母液IOml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的吲哚丁酸(IBA)母液5 15ml，後加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻後，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最後加入瓊脂粉6. 0 8.0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經121°C高溫消毒即得。所述步驟(6)中的育苗基質的總孔隙度為70% 75%，有機質含量為20%。所述大量元素母液是指含有硝酸銨(NH4NO3) 1650mg/L,硝酸鉀(KNO3) 1900mg/L,硫酸鎂(MgSO4) 370mg/L，磷酸二氫鉀(KH2PO4) 170mg/L,氯化鈣(CaCl2_ 2H20)440mg/L 的混合液。所述微量元素母液是指含有硫酸錳(MnSO4 4H20) 22. 3mg/L，硫酸鋅(ZnSO4 7H20)8. 6mg/L，硼酸(H3BO3) 6. 2mg/L，碘化鉀(KI) 0. 83mg/L，鑰酸鈉(NaMoO4 2H20)0. 25mg/L，硫酸銅(CuSO4 5H20) 0. 025mg/L,氯化鈷(CoCl2'6H20) 0. 025mg/L 的混合液。所述有機成分母液是指含有甘氨酸2mg/L，鹽酸硫胺素0. lmg/L,鹽酸吡哆醇0. 5mg/L,煙酸0. 5mg/L,肌醇100mg/L的混合液。所述鐵鹽母液是指含有硫酸亞鐵(FeSO47H20) 27. 8mg/L, Na2 EDTA- 2H20 37. 3 mg/L的混合液。本發明與現有技術相比具有以下優點
I、本發明首次採用幼葉外植體通過生物工程技術一組織培養技術進行組織培養，克服了羌活育苗周期過長(2年)、繁殖係數低的問題；同時開展野生羌活種質資源離體繁殖研究工作，為挽救珍稀瀕危羌活種質資源，開展遺傳改良、促進羌活的工廠化育苗提供了一條新途徑，提供了一種能進行羌活的人工繁殖、種質資源離體保存、利用及選育藥用成分含量高的突變系的組織培養離體繁殖方法。2、由於本發明所用培養基中含有植物激素2，4-D和6-BA，2，4_D激素屬細胞生長素類，此生長素的生理作用主要是促進細胞伸長生長和細胞分裂，具有誘導受傷的組織表面一至數層細胞恢復分裂能力的特點；6-BA激素屬細胞分裂素類，具有誘導芽分化的主導作用，因此誘發時間短、出苗快、增殖頻率高，尤其出苗齊，煉苗後可直接成活，易於操作，可進行大規模工廠化生產。3、本發明利用組織培養進行離體快速繁殖有以下幾方面重要意義⑴繁殖速度快，不受外界氣候因素影響，一年四季在室內均可快速大量繁殖，即啟動快；⑵便於保持優良生物學特性，即同步性好；(3)在保存和繁育優良突變體或優良雜種一代方面有非常重要的意義，一株具有明顯優勢的羌活突變體或一個具明顯優勢的後代經組織培養後可大面積推廣等等。
具體實施方式
實施例I 一種羌活組織培養離體快速繁殖方法，包括以下步驟
⑴外植體的選擇和消毒處理以羌活的幼葉為外植體，經流水衝洗10分鐘，再用體積濃度為75%的酒精浸泡滅菌15秒，然後以無菌去離子水衝洗2 3次，再將衝洗後的外植體置於質量濃度為0. 1%的升汞中，浸泡滅菌8分鐘，並用無菌去離子水衝洗3次，最後用無菌濾紙吸乾水分即得消毒後的外植體。⑵外植體接種將消毒後的外植體切成0. 3^0. 5cm2的小塊，接種在愈傷組織誘導培養基上，其中每25ml愈傷組織誘導培養基中接種3小塊消毒後的外植體；在溫度為200C ±2°C、光源為日光燈、光強為30 60 umol . nT2. S—1、光照時間為12 h cf1的條件下培養1(T15天，在幼葉切口處膨大形成愈傷組織。愈傷組織誘導培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微 量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液5ml,濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液2ml，後加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻後，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最後加入瓊脂粉6.0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經121°C高溫消毒即得。⑶愈傷組織增殖將愈傷組織接種到愈傷組織增殖培養基上,其中每25ml愈傷組織增殖培養基中接種2塊愈傷組織；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為3(T60umol . m_2. s'光照時間為12 h . cf1的條件下愈傷組織增殖2(T25天，長出乳白色、顆粒狀緻密性的愈傷組織。愈傷組織增殖培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液IOml,濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml，後加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻後，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最後加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經121°C高溫消毒即得。⑷愈傷組織的芽誘導將步驟⑶所得到的愈傷組織接種到誘芽培養基上，其中每25ml誘芽培養基中接種2塊愈傷組織；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為30飛0umol . m_2. s'光照時間為12 h cf1的條件下培養3(T35天，形成叢生羌活苗。誘芽培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液10ml，濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液2ml，後加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻後，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最後加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經121°C高溫消毒即得。(5)生根誘導將叢生羌活苗分株，即在無菌超淨工作檯內，打開瓶口封口膜，用消過毒的鑷子將生長旺盛的苗從叢生苗中分剝下來，然後轉入生根培養基中，其中每25ml生根培養基中接種I棵叢生羌活苗；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為3(T60 umol.m_2. s'光照時間為12 h .cf1的條件下培養2(T30天後，小苗基部出現白色、粗壯短根，並長出完整根系，即得完整再生小苗，該完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，並已長出了小葉片，可以獨立進行自養生長的幼小植株。
生根培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液50ml,微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的卩引哚丁酸(IBA)母液5ml,後加雙蒸懼水至IOOOml刻度處,攪勻後,加入ImMNaOH溶液調整pH值至5. 8，最後加入瓊脂粉6. 5克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經121°C高溫消毒即得。(6)育苗基質消毒將育苗基質在115 121°C溫度下進行高溫消毒，15^20min後即得消毒後的育苗基質。其中育苗基質是指腐殖質與珍珠巖按2 1重量比混合而成的混合基質，該育苗基質的總孔隙度為709^75%，有機質含量為20%。(7)植株移栽將完整再生小苗直接移栽到消毒後的育苗基質中，煉苗後即長成正常羌活植株，一般成活率在70%以上；一棵完整再生小苗種植在消毒後的育苗基質IOcm2的範圍內。 實施例2 —種羌活組織培養離體快速繁殖方法，包括以下步驟
⑴外植體的選擇和消毒處理以羌活的幼葉為外植體，經流水衝洗15分鐘，再用體積濃度為75%的酒精浸泡滅菌20秒，然後以無菌去離子水衝洗2次，再將衝洗後的外植體置於質量濃度為0. 2%的升汞中，浸泡滅菌6分鐘，並用無菌去離子水衝洗5次，最後用無菌濾紙吸乾水分即得消毒後的外植體。⑵外植體接種將消毒後的外植體切成0. 3^0. 5cm2的小塊，接種在愈傷組織誘導培養基上，其中每25ml愈傷組織誘導培養基中接種3小塊消毒後的外植體；在溫度為200C ±2°C、光源為日光燈、光強為30 60 umol . nT2. S—1、光照時間為12 h cf1的條件下培養15 20天，在幼葉切口處膨大形成愈傷組織。愈傷組織誘導培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液IOml,濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml，後加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻後，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最後加入瓊脂粉6. 5克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經121°C高溫消毒即得。⑶愈傷組織增殖將愈傷組織接種到愈傷組織增殖培養基上,其中每25ml愈傷組織增殖培養基中接種2塊愈傷組織；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為3(T60umol . m_2. s'光照時間為12 h . cf1的條件下愈傷組織增殖3(T35天，長出乳白色、顆粒狀緻密性的愈傷組織。愈傷組織增殖培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液12ml,濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液10ml，後加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻後，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最後加入瓊脂粉6. 5克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經121°C高溫消毒即得。⑷愈傷組織的芽誘導將步驟⑶所得到的愈傷組織接種到誘芽培養基上，其中每25ml誘芽培養基中接種2塊愈傷組織；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為30飛0umol . m_2. s'光照時間為12 h cf1的條件下培養3(T35天，形成叢生羌活苗。誘芽培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液15ml，濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml，後加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻後，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最後加入瓊脂粉6. 5克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經121°C高溫消毒即得。(5)生根誘導將叢生羌活苗分株，即在無菌超淨工作檯內，打開瓶口封口膜，用消過毒的鑷子將生長旺盛的苗從叢生苗中分剝下來，然後轉入生根培養基中，其中每25ml生根培養基中接種I棵叢生羌活苗；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為3(T60 umol.m_2. s'光照時間為12 h .cf1的條件下培養2(T30天後，小苗基部出現白色、粗壯短根，並長出完整根系，即得完整再生小苗，該完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，並已長出了小葉片，可以獨立進行自養生長的幼小植株。生根培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液50ml,微量元素母液 10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的卩引哚丁酸(IBA)母液IOml,後加雙蒸懼水至IOOOml刻度處,攪勻後，加入ImMNaOH溶液調整pH值至5. 8，最後加入瓊脂粉6. 5克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經121°C高溫消毒即得。(6)育苗基質消毒將育苗基質在115 121°C溫度下進行高溫消毒，15^20min後即得消毒後的育苗基質。其中育苗基質是指腐殖質與珍珠巖按2 1重量比混合而成的混合基質，該育苗基質的總孔隙度為709^75%，有機質含量為20%。(7)植株移栽將完整再生小苗直接移栽到消毒後的育苗基質中，煉苗後即長成正常羌活植株，一般成活率在70%以上；一棵完整再生小苗種植在消毒後的育苗基質IOcm2的範圍內。實施例3 —種羌活組織培養離體快速繁殖方法，包括以下步驟
⑴外植體的選擇和消毒處理以羌活的幼葉為外植體，經流水衝洗15分鐘，再用體積濃度為75%的酒精浸泡滅菌30秒，然後以無菌去離子水衝洗3次，再將衝洗後的外植體置於質量濃度為0. 15%的升汞中，浸泡滅菌7分鐘，並用無菌去離子水衝洗4次，最後用無菌濾紙吸乾水分即得消毒後的外植體。⑵外植體接種將消毒後的外植體切成0. ro. 3cm2的小塊，接種在愈傷組織誘導培養基上，其中每25ml愈傷組織誘導培養基中接種3小塊消毒後的外植體；在溫度為200C ±2°C、光源為日光燈、光強為30 60 umol . nT2. S—1、光照時間為12 h cf1的條件下培養2(T25天，在幼葉切口處膨大形成愈傷組織。愈傷組織誘導培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液15ml,濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液10ml，後加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻後，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最後加入瓊脂粉7. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經121°C高溫消毒即得。
⑶愈傷組織增殖將愈傷組織接種到愈傷組織增殖培養基上,其中每25ml愈傷組織增殖培養基中接種2塊愈傷組織；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為3(T60umol . m_2. s'光照時間為12 h . cf1的條件下愈傷組織增殖25 35天，長出乳白色、顆粒狀緻密性的愈傷組織。愈傷組織增殖培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液15ml,濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液8ml，後加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻後，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最後加入瓊脂粉7. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經121°C高溫消毒即得。⑷愈傷組織的芽誘導將步驟⑶所得到的愈傷組織接種到誘芽培養基上，其中每25ml誘芽培養基中接種2塊愈傷組織；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為30飛0umol . m_2. s'光照時間為12 h cf1的條件下培養3(T35天，形成叢生羌活苗。誘芽培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液15ml，濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液IOml，後加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻後，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最後加入瓊脂粉7. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經121°C高溫消毒即得。(5)生根誘導將叢生羌活苗分株，即在無菌超淨工作檯內，打開瓶口封口膜，用消過毒的鑷子將生長旺盛的苗從叢生苗中分剝下來，然後轉入生根培養基中，其中每25ml生根培養基中接種I棵叢生羌活苗；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為3(T60 umol.m_2. s'光照時間為12 h .cf1的條件下培養2(T30天後，小苗基部出現白色、粗壯短根，並長出完整根系，即得完整再生小苗，該完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，並已長出了小葉片，可以獨立進行自養生長的幼小植株。生根培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液50ml,微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的卩引哚丁酸(IBA)母液15ml,後加雙蒸懼水至IOOOml刻度處,攪勻後，加入ImMNaOH溶液調整pH值至5. 8，最後加入瓊脂粉6. 5克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經121°C高溫消毒即得。(6)育苗基質消毒將育苗基質在115 121°C溫度下進行高溫消毒，15^20min後即得消毒後的育苗基質。其中育苗基質是指腐殖質與珍珠巖按2 1重量比混合而成的混合基質，該育苗基質的總孔隙度為709^75%，有機質含量為20%。(7)植株移栽將完整再生小苗直接移栽到消毒後的育苗基質中，煉苗後即長成正常羌活植株，一般成活率在70%以上；一棵完整再生小苗種植在消毒後的育苗基質IOcm2的範圍內。實施例4 一種羌活組織培養離體快速繁殖方法，包括以下步驟 ⑴外植體的選擇和消毒處理以羌活的幼葉為外植體，經流水衝洗13分鐘，再用體積濃度為75%的酒精浸泡滅菌30秒，然後以無菌去離子水衝洗3次，再將衝洗後的外植體置於質量濃度為0. 15%的升汞中，浸泡滅菌8分鐘，並用無菌去離子水衝洗5次，最後用無菌濾紙吸乾水分即得消毒後的外植體。⑵外植體接種將消毒後的外植體切成0. ro. 3cm2的小塊，接種在愈傷組織誘導培養基上，其中每25ml愈傷組織誘導培養基中接種3小塊消毒後的外植體；在溫度為200C ±2°C、光源為日光燈、光強為30 60 umol . nT2. S—1、光照時間為12 h cf1的條件下培養2(T25天，在幼葉切口處膨大形成愈傷組織。愈傷組織誘導培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液20ml,濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml，後加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻後，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最後加入瓊脂粉8.0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經121°C高溫消毒即 得。⑶愈傷組織增殖將愈傷組織接種到愈傷組織增殖培養基上,其中每25ml愈傷組織增殖培養基中接種2塊愈傷組織；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為3(T60umol . m_2. s'光照時間為12 h . cf1的條件下愈傷組織增殖25 30天，長出乳白色、顆粒狀緻密性的愈傷組織。愈傷組織增殖培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液15ml,濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液10ml，後加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻後，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最後加入瓊脂粉8.0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經121°C高溫消毒即得。⑷愈傷組織的芽誘導將步驟⑶所得到的愈傷組織接種到誘芽培養基上，其中每25ml誘芽培養基中接種2塊愈傷組織；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為30飛0umol . m_2. s'光照時間為12 h cf1的條件下培養3(T35天，形成叢生羌活苗。誘芽培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液20ml，濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液2ml，後加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻後，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最後加入瓊脂粉8. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經121°C高溫消毒即得。(5)生根誘導將叢生羌活苗分株，即在無菌超淨工作檯內，打開瓶口封口膜，用消過毒的鑷子將生長旺盛的苗從叢生苗中分剝下來，然後轉入生根培養基中，其中每25ml生根培養基中接種I棵叢生羌活苗；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為3(T60 umol.m_2. s'光照時間為12 h .cf1的條件下培養2(T30天後，小苗基部出現白色、粗壯短根，並長出完整根系，即得完整再生小苗，該完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，並已長出了小葉片，可以獨立進行自養生長的幼小植株。生根培養基是指在1000ml的燒杯中，依次加入大量元素母液50ml,微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的卩引哚丁酸(IBA)母液8ml,後加雙蒸懼水至1000ml刻度處,攪勻後,加入ImMNaOH溶液調整pH值至5. 8，最後加入瓊脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經121°C高溫消毒即得。(6)育苗基質消毒將育苗基質在115 121°C溫度下進行高溫消毒，15^20min後即得消毒後的育苗基質。其中育苗基質是指腐殖質與珍珠巖按2 1重量比混合而成的混合基質，該育苗基質的總孔隙度為709^75%，有機質含量為20%。(7)植株移栽將完整再生小苗直接移栽到消毒後的育苗基質中，煉苗後即長成正常羌活植株，一般成活率在70%以上；一棵完整再生小苗種植在消毒後的育苗基質IOcm2的範圍內。實施例5 —種羌活組織培養離體快速繁殖方法，包括以下步驟
⑴外植體的選擇和消毒處理以羌活的幼葉為外植體，經流水衝洗20分鐘，再用體積濃度為75%的酒精浸泡滅菌25秒，然後以無菌去離子水衝洗2 3次，再將衝洗後的外植體置於質量濃度為0. 2%的升汞中，浸泡滅菌5分鐘，並用無菌去離子水衝洗6次，最後用無菌濾紙吸乾水分即得消毒後的外植體。⑵外植體接種將消毒後的外植體切成0. ro. 3cm2的小塊，接種在愈傷組織誘導培養基上，其中每25ml愈傷組織誘導培養基中接種3小塊消毒後的外植體；在溫度為200C ±2°C、光源為日光燈、光強為30 60 umol . nT2. S—1、光照時間為12 h cf1的條件下培養2(T25天，在幼葉切口處膨大形成愈傷組織。愈傷組織誘導培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液15ml,濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml，後加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻後，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最後加入瓊脂粉7.0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經121°C高溫消毒即得。⑶愈傷組織增殖將愈傷組織接種到愈傷組織增殖培養基上,其中每25ml愈傷組織增殖培養基中接種2塊愈傷組織；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為3(T60umol . m_2. s'光照時間為12 h . cf1的條件下愈傷組織增殖25 35天，長出乳白色、顆粒狀緻密性的愈傷組織。愈傷組織增殖培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液IOml,濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml，後加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻後，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最後加入瓊脂粉7.0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經121°C高溫消毒即得。⑷愈傷組織的芽誘導將步驟⑶所得到的愈傷組織接種到誘芽培養基上，其中每25ml誘芽培養基中接種2塊愈傷組織；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為30飛0umol . m_2. s'光照時間為12 h cf1的條件下培養3(T35天，形成叢生羌活苗。誘芽培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液10ml，濃度為0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml，後加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻後，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最後加入瓊脂粉7. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經121°C高溫消毒即得。(5)生根誘導將叢生羌活苗分株，即在無菌超淨工作檯內，打開瓶口封口膜，用消過毒的鑷子將生長旺盛的苗從叢生苗中分剝下來，然後轉入生根培養基中，其中每25ml生根培養基中接種I棵叢生羌活苗；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為3(T60 umol.m_2. s'光照時間為12 h .cf1的條件下培養2(T30天後，小苗基部出現白色、粗壯短根，並長出完整根系，即得完整再生小苗，該完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，並已長出了小葉片，可以獨立進行自養生長的幼小植株。生根培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液50ml,微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為
0. lmg/ml的吲哚丁酸(IBA)母液12ml，後加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻後，加入ImMNaOH溶液調整pH值至5. 8，最後加入瓊脂粉8. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經121°C高溫消毒即得。(6)育苗基質消毒將育苗基質在115 121°C溫度下進行高溫消毒，15^20min後即得消毒後的育苗基質。其中育苗基質是指腐殖質與珍珠巖按2 1重量比混合而成的混合基質，該育苗基質的總孔隙度為709^75%，有機質含量為20%。(7)植株移栽將完整再生小苗直接移栽到消毒後的育苗基質中，煉苗後即長成正常羌活植株，一般成活率在70%以上；一棵完整再生小苗種植在消毒後的育苗基質IOcm2的範圍內。上述實施例1飛中的羌活的基源植物為傘形科多年生草本植物羌活(.Notopterygium incisum Ting ex H. T. Chang);超淨工作檯，型號為 BCM-1000A,由蘇州安泰空氣技術有限公司生產。愈傷組織誘導培養基、愈傷組織增殖培養基、誘芽培養基、生根培養基中大量元素母液是指含有硝酸銨(NH4NO3) 1650mg/L，硝酸鉀(KNO3) 1900mg/L，硫酸鎂(MgSO4) 370mg/L，磷酸二氫鉀(KH2PO4) 170mg/L，氯化鈣(CaCl2_2H20) 440mg/L的混合液；微量元素母液是指含有硫酸錳(MnSO4 4H20) 22. 3mg/L，硫酸鋅(ZnSO4 7H20) 8. 6mg/L,硼酸(H3BO3) 6. 2mg/L,碘化鉀(KI) 0. 83mg/L,鑰酸鈉(NaMoO4 2H20) 0. 25mg/L,硫酸銅(CuSO4 5H20) 0. 025mg/L,氯化鈷(CoC12_6H20) 0. 025mg/L的混合液；有機成分母液是指含有甘氨酸2mg/L，鹽酸硫胺素
0.lmg/L,鹽酸卩比卩多醇0. 5mg/L,煙酸0. 5mg/L,肌醇100mg/L的混合液；鐵鹽母液是指含有硫酸亞鐵(FeSO4 7H20) 27. 8mg/L，Na2 EDTA.2H20 37. 3 mg/L 的混合液。
權利要求
1.一種羌活組織培養離體快速繁殖方法，包括以下步驟 ⑴外植體的選擇和消毒處理以羌活的幼葉為外植體，經流水衝洗1(T20分鐘，再用體積濃度為75%的酒精浸泡滅菌15 30秒，然後以無菌去離子水衝洗2 3次，再將衝洗後的外植體置於質量濃度為0. 19T0. 2%的升汞中，浸泡滅菌51分鐘，並用無菌去離子水衝洗3飛次，即得消毒後的外植體； ⑵外植體接種將所述消毒後的外植體切成0. ro. 5cm2的小塊，接種在愈傷組織誘導培養基上，其中每25ml所述愈傷組織誘導培養基中接種3小塊所述消毒後的外植體；在溫度為20V ±2°C、光源為日光燈、光強為30 60 umol . m—2. s—1、光照時間為12 h cf1的條件下培養10 25天，在幼葉切ロ處膨大形成愈傷組織； ⑶愈傷組織増殖將所述愈傷組織接種到愈傷組織増殖培養基上，其中每25ml所述愈傷組織増殖培養基中接種2塊所述愈傷組織；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為30^60 umol . HT2. S—1、光照時間為12 h cf1的條件下愈傷組織増殖20 35天，長出乳白色、顆粒狀緻密性的愈傷組織； ⑷愈傷組織的芽誘導將所述步驟⑶所得到的愈傷組織接種到誘芽培養基上，其中每25ml所述誘芽培養基中接種2塊所述愈傷組織；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為30 60 umol . HT2. S—1、光照時間為12 h cf1的條件下培養30 35天，形成叢生羌活苗； (5)生根誘導將所述叢生羌活苗分株後轉入生根培養基中，其中每25ml所述生根培養基中接種I棵所述叢生羌活苗；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為3(T60 umol .m_2. s'光照時間為12 h .cf1的條件下培養2(T30天後，小苗基部出現白色、粗壯短根，並長出完整根系，即得完整再生小苗； (6)育苗基質消毒將育苗基質在115 121°C溫度下進行高溫消毒，15 20min後即得消毒後的育苗基質；所述育苗基質是指腐殖質與珍珠巖按2 1重量比混合而成的混合基質； (7)植株移栽將所述完整再生小苗直接移栽到所述消毒後的育苗基質中，煉苗後即長成正常羌活植株；所述ー棵完整再生小苗種植在所述消毒後的育苗基質IOcm2的範圍內。
2.如權利要求I所述的ー種羌活組織培養離體快速繁殖方法，其特徵在於所述步驟⑴中的羌活的基源植物為傘形科多年生草本植物羌活。
3.如權利要求I所述的ー種羌活組織培養離體快速繁殖方法，其特徵在於所述步驟⑵中的愈傷組織誘導培養基是指在1000ml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液IOml,有機成分母液IOml,鐵鹽母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml,鹿糖30克，濃度為0. lmg/ml的2，4- ニ氯苯氧こ酸母液5 20ml,濃度為0. lmg/ml的萘こ酸母液2 10ml，後加雙蒸餾水至1000ml刻度處，攪勻後，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最後加入瓊脂粉6. (T8.0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為ー瓶，經121°C高溫消毒即得。
4.如權利要求I所述的ー種羌活組織培養離體快速繁殖方法，其特徵在於所述步驟⑶中的愈傷組織增殖培養基是指在1000ml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液IOml,有機成分母液IOml,鐵鹽母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml,鹿糖30克，濃度為0. lmg/ml的2，4-ニ氯苯氧こ酸母液l(Tl5ml,濃度為0. lmg/ml的萘こ酸母液5 10ml，後加雙蒸餾水至1000ml刻度處，攪勻後，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最後加入瓊脂粉6. (T8. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為ー瓶，經121°C高溫消毒即得。
5.如權利要求I所述的ー種羌活組織培養離體快速繁殖方法，其特徵在於所述步驟⑷中的誘芽培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液IOml，有機成分母液IOml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為.0. lmg/ml的6-節氨基腺嘌呤母液l(T20ml,濃度為0. lmg/ml的萘こ酸母液2 IOml,後加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻後，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最後加入瓊脂粉.6.(T8. 0克，在I OOml三角瓶中每25ml分裝為ー瓶，經121°C高溫消毒即得。
6.如權利要求I所述的ー種羌活組織培養離體快速繁殖方法，其特徵在於所述步驟(5)中的生根培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液50ml，微量元素母液.1Oml，有機成分母液IOml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為.0. lmg/ml的卩引哚丁酸母液5 15ml,後加雙蒸懼水至IOOOml刻度處,攪勻後,加入ImM NaOH溶液調整PH值至5. 8，最後加入瓊脂粉6. (T8. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為ー瓶，經121°C高溫消毒即得。
7.如權利要求I所述的ー種羌活組織培養離體快速繁殖方法，其特徵在於所述步驟(6)中的育苗基質的總孔隙度為709^75%，有機質含量為20%。
全文摘要
本發明涉及一種羌活組織培養離體快速繁殖方法，該方法包括以下步驟⑴外植體的選擇和消毒處理以羌活的幼葉為外植體，經浸泡滅菌、衝洗，即得消毒後的外植體；⑵外植體接種將消毒後的外植體切塊，接種在形成愈傷組織；⑶愈傷組織增殖將愈傷組織接種進行增殖，形成緻密的愈傷組織；⑷愈傷組織的芽誘導將緻密的愈傷組織接種形成叢生羌活苗；⑸生根誘導將叢生羌活苗分株後接種培養，得完整再生小苗；⑹育苗基質消毒；⑺植株移栽將完整再生小苗直接移栽到消毒後的育苗基質中，煉苗後即長成正常羌活植株。本發明克服羌活育苗周期過長、繁殖係數低的問題，易於操作、可進行工廠化快速育苗。
文檔編號A01H4/00GK102657087SQ20121014378
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月10日 優先權日2012年5月10日
發明者劉衛根, 周國英, 徐文華, 李春麗, 楊路存, 賀麗華 申請人:中國科學院西北高原生物研究所