基於分子標記的腸道菌群整體結構變化的檢測方法
2023-06-30 21:08:31
專利名稱：基於分子標記的腸道菌群整體結構變化的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種用於中醫藥技術領域的檢測方法，具體涉及一種基於分子標記的腸道菌群整體結構變化的檢測方法。
背景技術：
動物的腸道不僅是一個重要的生理器官，也是一個包含許多微生物的複雜的生態環境系統。腸道內相對穩定的微生物群落有助於動物增強抵抗外來有害細菌感染的能力，各種慢性與退行性疾病，如腸易激綜合症、腸炎、風溼和類風溼病，以及強直性脊椎症等均與腸道菌群的改變相關。一些藥物，尤其是一些中藥的作用常與腸道菌有密切的關係。目前已經建立了一些研究腸道菌群變化的研究方法。一種常用的方法是用平板培養腸道菌並用生理生化的檢測方法來了解腸道菌群的變化，也是目前臨床上常用的檢測方法。
經對現有技術的文獻檢索發現，一種技術是採用平板培養腸道菌並用生理生化指標的檢測來了解腸道菌的組成及變化，雖然簡單，但平板培養只適合於那些可被培養的微生物，大大少於腸道中實際存在的微生物的種類；而且生理生化反應繁瑣且複雜、耗時長。另一種技術是基於16S rDNA的各種檢測手段的應用。由於16S rDNA包含了相應細菌種類的系統分類地位的信息，因此以16S rDNA為分析對象可以比較微生物群落的結構組成。例如有人用通用引物對糞便腸道菌群總DNA進行了擴增、克隆、測序，得到一系列rDNA序列信息來研究腸道菌的組成。又發現Suau A，Bonnet R，Sutren M，et al.Direct Analysis of GenesEncoding 16S rRNA from Complex Communities Reveals Many Novel MolecularSpecies within the Human Gut.Applied and Environmental Microbiology.1999，65(11)4799-4807(對人體腸道複雜微生物菌群的16S rRNA基因的直接分析發現了許多新的分子生物學種群。應用與環境微生物學。1999年，第65卷11期，4799-4807頁)。這種方法結果準確，但對實驗條件要求較高，而且在一定程度上依賴於已建立的16S rDNA的文庫，對於要反映整個腸道菌群結構變化來說並不是十分方便，不能做到較快地分析比較腸道菌群結構的差異。
發明內容
本發明的目的在於針對現有技術中存在的上述不足和缺陷，提供一種基於分子標記的腸道菌群整體結構變化的檢測方法。使其可以不依靠平板培養以及16SrDNA的方法，快速、準確地直接檢測腸道菌群整體結構的變化，用腸桿菌基因間重複序列的聚合酶鏈式反應(ERIC-PCR)技術，通過比較健康實驗動物、模型動物和給藥治療後各階段的腸道菌群結構的變化，即比較腸道菌群總基因組的ERIC-PCR圖譜，通過PCR產物電泳圖譜中條帶的變化來反映腸道菌群的變化，提供對藥物進行評價。
本發明是通過以下技術方案實現的，本發明的具體方法如下(1)建立與腸道菌群有關疾病的動物脾虛證模型；(2)收集造模前後以及用藥治療後的實驗動物的糞便，並用DNA提取方法提取其中微生物的總基因組DNA；(3)用腸道菌基因間重複序列的聚合酶鏈式反應ERIC-PCR檢測；(4)對得到的造模前後、用藥治療後的ERIC指紋圖譜進行比較，提供對藥物的篩選評價指標。
以下對本發明的進一步限定塑造與腸道菌群有關疾病的實驗動物(小鼠、大鼠或其他)模型，收集新鮮的糞便樣品，用適合提取動物糞便的總DNA提取方法提取DNA。
所述的提取DNA方法如下①將0.3～0.5g新鮮糞便樣品置於10ml離心管中，加入20倍體積(w/v)PBS液，充分均質化後40g離心5min，取上清，沉澱中再加入等體積PBS液，40g離心5min，取上清，合併兩次上清以1000g離心5min，去上清。沉澱用5mlPBS洗滌，重懸後轉移入2ml離心管。
②將轉入上述2ml離心管的沉澱1400g離心8～10min，去上清，加入裂解液I(150mM NaCl；100mM EDTA·Na2；pH8.0)300～500μl及溶菌酶100μl，冰浴30min後加入300～500μl裂解液II(100mM NaCl；500mM Tris-HCl；pH8.0)及100μl SDS，冰浴5min後再加等體積飽和酚，10000g離心8min，取上清，在上清中加入1/2體積飽和酚和1/2體積氯仿∶異戊醇(24∶1)，10000g離心8min。
③取上清再加入1/10體積3M醋酸鈉及兩倍體積無水乙醇，沉澱2h以上，10000g離心15min，乾燥沉澱。沉澱用100μl去離子無菌水溶解，加入4～5μl10％RNase，消化30min，再加入500μl去離子無菌水後重複氯仿∶異戊醇抽提步驟一次。加入1/10體積3M醋酸鈉及兩倍體積乙醇沉澱2h以上，離心並乾燥沉澱，加100μl去離子無菌水溶解。
所述的步驟(3)是指選用報導的ERIC序列引物，即ERIC 15′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′和ERIC 25′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′，並確定ERIC-PCR反應的循環程序，ERIC-PCR的反應體系為25μl，其中含DNA模板50～100ng、10mMdNTP 0.5μl、引物各25pmol，25mMMg2+2μl，10×Buffer 2.5μl和Taq酶1～2單位；循環程序為94℃5min預變性後進行94℃50s、48℃1min、72℃4min的35個循環，72℃保持8min，完成後，用1.7％瓊脂糖凝膠進行電泳，經溴化乙錠染色，紫外燈下照相，獲得DNA指紋圖譜。
所述的步驟(4)是指比較實驗動物各狀態下圖譜中DNA條帶的變化，即腸道菌群結構的變化，選出與疾病相關的條帶作為標準，作為篩選評價待試藥物的依據。
本發明將ERIC-PCR技術應用到藥物、尤其是中藥的藥效篩選與評價方面，建立與腸道菌群有關的疾病的動物模型，不經培養直接提取健康、模型等各階段小鼠糞便樣品總DNA，其中DNA分子的種類及相對比例反映了糞便樣品中腸道菌群種類數量及種群之間的相對比例，獲得的是腸道菌群的總體信息。不同狀態下糞便樣品DNA分子組成及相對數量不同，ERIC序列在不同基因組DNA分布及拷貝均不相同，這種差異可以反映在ERIC-PCR獲得的指紋圖譜中。經擴增後得到的ERIC圖譜中的每一種條帶可以是來自若干不同微生物的基因組DNA片段組成，條帶的數目反映微生物類群的多少，每一條帶的亮度反映該類群微生物種群數量的多少，由此可以得到糞便中腸道菌的結構信息。分析各種狀態下樣品的ERIC指紋圖譜可以知道疾病以及治療藥物對實驗動物腸道菌的影響。
本發明的突出特點是快速且能比較全面地反映腸道菌的變化從糞便中直接提取腸道菌的總DNA並用ERIC-PCR直接進行擴增，較大程度地檢測藥物對腸道菌群的影響。所涉及的ERIC-PCR應用到藥物篩選，尤其是篩選與腸道菌有關疾病的中藥中具有簡便、快速、有效、靈敏的特點，可以同時分析多個樣品並對各個階段的腸道菌動態變化，得到各個個體的脾虛信息，在對腸道菌DNA指紋圖譜的變化進行分析後，找到與疾病有關的DNA條帶來作為篩選評價的依據。為篩選與腸道菌有關疾病的中藥提供了新的方法。
圖1健康小鼠腸道菌總DNA的ERIC-PCR擴增結果其中，1--12不同組別健康小鼠糞便腸道菌總DNA擴增結果；M100bpmarker；NC陰性對照。
圖2利血平造模後小鼠糞便細菌總DNA的ERIC-PCR擴增結果其中，1--12不同組別利血平造模後小鼠糞便腸道菌總DNA擴增結果；M100bp marker；NC陰性對照。
圖3利血平造脾虛模型組小鼠治療愈後糞便腸道菌總DNA的ERIC-PCR擴增結果M100bp marker；NC陰性對照組；1，2四君子低劑量組3，4四君子中劑量組；5，6四君子高劑量組；7，8理中湯低劑量組；9，10理中湯中劑量組；11，12理中湯高劑量組。
具體實施例方式
結合發明內容和附圖提供實施例目前已證實脾虛證涉及現代醫學包括消化、內分泌、免疫、植物神經等系統功能的紊亂和失調。對脾虛證研究的相關檢測指標目前約有70餘種，其中包括淋巴細胞內蛋白酪激酶(PTK)活力變化，胃黏膜環磷酸醯苷(cAMP)，G細胞(分泌胃泌素)，D細胞(分泌生長抑素)胃黏膜的鋅、銅、線粒體Zn、Cu含量等。總體可以分為脾主運化、脾主肌肉、脾虛與血液流變學改變、脾虛與神經、內分泌、微量元素的改變等五方面，其中與消化系統疾病發生的關係最為密切，即脾虛往往伴隨著胃腸功能的紊亂，患者往往有慢性腹瀉的症狀，同時導致腸道正常菌群平衡受到破壞。
對於脾虛證的治療，中醫已有了很長時間的探索，對各種類型的脾虛證有很多有效的治療方法，其中四君子湯和理中湯是應用範圍最廣、效果最好的兩種複方中藥。四君子合劑處方源於宋代《太平惠民和劑局方》之四君子湯，由人參、白朮、茯苓、甘草(炙)等藥物組成，為中醫臨床治療「氣虛證」的代表方。理中湯來源於《傷寒論》，能溫中祛寒，健脾補氣，由黨參、乾薑、甘草(炙)、白朮等藥物組成。可以治脾胃消運無力、腹滿痞悶或腹痛瀉稀便、苔白膩溼潤、脈沉無力等症。
本實施例利用利血平塑造昆明種小鼠的脾虛證動物模型，並用傳統的脾虛證治療藥物四君子湯及理中湯分為高中低三個劑量組對脾虛模型小鼠進行治療，收集各階段的小鼠新鮮糞便，利用前面所述的方法提取糞便中腸道菌群的總DNA，用ERIC-PCR的方法進行擴增，得到在不同狀態下的DNA指紋圖譜，比較分析圖譜上的DNA條帶的變化。具體步驟如下1.建立脾虛證小鼠模型。利用利血平塑造昆明種小鼠脾虛模型每日利血平0.3mg/kg腹腔注射，對照組每日腹腔注射等量生理鹽水，連續11天；治療利用傳統的治療脾虛藥物四君子湯及理中湯分為高中低三個劑量組分別對脾虛小鼠進行治療。
2.收集造模前後及用藥治療前後小鼠的新鮮糞便，提取其中的微生物總DNA。
具體方法如下①將0.3新鮮糞便樣品置於10ml離心管中，加入6mlPBS液，充分均質化後40g離心5min，取上清，沉澱中再加入等體積PBS液，40g離心5min，取上清，合併兩次上清以1000g離心5min，去上清，沉澱用5mlPBS洗滌，重懸後轉移入2ml離心管；②將轉入上述2ml離心管的沉澱1400g離心8～10min，去上清，加入裂解液I 300μl及溶菌酶100μl，冰浴30min後加入300μl裂解液II及100μl SDS，冰浴5min後再加等體積飽和酚，10000g離心8min，取上清，在上清中加入1/2體積飽和酚和1/2體積氯仿∶異戊醇為24∶1，10000g離心8min；③取上清再加入50ml 3M醋酸鈉及兩倍體積無水乙醇，沉澱2h，10000g離心15min，乾燥沉澱。沉澱用100μl去離子無菌水溶解，加入4μl 10％RNase，消化30min，再加入500μl去離子無菌水後重複氯仿∶異戊醇抽提步驟一次，加入50ml3M醋酸鈉及兩倍體積乙醇沉澱2h，離心並乾燥沉澱，加100μl去離子無菌水溶解。
3.用ERIC-PCR對微生物基因組總DNA進行擴增。反應體系及反應程序如下ERIC-PCR的反應體系為25μl，其中含DNA模板50～100ng、10mM dNTP0.5μl、引物各25pmol，25mMMg2+ 2μl，10×Buffer 2.5μl和Taq酶1～2單位；循環程序為94℃5min預變性後進行94℃ 50s、48℃ 1min、72℃ 4min的35個循環，72℃保持8min4.對得到的造模前後、用藥治療後的ERIC指紋圖譜進行比較，提供對藥物的篩選評價指標。
5.結果用所述方法對不同的健康小鼠個體糞便總DNA進行擴增結果(圖1)，2800bp、1500bp、900bp、600bp以及300bp的五條條帶分別存在於不同的健康實驗動物個體中，表明這五個條帶可能來源於某些與健康相關的常態菌；對利血平造模後的脾虛小鼠不同個體糞便總DNA進行擴增結果(圖2)顯示，上述的五條條帶中，2800bp和600bp的條帶發生了消失，說明某些菌群已經發生了變化。在用治療藥物對利血平組的脾虛小鼠進行治療後發現，消失的2800bp與600bp條帶基本恢復。以上說明兩種治療藥物對利血平造脾虛模型小鼠有明顯的治療作用，並且四君子湯治療組中劑量組的治療效果較好，而理中湯高劑量組的效果較好。
上面的實驗結果充分說明了運用本文所述的方法可以較好地對於與腸道菌群有關的藥物，尤其是脾虛治療中藥進行篩選。
權利要求
1.一種基於分子標記的腸道菌群整體結構變化的檢測方法，其特徵在於，具體如下(1)建立與腸道菌群有關疾病的動物脾虛證模型；(2)收集造模前後以及用藥治療後的實驗動物的糞便，並用DNA提取方法提取其中微生物的總基因組DNA；(3)用腸道菌基因間重複序列的聚合酶鏈式反應ERIC-PCR檢測；(4)對得到的造模前後、用藥治療後的ERIC指紋圖譜進行比較，提供對藥物的篩選評價指標。
2.根據權利要求1所述的基於分子標記的腸道菌群整體結構變化的檢測方法，其特徵是，所述的DNA提取方法，具體如下①將0.3～0.5g新鮮糞便樣品置於10ml離心管中，加入20倍體積(w/v)PBS液，充分均質化後40g離心5min，取上清，沉澱中再加入等體積PBS液，40g離心5min，取上清，合併兩次上清以1000g離心5min，去上清，沉澱用5mlPBS洗滌，重懸後轉移入2ml離心管；②將轉入上述2ml離心管的沉澱1400g離心8～10min，去上清，加入裂解液I 300～500μl及溶菌酶100μl，冰浴30min後加入300～500μl裂解液II及100μlSDS，冰浴5min後再加等體積飽和酚，10000g離心8min，取上清，在上清中加入1/2體積飽和酚和1/2體積氯仿∶異戊醇為24∶1，10000g離心8min；③取上清再加入1/10體積3M醋酸鈉及兩倍體積無水乙醇，沉澱2h以上，10000g離心15min，乾燥沉澱。沉澱用100μl去離子無菌水溶解，加入4～5μl10％RNase，消化30min，再加入500μl去離子無菌水後重複氯仿異戊醇抽提步驟一次，加入1/10體積3M醋酸鈉及兩倍體積乙醇沉澱2h以上，離心並乾燥沉澱，加100μl去離子無菌水溶解。
3.根據權利要求2所述的基於分子標記的腸道菌群整體結構變化的檢測方法，其特徵是，所述的裂解液I，是指150mM NaCl；100mM EDTA·Na2；pH8.0。
4.根據權利要求2所述的基於分子標記的腸道菌群整體結構變化的檢測方法，其特徵是，所述的裂解液II，是指100mM NaCl；500mM Tris-HCl；pH8.0。
5.根據權利要求1所述的基於分子標記的腸道菌群整體結構變化的檢測方法，其特徵是，所述的步驟(3)是指選用報導的ERIC序列引物，即ERIC15′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′和ERIC25′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′，並確定ERIC-PCR反應的循環程序，ERIC-PCR的反應體系為25μl，其中含DNA模板50～100ng、10mM dNTP 0.5μl、引物各25pmol，25mMMg2+2μl，10×Buffer 2.5μl和Taq酶1～2單位；循環程序為94℃5min預變性後進行94℃ 50s、48℃ 1min、72℃4min的35個循環，72℃保持8min，完成後，用1.7％瓊脂糖凝膠進行電泳，經溴化乙錠染色，紫外燈下照相，獲得DNA指紋圖譜。
6.根據權利要求1所述的基於分子標記的腸道菌群整體結構變化的檢測方法，其特徵是，所述的步驟(4)是指比較實驗動物各狀態下圖譜中DNA條帶的變化，即腸道菌群結構的變化，選出與疾病相關的條帶作為標準，作為篩選評價待試藥物的依據。
全文摘要
一種基於分子標記的腸道菌群整體結構變化的檢測方法，具體如下建立與腸道菌群相關疾病的動物脾虛證模型；收集造模前後以及用藥治療後的實驗動物的糞便，並用DNA提取方法提取其中微生物的總基因組DNA；用腸桿菌基因間重複序列的聚合酶鏈式反應(ERIC－PCR)檢測；對得到的造模前後、用藥治療後的ERIC指紋圖譜進行比較，提供對藥物的篩選評價指標。本發明的突出特點是快速且能比較全面地反映腸道菌的變化，本發明具有簡便、快速、有效、靈敏的特點，可以同時分析多個樣品並對各個階段的腸道菌動態變化，在對腸道菌群總DNA指紋圖譜的變化進行分析後，找到與疾病有關的DNA條帶來作為篩選評價的依據。為篩選與腸道菌有關疾病的藥物，尤其是脾虛治療中藥提供了新的方法。
文檔編號G01N21/31GK1603796SQ200410067810
公開日2005年4月6日 申請日期2004年11月4日 優先權日2004年11月4日
發明者李曉波, 孔靜, 吳春福 申請人:上海交通大學