分枝桿菌菌種鑑定基因晶片檢測系統的製作方法

2023-06-30 08:51:41 1

專利名稱：:分枝桿菌菌種鑑定基因晶片檢測系統的製作方法
技術領域：
：本發明涉及含有分枝桿菌的16SrRNA和23SrRNA之間的間隔序列(ITS)探針的基因晶片；本發明還涉及用於樣本中分枝桿菌菌種鑑定的檢測試劑。
背景技術：
：結核病(tuberculosis)俗稱"癆病"，是由結核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis，M.tuberculosis)弓l起的傳染性疾病，是全世界由單一至文病菌引致死亡最多的疾病，也是危害人類健康的主要傳染病之一。目前全世界有結核病人約2000萬，每年新增結核病人800-1000萬，每年死亡人數約300萬。我國的結核病情況相當嚴重，是全球22個結核病高負擔國家之一，結核病人數位居世界第二，僅次於印度。2000年第四次全國結核病流行病學抽樣調查初步結果表明，我國有5.5億人感染了結核病；現有肺結核病人451萬，其中傳染性肺結核病人196萬；每年死亡人數約13萬，結核病死亡在我國各種死亡原因中居第9位，在傳染病中居第一位。分枝桿菌屬(Mycobacterium)是一類細長略帶彎曲的桿菌，有分枝生長的趨勢，因而得名。本菌屬種類頗多，可分為三組結核桿菌、非結核分枝桿菌、麻風桿菌。在中國分離出的分枝桿菌中，結核分枝桿菌佔86.4%，牛分枝桿菌佔2.5%，非結核分枝桿菌佔11.1%，非結核分枝桿菌的比率較前明顯增加。非結核分枝桿菌病人對大多數一線抗結核藥物具有天然抗藥性，採用目前標準的化療方案治療無效。目前，非結核分枝桿菌病通常依據傳統的分枝桿菌菌種鑑定來確診，然而，傳統的分枝桿菌菌種鑑定煩瑣、費時、需1-2月時間，不能滿足臨床開展早期有效化療的需要，使非結核分枝桿菌病人通常被作為結核病按常規治療，病人需要經長期的規範化療而療效不佳，療程延長，成為難治、復治病人，細菌在局部播散。因此，分枝桿菌菌種的快速鑑定對結核病和非結核分枝桿菌病的早期診斷、鑑別診斷、有效化療和控制傳播都有極其重要的意義。公開號為CN1353753A的專利申請，公開了數種非結核分枝桿菌菌種檢測和鑑定的寡聚核苷酸，但是對某些菌種不具有特異性，如不能區分鑑定出鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌。公開號為CN16535158A的專利申請，公開了分枝桿菌分子菌種鑑定試劑盒的製備方法和應用，也在對某些菌種的鑑定上也不能鑑定到種，如不能區分鑑定出堪薩斯、瘰癧、胃、猿分枝桿菌。
發明內容本發明的目的在於提供一種用於鑑定分枝桿菌到種的水平的基因晶片；本發明的另一目的在於提供一種可快速地鑑定樣本中分枝桿菌到種的水平的檢測試劑。根據本發明的一方面，本發明的基因晶片包括基底和固定於該基底上的探針，所述基底可以是例如玻片、各種纖維膜、尼龍膜等各種類型，優選為尼龍膜，所述固定於基底上的探針為可與分枝桿菌不同菌種的16SrRNA和23SrRNA之間的插入序列(ITS)基因的核酸雜交的特異型探針。優選的探針序列為針對不同分枝桿菌的16SrRNA和23SrRNA之間的間隔序列(ITS)基因而設計的，可與含有這些間隔序列的不同分枝桿菌核酸雜交。本發明根據不同分枝桿菌的16SrRNA和23SrRNA之間的間隔序列(ITS)基因設計了下面一系列探針GEN5，--CTTGGTGGTGGGGTGTGGACTTT-3'(SEQIDNO1)5，--AAAGTCCACACCCCACCACCAAG-3'(SEQIDNO2)5，--TGGATAGTGGTTGCGAGCATC-3'(SEQIDNO-3)5，--GATGCTCGCAACCACTATCCA-3'(SEQIDNO.4)MTC5，--CGGGTGCATGACAACAAAGTTG-3'(SEQIDNO-5)5，--CAACTTTGTTGTCATGCACCCG-3'(SEQIDNO.6)5，--CCCCAACTGGTGGGGCGTAGG-3'(SEQIDNO-7)5，--CCTACGCCCCACCAGTTGGGG-3'(SEQIDNO.8)MIN5，--ACGAAAAGCACTCCAATTGGTG-3'(SEQIDNO-9)5，--CACCAATTGGAGTGCTTTTCGT-3'(SEQIDNO.10)5，--TTCCCGTCTGTAGTGGACGGG-3'(SEQIDNO-11)5，--CCCGTCCACTACAGACGGGAA-3'(SEQIDNO.12)5，--CTCGGTCGATCCGTGTGGAGT-3'(SEQIDNO-13)5，--ACTCCACACGGATCGACCGAG-3'(SEQIDNO.14)麗5，--ACGAAAAGCACTCCAATTGGT-3'(SEQIDNO-15)5，--ACCAATTGGAGTGCTTTTCGT-3'(SEQIDNO.16)5，--TTCTCGTCTGTAGTGGACGAAA-3'(SEQIDNO-17)5，--TTTCGTCCACTACAGACGAGAA-3'(SEQIDNO.18)MSC5，--ACGAAAAGCACCCCAACTGGT-3'(SEQIDNO-19)5，--ACCAGTTGGGGTGCTTTTCGT-3'(SEQIDNO.20)5，--TTCTCGCCTGTAGTGGGCGGGAG-3'(SEQIDNO21)5，--CTCCCGCCCACTACAGGCGAGAA-3'(SEQIDNO22)5，--TCGGCTCGTTCTGAGTGGTGT-3'(SEQIDNO-23)5，--ACACCACTCAGAACGAGCCGA-3'(SEQIDNO.24)MKA5，--AAGCATCCCAACAAGTGGGGT-3'(SEQIDNO-25)5，--ACCCCACTTGTTGGGATGCTT-3'(SEQIDNO.26)5，--CACGACAACAAGCAAAGCCA-3'(SEQIDNO.27)4[0044]5，_-TGGCTTTGCTTGTTGTCGTG-3，(SEQIDNO.28)[0045]廳5，--AGTAGGTATCTGTAGTGGATATC-3'(SEQIDNO.29)[0047]5，--GATATCCACTACAGATACCTACT-3'(SEQIDNO.30)[0048]5，--TCGGACTGTCATAAGAATTGAA-3'(SEQIDNO-31)5，--TTCAATTCTTATGACAGTCCGA-3'(SEQIDNO.32)MCH5，--AGCCGAATGAGCTTGGGAACA-3'(SEQIDNO-33)5，--TGTTCCCAAGCTCATTCGGCT-3'(SEQIDNO.34)5，--AGTTTCTGTAGTGGTTACTCGC-3'(SEQIDNO-35)5，--GCGAGTAACCACTACAGAAACT-3'(SEQIDNO.36)薩5，--CCGGGTGCACAACAACAAGC-3'(SEQIDNO-37)5，--GCTTGTTGTTGTGCACCCGG-3'(SEQIDNO.38)5，--TTGGATGCGCTGCCTTTTGGT-3'(SEQIDNO-39)5，--ACCAAAAGGCAGCGCATCCAA-3'(SEQIDNO.40)MXE5，--GTGGGTTCGGCGTGTTGTGGC-3'(SEQIDNO-41)5，--GCCACAACACGCCGAACCCAC-3'(SEQIDNO.42)5，--GGTGTTGGGCAGCAGGCAGTAA-3'(SEQIDNO-43)5，--TTACTGCCTGCTGCCCAACACC-3'(SEQIDNO.44)5，--CCCGTGGTGGTGTTGTGCTCCG-3'(SEQIDNO-45)5，--CGGAGCACAACACCACCACGGG-3'(SEQIDNO.46)MF05，--TGGCATCCGGTTGCGGGTGTC-3'(SEQIDNO-47)5，--GACACCCGCAACCGGATGCCA-3'(SEQIDNO.48)5，--CTTTTGGGGGGTGGCATCC-3'(SEQIDNO-49)5，--GGATGCCACCCCCCAAAAG-3'(SEQIDNO.50)在上述序列中，針對每一種分枝桿菌設計了正、反兩條序列，在使用時可選擇任個(正或反)序列作為檢測探針固定於尼龍膜上。在上述設計的各種分枝桿菌序列的基礎上，本領域技術人員可以通過本領域熟知的方法進行探針合成，並對其5'端或3'端進行氨基標記。優選對探針進行3'端氨基標記，其相較5'端氨基標記的探針，具有更好的雜交效果。在本發明的一個實施方案中，製備晶片的方法為將尼龍膜經EDAC(N-乙基-N'_(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)預處理30分鐘後，激活表面負電荷基團；同時，將在3'端帶有氨基標記的探針用緩衝液稀釋到適當的濃度後，按陣列順序點加於尼龍膜相應位置上，此時，氨基與活化的負電荷基團發生反應生成穩定的共價鍵，從而將探針固定在尼龍膜表面，最後，用0.10.5mol/L的NaOH處理尼龍膜，封閉未結合探針的表面負電荷基團，膜晶片製作完成。5[0075]根據本發明的另一方面，用於樣本中分枝桿菌菌種鑑定的檢測試劑至少包括用於擴增樣本中分枝桿菌的16SrRNA和23SrRNA之間的間隔序列(ITS)的PCR引物以及上述本發明的基因晶片。本發明的PCR引物根據分枝桿菌基因組的特點設計，通過PCR反應可擴增一種或幾種突變基因。在本發明中，設計了如下引物序列Ml-F:5'-GGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGAT-3'(SEQIDNO.51)Ml-R:5'-GGCATCCACCATGCGCCCTTAGA-3'(SEQIDNO.52)M2-F:5'-CGATCCCACCTTCGACAGCTCC—3'(SEQIDNO.53)M2-R:5'-TGTCTAAGGGCGCATGGTGGA-3'(SEQIDNO.54)在使用時，可以選擇上述給出序列作為合成的引物序列。上述本發明的引物可以通過本領域技術人員熟知的方法進行合成，可以使用混合引物。同時為便於結果檢測，可以在上述引物合成時進行適當的標記，在本發明的一個實施方案中，對引物進行生物素標記，使得合成的PCR產物的5'端帶有生物素標記，以在後續的顯色反應方便讀取結果。本發明的探針和引物可以針對一種分枝桿菌進行檢測，也可以組合使用鑑定多種分枝桿菌。例如，以SEQIDNO.14所示的序列作為探針序列製備基因晶片，以SEQIDNO.5154所示的序列作為擴增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用於針對分枝桿菌屬診斷試劑；以SEQIDN0.58所示的序列作為探針序列製備基因晶片，以SEQIDN0.5154所示的序列作為擴增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用於針對結核分枝桿菌的診斷試劑；以SEQIDN0.914所示的序列作為探針序列製備基因晶片，以SEQIDNO.5154所示的序列作為擴增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用於針對胞內分枝桿菌的診斷試劑；以SEQIDNO.1518所示的序列作為探針序列製備基因晶片，以SEQIDN0.5154所示的序列作為擴增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用於針對鳥分枝桿菌的診斷試劑；以SEQIDNO.1924所示的序列作為探針序列製備基因晶片，以SEQIDN0.5154所示的序列作為擴增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用於針對瘰癧分枝桿菌的診斷試劑；以SEQIDN0.2528所示的序列作為探針序列製備基因晶片，以SEQIDNO.5154所示的序列作為擴增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用於針對堪薩斯分枝桿菌的診斷試劑；以SEQIDN0.2932所示的序列作為探針序列製備基因晶片，以SEQIDN0.5154所示的序列作為擴增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用於針對膿腫分枝桿菌的診斷試劑；以SEQIDN0.3336所示的序列作為探針序列製備基因晶片，以SEQIDN0.5154所示的序列作為擴增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用於針對龜分枝桿菌的診斷試劑；以SEQIDN0.3740所示的序列作為探針序列製備基因晶片，以SEQIDN0.5154所示的序列作為擴增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用於針對海分枝桿菌的診斷試劑；以SEQIDN0.4146所示的序列作為探針序列製備基因晶片，以SEQIDN0.5154所示的序列作為擴增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用於針對蟾蜍分枝桿菌的診斷試劑；以SEQIDNO.4750所示的序列作為探針序列製備基因晶片，以SEQIDNO.5154所示的序列作為擴增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用於針對偶發分枝桿菌的診斷試劑；較為優選的實施方案為，以GEN、MTC、MIN、MAV、MSC、MKA、MAB、MCH、MMA、MXE、MFO所示的序列中各任選一條作為探針序列製備基因晶片，以SEQIDNO.5154所示的序列作為擴增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用於鑑定十種分枝桿菌。[0082]根據本發明的另一方面，提供一種用於樣本中分枝桿菌菌種鑑定的試劑盒，其至少包括本發明的上述檢測試劑，本發明的試劑盒還可以進一步包含下述試劑中的一種或幾種樣本處理試劑、PCR擴增試劑、雜交試劑和顯色試劑。上述樣本處理試劑、PCR擴增試劑、雜交試劑以及顯色試劑均可以使用本領域技術人員所熟知的在這些操作過程中需使用的各種試劑，這些試劑必要時可以包括在試劑盒中，也可以將其配方列明在試劑盒的說明書中由使用者按照說明書中的指示自行配製。本發明的試劑盒中還可以包括相應的陰性對照和/或陽性對照樣本。在本發明試劑盒的操作方法中，將標記後的待測產物與固定在晶片上的探針進行雜交，其雜交原理與普通核酸雜交相同。雜交溫度與探針和標記後的待測樣品的長度、GC含量、鹽濃度、甲醯胺等有關。優選的是在本發明的試劑盒體系中57t:孵育2-4小時後可獲得滿意的雜交結果。在本發明試劑盒的操作中，利用不同的洗脫條件，如溫度、鹽濃度等最大限度的去除非特異性雜交。標記有過氧化物酶(P0D)的鏈黴親和素(鏈黴抗生物素蛋白)與PCR產物5'端帶有的生物素特異結合，並與過氧化氫和棕色底物TMB(四甲基聯苯胺)的存在下發生化學顯色反應，膜條相應探針位置顯現藍色斑點。經閱讀儀閱讀後對信號與背景進行計算機分析，有相應的軟體系統分析獲得最終的雜交結果。根據本發明的再一方面，提供一種鑑定分枝桿菌菌種的方法。將來自待檢測個體的樣本使用本發明的檢測試劑檢測，通過樣本中分枝桿菌各相關基因的表達情況評估該樣本中是否含有該分枝桿菌。本發明構建了針對分枝桿菌菌種鑑定的基因晶片檢測系統，可快速、準確檢測臨床樣本中的分枝桿菌的菌種類型，具有檢測周期短(整個過程只需1天)、靈敏度高、特異性強的優點，對於指導臨床用藥和治療有重要的意義，可廣泛用於臨床分枝桿菌菌種鑑定試驗。圖1為本發明的分枝桿菌菌種鑑定晶片檢測試劑盒樣本檢測的顯色圖，圖中共有ll張膜條。圖2-圖26為用25種分枝桿菌標準株測試本發明檢測膜條特異性的顯色圖。具體實施方式下面，結合附圖，通過對本發明較佳實施方式的描述，詳細說明但不限制本發明。實施例1分支桿菌菌種檢測晶片的製備1.生產原材料的廠商、規格名稱廠商規格商品名EDACSigma名稱廠商規格商品名尼龍膜PallPoresize:0.45uM30cmX3MBiodyneCMembrane探針序列設計如SEQIDNO.1、SEQIDNO.5、SEQIDNO.9、SEQIDNO.15、SEQIDNO.19、SEQIDNO.25、SEQIDNO.29、SEQIDNO.33、SEQIDNO.37、SEQIDNO.41、SEQIDNO.47所示，按照本領域技術人員熟知的方法由上海博亞生物技術有限公司合成3'端氨基標記探針。:0096]2.生產膜條:0097]按照以下的步驟及原料生產膜條:0098]將膜條按要求裁剪:0099]I:0100]新鮮配製EDAC溶液泡膜30分鐘:0101]i:0102]用蒸餾水洗膜4次，2分鐘/次，濾紙上晾乾，將膜片固定在濾紙上:0103]i:0104]用探針稀釋液將探針母液稀釋:0105]各探針的終濃度為lOiiM:0106]i:0107]按照膜上的格子按順序每格點入lul探針:0108]i:0109]點好的膜室溫放置20分鐘晾乾:o"o]i:0111]用0.lmol/LNaOH浸泡膜條5分鐘:0112]i:0113]棄去NaOH，用蒸餾水洗4次:0114]i:0115]充分晾乾後，裁成條狀，乾燥瓶內保存備用實施例2分枝桿菌菌種鑑定晶片檢測試劑盒樣本檢測2005年7月11月，分別在深圳東湖醫院和廣州胸科醫院進行了臨床驗證，結果證明，本發明的檢測系統通量大、靈敏度高，基因晶片技術的引入使得該方法具有比培養法更高的靈敏度和準確性。具體試劑、檢測方法如下組成成分數量保存條件PC腿x50管(20iiL/管)-20°C10mMTris60ml4°C8tableseeoriginaldocumentpage9本實施例中PCR引物上遊序列為SEQ.ID51，下遊序列為SEQ.ID51,其他儀器及試劑PCR儀、DNA電泳儀、分子雜交箱、搖床、生理鹽水、3%H202配製或市場購買下述溶液tableseeoriginaldocumentpage9參操作步驟1.臨床痰樣的處理方法[0126]1)收集病人痰樣，加入等量的化痰試劑(痰樣化解液+約0.5XNALC，現配當天用)，化痰處理1530分鐘。2)痰樣消化液轉移到1.5mL離心管中，13000轉/分鐘，離心5分鐘。倒淨上清液，再用移液器吸去殘餘在離心管底附近的液體。3)加入lmLPBS，混合懸浮樣品並轉移到1.5mL離心管裡，13000rpm離心5min，棄上清。4)沉澱物加入10mMTris，混合懸浮樣品，13000rpm離心5min，棄上清。5)加入50iiL裂解液，打散沉澱塊，於沸水浴中煮沸10分鐘(注意離心管蓋可能會爆開，小心汙染)。6)短暫離心，上清液即可作為PCR模板。2.PCR擴增每個樣品各取一管20iiL的PCRMix，分別加入5yL樣品上清液作為PCR擴增模板。PCR擴增程序為50°C15分鐘(min)95。C10min95。C45秒(s)58。C45s72。C45s72。C10min3.雜交打開雜交箱，預熱至57°C。取15mL塑料離心管，放入標有樣本編號的膜條(應在膜條的一角用鉛筆標記)，加入A液4-6mL及相應的兩管PCR產物，置於沸水浴中加熱10分鐘(確保雜交液面完全位於水浴液面之下)。擰緊離心管蓋子，放入雜交箱於57t:雜交1.5小時至過夜。同時取50mL塑料管，加入40mLB液於雜交箱或水浴箱中預熱至57°C。4.洗膜取出膜條，移至裝有預熱B液的50mL管中，於56。C輕搖洗滌15分鐘(每管40mL溶液，最多可同時洗滌6張膜)5.顯色用A液配製1:2000的POD溶液(單做兩張膜只需3yLPOD母液，配製成6mL使用液，做四張膜可用5iiLPOD母液，配製成10mL使用液)，室溫輕搖浸泡30分鐘，棄去POD溶液。用A液室溫輕搖洗兩次，每次5分鐘。用C液室溫洗膜l-2分鐘，同時配製顯色液(顯色液需新鮮配製，配法按順序加入以下成份:19mL0.1M檸檬酸鈉;lmLTMB10yL3%H202)。將膜條浸泡於顯色液中避光顯色(每隔5-10分鐘觀察一次，直至肺結核陽性樣品顯現藍色斑點，此過程約需30分鐘至數小時)。6.結果判定[0144]膜條上的探針排列順序tableseeoriginaldocumentpage11[0146]注1.GEN代表分枝桿菌屬特異性探針，其它探針簡稱代表的意義是MTC—結核分枝桿菌複合群、MAV—鳥分枝桿菌、MIN—胞內分枝桿菌、MKA—堪薩斯分枝桿菌、MSC—瘰癘分枝桿菌、MAB—膿腫分枝桿菌、MCH—龜分枝桿菌、MMA—海分枝桿菌、MXE—蟾蜍分枝桿菌、MFO—偶發分枝桿菌；2.PC代表質控對照。參見圖l，為膜條顯色結果示例。編號為1的膜條顯示所測樣品中有結核分枝桿菌；編號為2的膜條顯示所測樣品中有堪薩斯分枝桿菌；編號為3的膜條顯示所測樣品中有胞內分枝桿菌；編號為4的膜條顯示所測樣品中有膿腫分枝桿菌；編號為5的膜條顯示所測樣品中有偶發分枝桿菌；編號為9的膜條顯示所測樣品中有分枝桿菌；編號為18的膜條顯示所測樣品中有鳥分枝桿菌；編號為20的膜條顯示所測樣品中有瘰癘分枝桿菌；編號為23的膜條顯示所測樣品中有蟾蜍分枝桿菌；編號為24的膜條顯示所測樣品中有膿腫分枝桿菌；編號為"空"的膜條檢測的是陰性對照樣品。為判定檢測結果的可靠性，每次檢測務必設置陰性對照。實施例3不同分枝桿菌擴增後雜交效果比較的特異性試驗。在本發明中，對於其它的分枝桿菌的雜交有很好的特異性。以下實驗旨在證明本產品的特異性針對下列不同的分枝桿菌標準株H37Rv(ATCC27294)、堪薩斯分枝桿菌(ATCC12478)、胞內分枝桿菌(ATCC13950)、偶發分枝桿菌(ATCC6481)、戈登分枝桿菌(ATCC14470)、金色分枝桿菌(ATCC23366)、新金色分枝桿菌(ATCC25795)、淺黃分枝桿菌(ATCC43909)、愛知分枝桿菌(ATCC27280)、田鼠分枝桿菌(ATCC19422)、恥垢分枝桿菌(ATCC19420)、副偶發分枝桿菌(ATCC19686)、土分枝桿菌(ATCC19619)、不產色分枝桿菌(ATCC19530)、母牛分枝桿菌(ATCC15483)、鳥分枝桿菌(ATCC25291)、草分枝桿菌(ATCC11758)、瘰癧分枝桿菌(ATCC19981)、胃分枝桿菌(ATCC15754)、次要分枝桿菌(ATCC23292)、蟾蜍分枝桿菌(ATCC19250)、膿腫分枝桿菌(ATCC19977)、非洲分枝桿菌(ATCC25420)、牛分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌(ATCC19423)。按照實施例2的方法以上述25種分枝桿菌標準株為樣本PCR擴增產物分別與膜條雜交，水為陰性對照，結果見圖2-26，圖2-26依次為H37Rv、非洲分枝桿菌、牛分枝桿菌、田鼠分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、胞內分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、偶發分枝桿菌、鳥分枝桿菌、瘰癧分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、金色分枝桿菌、戈登分枝桿菌、新金色分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、愛知分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、副偶發分枝桿菌、土分枝桿菌、不產色分枝桿菌、母牛分枝桿菌、草分枝桿菌、胃分枝桿菌、次要分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌的顯色結果。由圖2-26結果可見，不同分枝桿菌均獲得了很好的雜交結果，並且不存在交叉雜交的情況，因此證明本發明的特異性極高。以上對本發明的描述並不限制本發明，本領域技術人員可以根據本發明作出各種改變和變化，只要不脫離本發明的精神，均應屬於本發明所附權利要求的範圍。[0155]SEQUENCELISTING〈110〉亞能生物技術(深圳)有限公司〈120>分枝桿菌菌種鑑定基因晶片檢測系統〈130〉54〈170〉Patentlnversion3.3〈210>1〈211>23〈212>DNA人工序列〈400〉1cttggtggtggggtgtggacttt23〈210>2〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2aaagtecacaccccaccaccaag23〈210>3〈211>21DNA〈213〉人工序列〈400>3tggatagtggttgcgagcatc21〈210>4〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>4gatgctcgcaaccactatcca21〈210>522〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>5cgggtgcatg3c朋caa3gttg22〈210>6〈211>22〈212>DNA[0194]〈213>人工序列〈400>6caactttgttgtcatgcacceg22〈210〉7〈211>21〈212>DNA人工序列〈400〉7ccccaactggtggggcgtagg21〈210>8〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉8cctacgccccaccagttgggg21〈210>9〈211>22〈212〉DNA〈213〉人工序列9acgaaaagcactccaattggtg22〈210〉10〈211〉22〈212>DNA〈213>人工序列10caccaattggagtgcttttcgt22〈210〉11〈211>21〈212>DNA人工序列〈400〉11ttcccgtctgtagtggacggg21〈210>12〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉12cccgtccactacagacgggaa21[0233]〈210>13〈211>21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉13ctcggtcgatccgtgtggagt14〈211〉21〈212〉DNA人工序列〈400>14actccacacggatcgaccgag〈210〉15〈211〉21DNA〈213〉人工序列〈400>15acg肌肌gcactccaattggt〈210〉16〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉16accaattggagtgcttttcgt〈210>17〈211>22〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>17ttctcgtctgtagtggacga朋18〈211〉22〈212〉DNA人工序列〈400>18tttcgtccactacagacgag朋〈210〉19〈211〉21DNA說明書12/18頁212121212222[0272]〈213〉人工序列〈400〉193cg3aaagcacccc朋ctggt〈210〉20〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉20accagttggggtgcttttcgt21<210〉21〈211〉23〈212〉DNA<213〉人工序列〈400〉21ttctcgcctgtagtgggcgggag23〈210〉22〈211〉23〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉22ctcccgcccactacaggcgagaa23<210〉23〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉23tcggctcgttctgagtggtgt2121〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉24acaccactcagaacgagccga21〈210>25〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>25aagcatcccaacaagtggggt21[0311]〈210>26〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>26accccacttgttgggatgctt〈210>27〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>27cacgac;aacaagc肪3gcc3〈210>28〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>28tggctttgcttgttgtcgtg〈210>29〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>29agtaggtatctgtagtggatatc〈210>30〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>30gatatccactacagatacctact〈210>31〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>31tcggactgtcataagaattg朋〈210>32〈211>22〈212>DNA說明書14/18頁21202023232216[0351]〈400>32ttcaattcttatgacagtcc〈210>3321〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>33agccgaatgagcttgggaac〈210>34〈211〉21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>34tgttcccaagctcattcggct〈210>35〈211>22〈212>DNA〈213>人工序列35agtttctgtagtggttactcgc〈210〉36〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>36gcgagt肪cc3ctec3g朋act〈210>37〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>37CCgggtgC3C朋C33C33gC〈210>38〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉38gcttgttgttgtgcacccggi兌明書15/18頁22212122222020[0389]〈210〉39〈211>21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉39ttggatgcgctgccttttggt〈210>4040acca朋3ggc3gcgc3tcca〈210〉41〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉41gtgggttcggcgtgttgtggc〈210〉42〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉42gccac朋cacgccgaacccac〈210>43〈211〉22〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>43ggtgttgggcagcaggcagt朋<210〉44〈211〉2244ttactgcctgctgcccaacacc〈210〉4522〈212>DNA說明書16/18頁21212121222218[0428]〈213〉人工序列〈400>45cccgtggtggtgttgtgctceg〈210>46〈211〉22〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>46eggagcacaacaccaccacggg22〈210〉47〈211〉21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>47tggcatceggttgcgggtgtc21〈210〉48〈211>21DNA〈213〉人工序列〈400〉48gacacccgcaaccggatgcca21〈210>4919〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉49cttttggggggtggcatcc1950〈211>19〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>50ggatgccaccccccaaaag19〈210>51〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列51ggagggagctgtcgaaggtgggat24[0468]〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>52ggcatccaccatgcgccctt卿〈210>53〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>53cgatcccaccttcgacagctcc〈210>54〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>54tgtcteagggcgcatggtgg3權利要求一種用於樣本中分枝桿菌菌種鑑定的檢測試劑，包括基底及固定於該基底上的探針，所述探針為可分別與分枝桿菌屬、結核分枝桿菌、胞內分枝桿菌、鳥分枝桿菌、瘰癧分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、海分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、偶發分枝桿菌的16SrRNA和23SrRNA之間的間隔序列(ITS)基因雜交的核酸，以及從待測樣本中擴增分枝桿菌不同菌種的16SrRNA和23SrRNA之間的插入序列(ITS)基因的PCR引物，其特徵是所述探針的核苷酸序列為SEQIDNO.1～4、SEQIDNO.5～8、SEQIDNO.9～14、SEQIDNO.15～18、SEQIDNO.19～24、SEQIDNO.25～28、SEQIDNO.29～32、SEQIDNO.33～36、SEQIDNO.37～40、SEQIDNO.41～46和SEQIDNO.47～50序列中各任選一條，所述PCR引物為上遊引物SEQIDNO.51與下遊引物SEQIDNO.52。2.根據權利要求1所述的檢測試劑，其特徵在於所述引物的末端進行生物素標記。3.—種用於樣本中分枝桿菌菌種鑑定的檢測試劑，包括基底及固定於該基底上的探針，所述探針為可分別與分枝桿菌屬、結核分枝桿菌、胞內分枝桿菌、鳥分枝桿菌、瘰癧分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、海分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、偶發分枝桿菌的16SrRNA和23SrRNA之間的間隔序列(ITS)基因雜交的核酸，以及從待測樣本中擴增分枝桿菌不同菌種的16SrRNA和23SrRNA之間的插入序列(ITS)基因的PCR引物，其特徵是所述探針的核苷酸序列為SEQIDNO.14、SEQIDNO.58、SEQIDNO.914、SEQIDNO.1518、SEQIDNO.1924、SEQIDNO.2528、SEQIDNO.2932、SEQIDNO.3336、SEQIDNO.3740、SEQIDNO.4146和SEQIDNO.4750序列中各任選一條，所述PCR引物為上遊引物SEQIDNO.53與下遊引物SEQIDNO.54。4.根據權利要求3所述的檢測試劑，其特徵在於所述引物的末端進行生物素標記。5.—種用於樣本中分枝桿菌菌種鑑定的檢測試劑，包括基底及固定於該基底上的探針，所述探針為可分別與分枝桿菌屬、結核分枝桿菌、胞內分枝桿菌、鳥分枝桿菌、瘰癧分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、海分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、偶發分枝桿菌的16SrRNA和23SrRNA之間的間隔序列(ITS)基因雜交的核酸，以及從待測樣本中擴增分枝桿菌不同菌種的16SrRNA和23SrRNA之間的插入序列(ITS)基因的PCR引物，其特徵是所述探針的核苷酸序列為SEQIDNO.14、SEQIDNO.58、SEQIDNO.914、SEQIDNO.1518、SEQIDNO.1924、SEQIDNO.2528、SEQIDNO.2932、SEQIDNO.3336、SEQIDNO.3740、SEQIDNO.4146和SEQIDNO.4750序列中各任選一條，所述PCR引物為SEQIDNO.51至SEQIDNO.54所示的序列。6.根據權利要求5所述的檢測試劑，其特徵在於所述引物的末端進行生物素標記。專利摘要本發明涉及用於分枝桿菌菌種鑑定的基因晶片檢測系統，包括用於檢測分枝桿菌屬、結核分枝桿菌、胞內分枝桿菌、鳥分枝桿菌、瘰癧分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、海分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌和偶發分枝桿菌的基因晶片和待測樣品中以上菌種的16SrRNA和23SrRNA之間的插入序列(ITS)基因的PCR引物。本發明構建了針對分枝桿菌菌種鑑定的基因晶片檢測系統，可快速、準確檢測臨床樣本中的分枝桿菌的菌種類型，具有檢測周期短(整個過程只需1天)、靈敏度高、特異性強的優點，對於指導臨床用藥和治療有重要的意義，可廣泛用於臨床分枝桿菌菌種鑑定試驗。文檔編號C12Q1/04GKCN1995387B發布類型授權專利申請號CN200610063554公開日2010年6月23日申請日期2006年11月7日發明者任維,向築,廖生贇,田潔,鄒耀東申請人:亞能生物技術(深圳)有限公司導出引文BiBTeX,EndNote,RefMan專利引用(1),