對鱗翅目害蟲高效的蘇雲金芽孢桿菌菌株及其殺蟲基因和應用的製作方法

2023-06-30 10:53:31

專利名稱：對鱗翅目害蟲高效的蘇雲金芽孢桿菌菌株及其殺蟲基因和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物防治技術領域，具體的，本發明涉及一株含有多種cry基因的蘇雲金芽孢桿菌菌株Rpp02，它至少具有cry1Ac、cry1Ab、cry1C以及cryV重要殺蟲基因的優良組合，對農業生產中的一些主要害蟲，特別是蔬菜、棉花、玉米、水稻、以及森林等鱗翅目害蟲具有較高的活性。進一步，本發明涉及對鱗翅目有高毒力的Bt cry1Ac基因的核苷酸序列和其編碼的蛋白質胺基酸序列，涉及在植物中表達的穿梭表達載體pCA-1Ac。
背景技術：
在農業生產過程中，蟲害是造成農業生產損失的一個重要因素，據FAO統計，全世界農業生產每年因蟲害造成的經濟損失高達14％，病害損失達12％，草害損失達11％。損失額高達1260億美元，相當於中國農業總產值的一半，英國的4倍多。為了減少這些損失，普遍採用化學防治手段進行防治，但由於化學農藥的長期、大量使用，造成了對環境的汙染，農副產品中農藥殘留量增加，給人類的生存和健康帶來了危害。此外，化學農藥在殺滅害蟲的同時，也殺傷了天敵及其它有益物，破壞了生態平衡。與化學防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特點。並且避免了化學防治帶來的一系列問題。因此，生物防治技術成了人們研究的熱點。在生物殺蟲劑中，蘇雲金芽孢桿菌是目前世界上用途最廣、產量最大的一類微生物殺蟲劑。
蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種革蘭氏陽性細菌，它的分布極為廣泛，在芽孢形成的同時可形成具有殺蟲活性的由蛋白質組成的伴胞晶體，又名殺蟲晶體蛋白(Insectididal crystal proteins，簡稱ICPs)，ICPs是由cry基因編碼的，對敏感昆蟲有強烈毒性，而對高等動物和人無毒性。近幾十年來，Bt已廣泛應用於控制多種鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等害蟲。此外，Bt還對膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多種害蟲及植物病原線蟲、蟎類、原生動物有控害作用。目前在農田害蟲、森林害蟲及衛生害蟲的防治中Bt已成為化學合成農藥的有力替代品，Bt還是轉基因抗蟲工程植物重要的基因來源。
自1981年Schnepf從菌株HD-1Dipel中克隆了第一個能表達殺蟲活性的基因以來(Adang M.J et al，Characterized full-length and truncated plasmid clones of the crystalprotein of Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki HD-73 and their toxicity to Manduca sexta，Gene，1985，36(3)289～300.)，人們已經分離克隆了300多種編碼殺蟲晶體蛋白的基因，根據編碼的胺基酸序列同源性它們被分別確定為不同的群、亞群、類和亞類(Crickmore N，Zeigler D R，Feitelson J，et al.Revision of the nomenclature for the Bacillusthuringiensis pesticidal crystal proteins.Microbiol Mol Biol Rev，1998，62807-813；http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)。其中cry1類是一群同源性較高的基因，它們編碼的殺蟲晶體蛋白分子量為130-140kD，對鱗翅目害蟲有特異毒性，並且許多基因目前已被廣泛應用於植物的抗蟲基因工程研究中，轉基因植物已獲得較好的抗蟲性(Kozie M G，Beland G L，Bowman C，et al.Field performance of elite transgenic maizeplants expressing an insecticidal protein derived from Bacillus thuringiensis.Bio/Technology，1993，11194-200；Perlak FJ，Deaton R W，Armstrong T A，et al.Insect resistant cotton plants.bio/technology，1990；8939-943；黃其満，毛立群，黃衛紅等，轉人工GFM cry1A基因菸草表現明顯殺蟲活性。植物學報，1998，40228-233)。Cry1Ac基因最初由Adang MJ和Staver MJ等人克隆，他們發現蘇雲金芽孢桿菌菌株HD-73產生的晶體蛋白對鱗翅目幼蟲有極高的毒力，並將編碼此晶體蛋白的基因從75kD的質粒上分離克隆出來。由於cry1Ac基因編碼的晶體蛋白對鱗翅目中的粉紋夜蛾、煙芽夜蛾以及棉鈴蟲的毒力是最高的，所以有不少實驗室都在對其進行研究。孫明、吳嵐等人於1995年從菌株218中克隆了我國第一個cry1Ac基因，被國際命名委員會命名為cry1Ac10(孫明等，蘇雲金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因cry218的克隆和表達，農業生物技術學報，1996)。1996年郭三堆等人將人工合成的調控序列和cry1Ac基因成功地導入多個棉花栽培品種，使我國成為國際上第二個獨立開發成功轉基因抗蟲棉並獲得智慧財產權的國家(崔洪志，郭三堆，中國農業科學，1996，29(1)93)。多年來，有關高毒力和新型殺蟲活性的cry基因的開發和研究一直是國內外對Bt基因研究和利用的熱點。

發明內容
本發明的目的是提供一種對農業生產中的一些主要害蟲，特別是蔬菜、棉花、玉米、水稻、以及森林等鱗翅目害蟲具有較高毒力的蘇雲金芽孢桿菌Rpp02，以及來自於菌株Rpp02中的cry1Ac基因的序列及其編碼的胺基酸序列，並將此序列用於轉化微生物和植物，使之表現出對相關害蟲的毒性。
本發明的目的是通過實施如下的技術方案來實現的
1.含有多種cry基因的蘇雲金芽孢桿菌的篩選與鑑定本發明自行分離了Bt菌株Rpp02，土壤採自四川省成都溫江地區。採用醋酸鈉-抗生素分離法，稱取10g土樣放入裝有50ml醋酸鈉培養基的搖瓶中，分別加入青黴素鈉鹽和硫酸慶大黴素各400μg/ml，搖床培養(200r/min，30℃)4h。培養結束後取土壤懸液10ml，加入無菌的離心管3000r/min離心15min，取上層混濁液2ml於65℃水浴15min，取熱處理後的混濁液0.1ml塗平板，將平板置30℃培養箱中培養。48h後從平板上挑取類似Bt的菌株塗片。發現一株含有菱形晶體形態的Bt菌株。該菌株為芽孢桿菌屬(Bacillus)，蘇雲金芽孢桿菌莫裡遜亞種RPP02，已於2006年9月5日在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NOM 206086。經用光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察，該菌株細胞呈杆狀，兩端鈍圓，菌株大小為0.9-1.1μm×2.7-4.0μm，通常單個、或兩個、或短鏈細胞存在，一個營養細胞為一個孢子囊，每個孢子囊內含有一個芽孢，次端生，另一端有一個伴孢晶體，孢子囊不膨大。革蘭氏染色為陽性(G+)，抗酸染色為陰性。
2.菌株Rpp02中cry基因的鑑定根據cry1類基因保守序列設計幾對特異引物cry1Ab5』-CGCTAACGCAATTTCTTTTGAGTG-3』5』-GAGCCAAGATTAGTAGATTTTGTTAA-3』cry1Ac5』-ATCACTGAGTCGGTTCGCATGTTTGACTTTATC-3』5』-TCACTTCCCATCGACATCTACC-3』cry1C5』-CCACAGTTACACTCTGTAGCTC-3』5』-CACTTAATCCTGTGACGCCT-3』根據cryV類基因設計一對通用引物cryV5』-ATGAAACTAAAGAATCAAGA-3』5』-ACCTGTGCTATACAATTTCA-3』用下列PCR反應體系鑑定10×buffer 2.5ulMgCl2(25mM) 1.5ulTaq酶 0.2uldNTPs(2.5mM)2ul引物2ul
模板5ul最終反應體積25ul熱循環反應94℃預變性5min；94℃變性1min，退火溫度根據引物而定，72℃延伸2min，30個循環；72℃延伸5min；4℃停止反應。擴增反應產物在1％瓊脂糖凝膠上電泳，置凝膠成像系統中觀察PCR擴增結果。
3.菌株Rpp02中cry1Ac基因的克隆採用基因組DNA純化試劑盒(購自賽百盛公司)提取菌株Rpp02的總DNA，根據Genbank中cry1Ac的序列，設計其全長基因引物P1、P2(引物序列如下)，以菌株Rpp02總DNA為模板，擴增cry1Ac全長基因，得到長約4kb的片斷，將純化後的PCR產物與pGEM-T載體連接，轉化，篩選到1個陽性克隆pGF10，經測序，得到序列SEQ ID NO1。
P15』AACCTGAGTTTGCATGAGAC3』P25』ATAATGGGCGAGAAGTAAGT3』4.cry1Ac基因的序列分析序列SEQ ID NO1的全長為3734bp，分析表明，其含有一個較大的開放閱讀框ORF，位置是181-3714，GC含量為39.3％，編碼1177個胺基酸組成的蛋白。經測定，其胺基酸序列如SEQ ID NO2所示。在softberry網站採用bacterial sigma7.0 promoter程序對全序列進行預測表明，在基因編碼區上遊含有RNA聚合酶活化位點的序列。該基因序列與已報導的cry1Ac序列同源性皆高達99％，彼此之間僅存在著少數幾個核苷酸以及編碼胺基酸的差別，被國際Bt殺蟲晶體蛋白基因命名委員會正式命名為cry1Ac20。本發明進一步分析了cry1Ac20蛋白的胺基酸組成(見表1)。
表1 cry1Ac20蛋白的胺基酸組成

5.cry1Ac20基因的表達將重組菌株DHF10在液體LB培養基(含60μg/ml氨苄青黴素)中37℃ 200r/min振蕩培養過夜，收集培養物，離心獲得菌體，加入10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)重懸，超聲波破碎15min，離心收集沉澱，再用1/10體積的Na2CO3(50mmol/L，pH9.5)溶解，按常規SDS-PAGE方法檢測表達產物。
6.cry1Ac20蛋白的活性檢測將重組菌株DHF10在液體LB培養基(含60μg/ml氨苄青黴素)中37℃ 200r/min振蕩培養3d；選老嫩適中的捲心菜葉片洗淨，晾乾；紫外燈下照射15min，剪成2×2cm2大小，分放在菌液中，浸泡5min；取出瀝去多餘的液體，放在消毒的培養皿中晾乾，以LB浸泡葉片作為對照，每個培養皿放4片葉片；選放健康的2-3齡菜青蟲試蟲30頭，重複3次，置室內，於1、2d後調查幼蟲死亡情況，並計算其死亡率及校正死亡率。校正死亡率＝(試驗組死亡率-對照組死亡率)/(100-對照組死亡率)。結果見表2，表明工程菌株對菜青蟲具有極高的毒殺活性。
表2 工程菌DHF10對菜青蟲的室內殺蟲活性(48h)

7.cry1Ac20基因植物表達載體的構建本發明進一步根據克隆的cry1Ac基因全長序列，設計了在真核生物中表達此基因的引物P5和P6(引物序列如下)，引物P5和P6分別引入酶切位點Bgl II和Bst II，以質粒pGEM-F10為模板擴增，得到目的片斷。再以pCAMBIA1301為骨架，用限制性內切酶Bgl II和BstE II雙酶切將載體pCAMBIA1301上的GUS基因切除，再與相同雙酶切後的目的片斷連接，利用pCAMBIA1301上GUS基因的啟動子啟動目的基因的表達，構建了cry1Ac基因的遺傳轉化載體pCA-1Ac。
P55』AGTAGATCT(Bgl II)TTAACACCCTGGGTCA3』P65』GTGGGTAACC(BstE II)TGAGTTTGCATGAGA3』菌種保藏信息菌種名稱芽孢桿菌屬、蘇雲金芽孢桿菌莫裡遜亞種RPP02保藏機構中國典型培養物保藏中心保藏日期2006年9月5日保藏編號CCTCC NOM 20608

圖1為Rpp02菌株的菱形伴孢晶體、芽孢及營養細胞(2500×)；圖2為Rpp02菌株的營養細胞及稀疏的鞭毛(15000×)；圖3為Rpp02菌株中cry基因型的PCR鑑定，其中M為DNA Marker DL2,0001為cry1Ab擴增產物2為cry1C擴增產物3為cryV擴增產物4為cry1Ac擴增產物；圖4為重組質粒pGF10的PCR擴增產物，其中M為DNA分子量標準，1為cry1Ac PCR產物，2為ck；圖5為重組菌株DHF10的SDS-PAGE分析，其中M為Molecular weight marker1為E.coli.DH5α without plasmid2為DHF10 with pGF10；圖6為重組質粒pCA-1Ac的PCR擴增產物和酶切分析，其中M為λ-Hind III DNA Marker1為cry1Ac PCR擴增產物2為pCA-1Ac-Bgl II/BstE II3為pCAMBIA1301-Bgl II/BstE II。
具體實施例方式
實施例1 含有多種cry基因的蘇雲金芽孢桿菌的篩選與鑑定土壤採自四川省成都溫江地區。採用醋酸鈉-抗生素分離法，稱取10g土樣放入裝有50ml醋酸鈉培養基的搖瓶中，分別加入青黴素鈉鹽和硫酸慶大黴素各400μg/ml，搖床培養(200r/min，30℃)4h。培養結束後取土壤懸液10ml，加入無菌的離心管3000r/min離心15min，取上層混濁液2ml於65℃水浴15min，取熱處理後的混濁液0.1ml塗平板，將平板置30℃培養箱中培養。48h後從平板上挑取類似Bt的菌株塗片。發現一株含有菱形晶體形態的Bt菌株(見附圖1)。經用光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察，該菌株細胞呈杆狀，兩端鈍圓，菌株大小為0.9-1.1μm×2.7-4.0μm，通常單個、或兩個、或短鏈細胞存在，一個營養細胞為一個孢子囊，每個孢子囊內含有一個芽孢，次端生，另一端有一個伴孢晶體，孢子囊不膨大。革蘭氏染色為陽性(G+)，抗酸染色為陰性(見附圖2)。
實施例2 菌株Rpp02中cry基因的鑑定根據cry1類基因保守序列設計幾對特異引物cry1Ab5』-CGCTAACGCAATTTCTTTTGAGTG-3』
5』-GAGCCAAGATTAGTAGATTTTGTTAA-3』cry1Ac5』ATCACTGAGTCGGTTCGCATGTTTGACTTTATC-3』5』-TCACTTCCCATCGACATCTACC-3』cry1C5』-CCACAGTTACACTCTGTAGCTC-3』5』-CACTTAATCCTGTGACGCCT-3』根據cryV類基因設計一對通用引物cryV5』-ATGAAACTAAAGAATCAAGA-3』5』-ACCTGTGCTATACAATTTCA-3』用下列PCR反應體系鑑定10×buffer 2.5ulMgCl2(25mM) 1.5ulTaq酶 0.2uldNTPs(2.5mM)2ul引物2ul模板5ul最終反應體積25ul熱循環反應94℃預變性5min；94℃變性1min，退火溫度根據引物而定，72℃延伸2min，30個循環；72℃延伸5min；4℃停止反應。擴增反應產物在1％瓊脂糖凝膠上電泳，置凝膠成像系統中觀察PCR擴增結果(見附圖3)。
實施例3 菌株Rpp02中cry1Ac基因的克隆採用基因組DNA純化試劑盒(購自賽百盛公司)提取菌株Rpp02的總DNA，根據Genbank中cry1Ac的序列，設計其全長基因的引物P1和P2(引物序列如下)，以菌株Rpp02總DNA為模板，擴增cry1Ac全長基因，得到長約4k的片斷，將純化後的PCR產物與pGEM-T載體連接，轉化，篩選到1個陽性克隆pGF10(見附圖4)，經測序，得到SEQ ID NO1，該序列的全長為3734bp，分析表明，含有一個較大的開放閱讀框ORF，其位置是181-3714，GC含量為39.3％，編碼1177個胺基酸組成的蛋白。經測定，其胺基酸序列的組成如SEQ ID NO2所示。在softberry網站採用bacterial sigma7.0 promoter程序對全序列進行預測表明，在基因編碼區上遊含有RNA聚合酶活化位點的序列。該基因序列與已報導的cry1Ac序列同源性皆高達99％，彼此之間僅存在著少數幾個核苷酸以及編碼胺基酸的差別，被國際Bt殺蟲晶體蛋白基因命名委員會正式命名為cry1Ac20。本發明進一步分析了此蛋白的胺基酸組成(見表1)，得知其分子量為133.144kDa，等電點為pH4.952。
P15』AACCTGAGTTTGCATGAGAC3』P25』ATAATGGGCGAGAAGTAAGT3』，實施例4 cry1Ac20基因的表達將重組菌株DHF10在液體LB培養基(含60μg/ml氨苄青黴素)中37℃ 200r/min振蕩培養過夜，收集培養物，離心獲得菌體，加入10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)重懸，超聲波破碎15min，離心收集沉澱，再用1/10體積的Na2CO3(50mmol/L，pH9.5)溶解，按常規SDS-PAGE方法檢測表達產物(見附圖5)。
實施例5 cry1Ac20蛋白的活性檢測將重組菌株DHF10在液體LB培養基(含60μg/ml氨苄青黴素)中37℃ 200r/min振蕩培養3d；選老嫩適中的捲心菜葉片洗淨，晾乾；紫外燈下照射15min，剪成2×2cm2大小，分放在菌液中，浸泡5min；取出瀝去多餘的液體，放在消毒的培養皿中晾乾，以LB浸泡葉片作為對照，每個培養皿放4片葉片；選放健康的2-3齡菜青蟲試蟲30頭，重複3次，置室內，於1、2d後調查幼蟲死亡情況，並計算其死亡率及校正死亡率。校正死亡率＝(試驗組死亡率-對照組死亡率)/(100-對照組死亡率)。結果見表2，表明工程菌株對菜青蟲具有極高的毒殺活性。
實施例6 cry1Ac20基因植物表達載體的構建本發明進一步根據克隆的cry1Ac基因全長序列，設計了在真核生物中表達此基因的引物p3和p4(引物序列如下)，引物p3和p4分別引入酶切位點Bgl II和BstE II，以質粒pGEM-F10為模板擴增，得到目的片斷。再以pCAMBIA1301為骨架，用限制性內切酶Bgl II和BstE II雙酶切將載體pCAMBIA1301上的GUS基因切除，再與相同雙酶切後的目的片斷連接，利用pCAMBIA1301上GUS基因的啟動子啟動目的基因的表達，構建了cry1Ac基因的遺傳轉化載體pCA-1Ac(見附圖6)。
P55』AGTAGATCT(Bgl II)TTAACACCCTGGGTCA3』P65』GTGGGTAACC(BstE II)TGAGTTTGCATGAGA3』
序列表110李平 譚芙蓉 鄭愛萍120對鱗翅目害蟲高效的蘇雲金芽孢桿菌菌株及其殺蟲基因和應用140200610022151.21412006-10-311602170PatentIn 3.121012113734212DNA213蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)220
221CDS222(181)...(3714)4001ataatgggcg agaagtaagt agattgttaa caccctgggt caaaaattga tatttagtaa 60aattagttgc actttgtgca ttttttcataagatgagtca tatgttttaa attgtagtaa120-35box -10boxtgaaaaacag tattatatca taatgaattg gtatcttaat aaaagagatg gaggtaactt 180atggataaca atccgaacac caatgaatgc attccttata attgtttaag taaccctgaa 240ORF →gtagaagtat taggtggaga aagaatagaa actggttaca ccccaatcga tatttccttg 300tcgctaacgc aatttctttt gagtgaattt gttcccggtg ctggatttgt gttaggacta 360gttgatataa tatggggaat ttttggtccc tctcaatggg acgcatttct tgtacaaatt 420gaacagttaa ttaaccaaag aatagaagaa ttcgctagga accaagccat ttctagatta 480gaaggactaa gcaatcttta tcaaatttac gcagaatctt ttagagagtg ggaagcagat 540cctactaatc cagcattaag agaagagatg cgtattcaat tcaatgacat gaacagtgcc 600cttacaaccg ctattcctct tttggcagtt caaaattatc aagttcctct tttatcagta 660tatgttcaag ctgcaaattt acatttatca gttttgagag atgtttcagt gtttggacaa 720
aggtggggat ttgatgccgc gactatcaat agtcgttata atgatttaac taggcttatt 780ggcaactata cagattatgc tgtacgctgg tacaatacgg gattagaacg tgtatgggga 840ccggattcta gagattgggt aaggtataat caatttagaa gagaattaac actaactgta 900ttagatatcg ttgctctgtt cccgaattat gatagtagaa gatatccaat tcgaacagtt 960tcccaattaa caagagaaat ttatacaaac ccagtattag aaaattttga tggtagtttt 1020cgaggctcgg ctcagggcat agaaagaagt attaggagtc cacatttgat ggatatactt 1080aacagtataa ccatctatac ggatgctcat aggggttatt attattggtc agggcatcaa 1140ataatggctt ctcctgtcgg tttttcgggg ccagaattca cgtttccgct atatggaacc 1200atgggaaatg cagctccaca acaacgtatt gttgctcaac taggtcaggg cgtgtataga 1260acattatcct ctacttttta tagaagacct tttaatatag ggataaataa tcaacaacta 1320tctgttcttg acgggacaga atttgcttat ggaacctcct caaatttgcc atccgctgta 1380tacagaaaaa gcggaacggt agattcgctg gacgaaatac caccacagaa taacaacgtg 1440ccacctaggc aaggatttag tcatcgatta agccatgttt caatgtttcg ttcaggctct 1500agtagtagtg taagtataat aagagctcct atgttctctt ggatacatcg tagtgctgaa 1560tttaataata taattgcatc ggatagtatt actcaaatcc ctgcagtgaa gggaaacttt 1620ctttttaatg gttctgtaat ttcaggacca ggatttactg gtggggactt agttagatta 1680aatagtagtg agaataacat tcagaataga gggtatattg aagttccaat tcacttccca 1740tcgacatcta ccagatatcg agttcgtgta cggtatgctt ctgtaacccc gattcacctc 1800aacgttaatt ggggtaattc atccattttt tccaatacag taccagctac agctacgtca 1860ttagataatc tacaatcaag tgattttggt tattttgaaa gtgccaatgc ttttacatct 1920tcattaggta atatagtagg tgttagaaat tttagtggga ctgcaggagt gataatagac 1980agatttgaat ttattccagt tactgcaaca ctcgaggctg aatataatct ggaaagagcg 2040cagaaggcgg tgaatgcgct gtttacgtct acaaaccaac tagggctaaa aacaaatgta 2100acggattatc atattgatca agtgtccaat ttagttacgt atttatcgga tgaattttgt 2160ctggatgaaa agcgagaatt gtccgagaaa gtcaaacatg cgaagcgact cagtgatgaa 2220cgcaatttac tccaagattc aaatttcaaa gacattaata ggcaaccaga acgtgggtgg 2280ggcggaagta cagggattac catccaagga ggggatgacg tatttaaaga aaattacgtc 2340acactatcag gtacctttga tgagtgctat ccaacatatt tgtatcaaaa aatcgatgaa 2400tcaaaattaa aagcctttac ccgttatcaa ttaagagggt atatcgaaga tagtcaagac 2460ttagaaatct atttaatccg ctacaatgca aaacatgaaa cagtaaatgt gccaggtacg 2520ggttccttat ggccgctttc agcccaaagt ccaatcggaa agtgtggaga gccgaatcga 2580tgcgcgccac accttgaatg gaatcctgac ttagattgtt cgtgtaggga tggagaaaag 2640tgtgcccatc attcgcatca tttctcctta gacattgatg taggatgtac agacttaaat 2700gaggacctag gtgtatgggt gatctttaag attaagacgc aagatgggca cgcaagacta 2760gggaatctag agtttctcga agagaaacca ttagtaggag aagcgctagc tcgtgtgaaa 2820agagcggaga aaaaatggag agacaaacgt gaaaaattgg aatgggaaac aaatatcgtt 2880tataaagagg caaaagaatc tgtagatgct ttatttgtaa actctcaata tgatcaatta 2940caagcggata cgaatattgc catgattcat gcggcagata aacgtgttca tagcattcga 3000gaagcttatc tgcctgagct gtctgtgatt ccgggtgtca atgcggctat ttttgaagaa 3060ttagaagggc gtattttcac tgcattctcc ctatatgatg cgagaaatgt cattaaaaat 3120ggtgatttta ataatggctt atcctgctgg aacgtgaaag ggcatgtaga tgtagaagaa 3180caaaacaacc aacgttcggt ccttgttgtt ccggaatggg aagcagaagt gtcacaagaa 3240gttcgtgtct gtccgggtcg tggctatatc cttcgtgtca cagcgtacaa ggagggatat 3300ggagaaggtt gcgtaaccat tcatgagatc gagaacaata cagacgaact gaagtttagc 3360
aactgcgtag aagaggaaat ctatccaaat aacacggtaa cgtgtaatga ttatactgta 3420aatcaagaag aatacggagg tgcgtacact tctcgtaatc gaggatataa cgaagctcct 3480tccgtaccag ctgattatgc gtcagtctat gaagaaaaat cgtatacaga tggacgaaga 3540gagaatcctt gtgaatttaa cagagggtat agggattaca cgccactacc agttggttat 3600gtgacaaaag aattagaata cttcccagaa accgataagg tatggattga gattggagaa 3660acggaaggaa catttatcgt ggacagcgtg gaattactcc ttatggagga atagtctcat 3720End codongcaaactcag gtta373421022111177212PRT213蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)4002Met Asp Asn Asn Pro Asn Thr Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys15 10 15Leu Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu20 25 30Thr Gly Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe35 40 45Leu Leu Ser Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu50 55 60Val Asp Ile Ile Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala65 70 75Phe Leu Val Gln Ile Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu80 85 90Phe Ala Arg Asn Gln Ala Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn95 100 105Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp110 115 120Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn125 130 135Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala Ile Pro Leu Leu Ala Val140 145 150Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr Val Gln Ala Ala155 160 165Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser Val Phe Gly Gln
170 175 180Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg Tyr Asn Asp185 190 195Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp Tyr Ala Val Arg Trp200 205 210Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg Asp215 220 225Trp Val Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val230 235 240Leu Asp Ile Val Ala Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Arg Tyr245 250 255Pro Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn260 265 270Pro Val Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln275 280 285Gly Ile Glu Arg Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu290 295 300Asn Ser Ile Thr Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Tyr Tyr Tyr305 310 315Trp Ser Gly His Gln Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly320 325 330Pro Glu Phe Thr Phe Pro Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala335 340 345Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg350 355 360Thr Leu Ser Ser Thr Phe Tyr Arg Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile365 370 375Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp Gly Thr Glu Phe Ala Tyr380 385 390Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val Tyr Arg Lys Ser Gly395 400 405Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln Asn Asn Asn Val410 415 420Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His Val Ser Met425 430 435Phe Arg Ser Gly Ser Ser Ser Ser Val Ser Ile Ile Arg Ala Pro440 445 450Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn Ile Ile455 460 465Ala Ser Asp Ser Ile Thr Gln Ile Pro Ala Val Lys Gly Asn Phe470 475 480Leu Phe Asn Gly Ser Val Ile Ser Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly485 490 495Asp Leu Val Arg Leu Asn Ser Ser Gly Asn Asn Ile Gln Asn Arg
500 505 510Gly Tyr Ile Glu Val Pro Ile His Phe Pro Ser Thr Ser Thr Arg515 520 525Tyr Arg Val Arg Val Arg Tyr Ala Ser Val Thr Pro Ile His Leu530 535 540Asn Val Asn Trp Gly Asn Ser Ser Ile Phe Ser Asn Thr Val Pro545 550 555Ala Thr Ala Thr Ser Leu Asp Asn Leu Gln Ser Ser Asp Phe Gly560 565 570Tyr Phe Glu Ser Ala Asn Ala Phe Thr Ser Ser Leu Gly Asn Ile575 580 585Val Gly Val Arg Asn Phe Ser Gly Thr Ala Gly Val Ile Ile Asp590 595 600Arg Phe Glu Phe Ile Pro Val Thr Ala Thr Leu Glu Ala Glu Tyr605 610 615Asn Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe Thr Ser620 625 630Thr Asn Gln Leu Gly Leu Lys Thr Asn Val Thr Asp Tyr His Ile635 640 645Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Thr Tyr Leu Ser Asp Glu Phe Cys650 655 660Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys His Ala Lys665 670 675Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Ser Asn Phe Lys680 685 690Asp Ile Asn Arg Gln Pro Glu Arg Gly Trp Gly Gly Ser Thr Gly695 700 705Ile Thr Ile Gln Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val710 715 720Thr Leu Ser Gly Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr725 730 735Gln Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu Lys Ala Phe Thr Arg Tyr Gln740 745 750Leu Arg Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gln Asp Leu Glu Ile Tyr Leu755 760 765Ile Arg Tyr Asn Ala Lys His Glu Thr Val Asn Val Pro Gly Thr770 775 780Gly Ser Leu Trp Pro Leu Ser Ala Gln Ser Pro Ile Gly Lys Cys785 790 795Gly Glu Pro Asn Arg Cys Ala Pro His Leu Glu Trp Asn Pro Asp800 805 810Leu Asp Cys Ser Cys Arg Asp Gly Glu Lys Cys Ala His His Ser815 820 825His His Phe Ser Leu Asp Ile Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu Asn
830 835 840Glu Asp Leu Gly Val Trp Val Ile Phe Lys Ile Lys Thr Gln Asp845 850 855Gly His Ala Arg Leu Gly Asn Leu Glu Phe Leu Glu Glu Lys Pro860 865 870Leu Val Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys Arg Ala Glu Lys Lys875 880 885Trp Arg Asp Lys Arg Glu Lys Leu Glu Trp Glu Thr Asn Ile Val890 895 900Tyr Lys Glu Ala Lys Glu Ser Val Asp Ala Leu Phe Val Asn Ser905 910 915Gln Tyr Asp Gln Leu Gln Ala Asp Thr Asn Ile Ala Met Ile His920 925 930Ala Ala Asp Lys Arg Val His Ser Ile Arg Glu Ala Tyr Leu Pro935 940 945Glu Leu Ser Val Ile Pro Gly Val Asn Ala Ala Ile Phe Glu Glu950 955 960Leu Glu Gly Arg Ile Phe Thr Ala Phe Ser Leu Tyr Asp Ala Arg965 970 975Asn Val Ile Lys Asn Gly Asp Phe Asn Asn Gly Leu Ser Cys Trp980 985 990Asn Val Lys Gly His Val Asp Val Glu Glu Gln Asn Asn Gln Arg995 10001005Ser Val Leu Val Val Pro Glu Trp Glu Ala Glu Val Ser Gln Glu101010151020Val Arg Val Cys Pro Gly Arg Gly Tyr Ile Leu Arg Val Thr Ala102510301035Tyr Lys Glu Gly Tyr Gly Glu Gly Cys Val Thr Ile His Glu Ile104010451050Glu Asn Asn Thr Asp Glu Leu Lys Phe Ser Asn Cys Val Glu Glu105510601065Glu Ile Tyr Pro Asn Asn Thr Val Thr Cys Asn Asp Tyr Thr Val107010751080Asn Gln Glu Glu Tyr Gly Gly Ala Tyr Thr Ser Arg Asn Arg Gly108510901095Tyr Asn Glu Ala Pro Ser Val Pro Ala Asp Tyr Ala Ser Val Tyr110011051110Glu Glu Lys Ser Tyr Thr Asp Gly Arg Arg Glu Asn Pro Cys Glu111511201125Phe Asn Arg Gly Tyr Arg Asp Tyr Thr Pro Leu Pro Val Gly Tyr113011351140Val Thr Lys Glu Leu Glu Tyr Phe Pro Glu Thr Asp Lys Val Trp114511501155Ile Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Ile Val Asp Ser Val
116011651170Glu Leu Leu Leu Met Glu Glu1175 117權利要求
1.一種對鱗翅目害蟲高效的蘇雲金芽孢桿菌菌株Rpp02，其保藏編號為CCTCC NOM 206086。
2.如權利要求1所述的蘇雲金芽孢桿菌菌株Rpp02，其特徵在於該菌株至少具有cry1Ac、cry1Ab、cry1C以及cryV殺蟲基因組合。
3.如權利要求1或2所述的蘇雲金芽孢桿菌菌株Rpp02，其特徵在於從中分離克隆的cry1Ac基因包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
4.如權利要求3所述的蘇雲金芽孢桿菌菌株Rpp02，其特徵在於所述cry1Ac基因編碼的蛋白質具有SEQ ID NO2所示的胺基酸序列。
5.如權利要求3所述的蘇雲金芽孢桿菌菌株Rpp02，其特徵在於構建的用於植物轉基因的穿梭表達載體pCA-1Ac含有所述cry1Ac基因的核苷酸序列。
6.如權利要求1所述的蘇雲金芽孢桿菌菌株Rpp02在防治蔬菜、棉花、玉米、水稻以及森林鱗翅目害蟲中的應用。
全文摘要
本發明披露了對鱗翅目害蟲高效的蘇雲金芽孢桿菌菌株及其殺蟲基因和應用，屬於生物防治技術領域。本發明涉及一株具有多種高效殺蟲基因的蘇雲金芽孢桿菌菌株Rpp02，經PCR檢測表明，它同時含有cry1Ac、cry1Ab、cry1C以及cry1V等多個基因。進一步，本發明涉及對鱗翅目高毒力的cry1Ac基因的核苷酸序列和其編碼的蛋白質的胺基酸序列，同時還涉及包含此基因的穿梭表達載體pCA－1Ac及其構建方法。本發明通過將該序列應用於轉化微生物和植物，從而表現出了對鱗翅目害蟲的高毒性，克服或延遲了對工程菌和轉基因植物抗藥性的產生。
文檔編號A01P7/04GK101074427SQ20061002215
公開日2007年11月21日 申請日期2006年10月31日 優先權日2006年10月31日
發明者李平, 譚芙蓉, 鄭愛萍 申請人:李平, 譚芙蓉, 鄭愛萍