用於膜電位測定的光遺傳學探針的製作方法
2023-06-17 09:09:46
專利名稱：用於膜電位測定的光遺傳學探針的製作方法
技術領域：
本發明的領域是涉及用於光學測定磷脂雙層間電位的方法，構建體和組合物。
背景技術：
附膜的生物結構可承受膜內外電壓差。這種電壓，又被稱為膜電位，具有多種生物功能，包括傳送信息(例如，在神經元中)，在產生ATP中作為媒介物(例如，在細菌和線粒體中)，為鞭毛電機提供動力(例如，在細菌中)和控制營養素、毒素和信號分子的跨膜運輸(在細菌和真核細胞中)。儘管膜電位具有重要的的生物學作用，膜電位的測定還是非常困難的。電生理學是通過在膜兩側放置電極來直接記錄電位差。電生理學實驗設定慢，每次僅能測定一個或少數幾個細胞，不能進入深層組織(例如，體內)，不能作用於微小細胞(例如，細菌)、堅固細胞壁包圍的細胞(例如，酵母)或活動的細胞(例如，精子)，不能應用於長期測定，並且在測定中常會損壞或殺死細胞。因此，需要開發膜電位的新型測定方法。
發明內容
本文描述的方法是使用細菌視紫紅質作為光學傳感器來檢測磷脂層間的電壓。我們已經發現該新系統可以光學測定細胞的膜電位或細胞腔隙的結合膜電位，如細胞內的細胞器、人造細胞或其他類脂膜結合結構。該方法包括在細胞或細胞器上表達細菌視紫紅質，將細胞暴露於光源下和檢測細菌視紫紅質發射出的螢光，其中通過發射的螢光強度反應膜電位。該方法無需使用電極就可以測定膜電位。該方法可進一步監測一個或多個外部刺激引起的細胞膜電位變化。這不僅有利於科研，並且，例如，在篩選影響膜電壓能力的候選試劑中也是很重要的，例如，在藥物篩選中。本發明還提供表達細菌視紫紅質和修飾的細菌視紫紅質的細胞，和編碼修飾的古細菌視紫紅質的核酸構建體，其在真核細胞中測定膜電位及其變化是有用的。在一些具體實施方式
中，在此描述的光學傳感器使其內源性離子泵活性下降，或相比於天然細菌視紫紅質蛋白質，部分或全部活性得以抑制。這樣光學感受器可測定電壓，但通過構建的離子梯度不能參與改變電壓。電壓及其變化的檢測能夠可視化，並且使用光學系統及進行測定。本發明是基於，至少部分上是基於下述發現，該發現是細菌視紫紅質蛋白如古細菌視紫紅質或變形菌視紫紅質以及其修飾的變型，具有降低的離子泵活性(與來自於天然的細菌視紫紅質蛋白相比)，能夠被用作光學傳感器在細胞內檢測跨膜電壓。也就是說，細菌視紫紅質和修飾的細菌視紫紅質蛋白可用於測定細胞的膜電位以及膜電位的變化。該構建體和方法也可用於組織和器官的體內成像，例如在斑馬魚上，由於電極尺寸的限制其不能用於研究。這不僅有利於科研，而且在篩選新型候選試劑在影響細胞的膜電壓能力也是很重要的。我們已經開發了變形菌視紫紅質光學質子傳感器(PROPS)，其主要作用於細菌細胞，以及基於古細菌視紫紅質的螢光電壓指示蛋白(VIPs)家族，其也作用於哺乳動物細胞，包括神經元和人類幹細胞源性的心肌細胞。VIPs是以來自於古細菌視紫紅質3 (Arch)及其同系物的電壓指示器為基礎。這些蛋白以亞毫秒時間解析度和亞微米空間解析度指示電動力學。利用VIPs，我們通過在哺乳動物細胞和組織使用電動力學的光學檢測表明非接觸、高通量和高含量的測定方法。本文描述的光學傳感器不受電極使用的限制，使電生理學研究可以在例如亞細胞區室中(例如，線粒體)或在小細胞中(例如，細菌)中進行。在此描述的光學傳感器可用於藥物篩選中，裝置研究，以及真核和原核細胞電壓變化的體內、體外成像中。我們描述電壓指示器蛋白和表達此蛋白的構建體。該構建體具有任意的細胞型的特異性啟動子，當細胞分化時啟動子開啟，例如，分化為神經元細胞，如神經元，或分化為心肌細胞，例如心肌細胞，浦肯野細胞或竇狀細胞。該構建體可進一步包括靶信號如線粒體靶信號，其針對在所需膜位置的電壓指示器蛋白。我們提供細胞，以及瞬時和穩定表達這些蛋白的細胞系，包括人類幹細胞，如誘導多能細胞(iPSC)或胚胎幹細胞(ESC)，神經祖細胞，神經細胞，心臟祖細胞和心肌細胞。我們還描述了採用描述的電壓指示器蛋白篩選藥物的方法。本發明方法使用的細胞，不管是原核細胞還是真核細胞，都被典型的工程化表達細菌視紫紅質或修飾的細菌視紫紅質，而他們不能天然地表達用於本發明方法的細菌視紫紅質蛋白。因此，在一個具體實施方式
中，發明提供一種測定表達細菌視紫紅質蛋白編碼的核酸細胞膜電位的方法，該方法包括步驟(a)，用至少一個波長的光通過體外、離體或體內激發至少一個包含編碼細菌視紫紅質蛋白的核酸的細胞，和步驟(b)體外、離體或體內檢測來自至少一個細胞的至少一個光學信號，其中和參考相比，由至少一個細胞發射的螢光強度水平指示細胞膜電位。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，細菌視紫紅質蛋白是修飾的細菌視紫紅質蛋白，與來自於天然的細菌視紫紅質蛋白相比，其離子泵活性降低。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，細菌視紫紅質蛋白是變形菌視紫紅質蛋白家族中的成員。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，細菌視紫紅質蛋白是古細菌視紫紅質蛋白家族的成員。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，至少一個波長在λ =594-645之間的波長，波長範圍在λ =630-645nm之間的波長也是可以使用的。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，細胞是原核細胞。原核細胞可以是革蘭陽性或革蘭陰性。原核細胞可以是病原性的或非病原性的。
在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，細胞是真核細胞。 在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，真核細胞是哺乳動物細胞。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，真核細胞是幹細胞、多能細胞或祖細胞。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，真核細胞是誘導多能細胞。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，真核細胞是神經細胞。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，真核細胞是心肌細胞。這些細胞可以體外培養或離體培養，或者可以是器官或組織的部分。典型的細胞包括細菌，酵母，植物細胞，和來自脊椎動物或無脊椎動物的細胞。在一些具體實施方式
中，真核細胞是人類細胞。在一些具體實施方式
中，真核細胞是非人類細胞。在一些具體實施方式
中，細胞不天然地表達方法中使用的細菌視紫紅質蛋白。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，該方法進一步包括將載體體夕卜，離體或體內轉染給至少一個細胞的步驟，所述載體包含編碼細菌視紫紅質蛋白的核酸。這些細胞可以被瞬時轉染或穩定轉染。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，編碼細菌視紫紅質蛋白的核酸與細胞型特異的啟動子可操作地連接。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，編碼細菌視紫紅質蛋白的核酸可操作地連接於膜靶向序列。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，膜靶向序列是質膜靶向性序列。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，膜靶向序列是亞細胞區室靶向序列。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，亞細胞區室是選自於線粒體膜，內質網，肌質網，突觸小泡，內涵體和吞噬小體。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，細菌視紫紅質基因可操作地連接於編碼附加螢光蛋白或生色團的核酸。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，至少一個附加螢光蛋白是能夠指示細胞內離子濃度的蛋白。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，至少一個能夠指示離子濃度的附加螢光蛋白是鈣指示劑。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，能夠指示離子濃度的螢光蛋白是pH指示劑。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，螢光蛋白能夠進行非放射性螢光共振，使能量轉移到細菌視紫紅質，其能量轉移速率取決於膜電位。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，突光蛋白的亮度對膜電位和局部化學環境不敏感，因此，和細菌視紫紅質的螢光相比可作為參考。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，該方法還包括如下步驟:採用至少第一和第二波長的光體外、離體或體內激發至少一個細胞；和體外、離體或體內檢測至少第一和第二光學信號，該信號由至少第一和第二波長的激發引起，其不同於來自至少一個細胞的至少第一波長。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，至少第二波長是在λ =447-594之間的波長。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，該方法還包括如下步驟:計算細菌視紫紅質的螢光發射與附加螢光蛋白的螢光發射的比率，以獲取不依賴於表達水平差異的膜電位測定。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，該方法還包括將至少一個細胞體外，離體或體內暴露於能夠或預期能夠改變膜電位的刺激的步驟。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，刺激是候選試劑。在一些具體實施方式
中，給予至少一個候選試劑。在一些具體實施方式
中，同時或順序給予至少兩個候選試劑的組合。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，刺激是細胞培養基組分的變化。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，刺激是電流。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，該方法還包括在至少第一時間點和至少第二時間點體外，離體或體內測定，至少一個光學信號的步驟。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，至少第一時間點是在將至少一個細胞暴露於刺激之前，至少第二時間點是將至少一個細胞暴露於刺激之後。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，本方法還包括測定來自於暴露在至少第一波長和至少第二波長的光學信號間的螢光比例的步驟。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，該方法包含使用多個細胞。例如在高通量測定模式中。例如，在此具體實施方式
中，表達細菌視紫紅質蛋白的多個細胞可以暴露於多個候選試劑中，例如候選藥物，和篩選候選試劑影響細胞膜電位的能力。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，真核細胞是人類細胞。在一些具體實施方式
中，真核細胞是非人類細胞。在另外的具體實施方式
中，發明提供了分離和純化的核酸，其編碼古細菌視紫紅質蛋白家族的修飾成員，與來自於古細菌視紫紅質蛋白家族的天然成員相比，離子泵活性降低。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，與衍生源古細菌視紫紅質蛋白家族天然成員相比，離子泵活性下降的古細菌視紫紅質蛋白家族的修飾成員包括鄰近希夫喊基的突變的質子受:體。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，分離純化的核酸可操作地連接於編碼膜-靶向序列的核酸。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，膜-靶向序列的核酸是亞細胞膜-靶向序列。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，亞細胞膜是線粒體膜，內質網，肌質網，突觸小泡，內涵體或吞噬小體。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，分離純化的核酸可操作地連接於細胞型特異的啟動子。
在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，分離純化的核酸可操作地連接於編碼附加螢光蛋白或生色團的至少一個核酸。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，附加螢光蛋白是綠色螢光蛋白或其同系物。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，分離純化的核酸可操作地連接於編碼附加螢光蛋白的核酸，該蛋白可經受螢光共振能量轉移成為細菌視紫紅質，其能量轉移速率取決於膜電位。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，分離純化的核酸還包括載體。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，該載體是病毒載體，如慢病毒載體或腺伴隨病毒載體(AAV)。在另一個具體實施方式
中，本發明提供了一種包括上述分離和純化的核酸的試劑盒。核酸可以通過在緩衝液中或以乾燥的形式例如適宜容器中冷凍乾燥形式提供。在一些具體實施方式
中，試劑盒還包括實施本發明中方法或測定的緩衝液和溶液。根據說明書中提供的描述，本領域技術人員可為該試劑盒挑選和選擇合適的試劑。該試劑盒可以包括一個或多個轉染試劑，一個或多個緩衝液，一個或多個細胞培養基，一個或多個容器，例如細胞培養皿或陣列，從而進行本發明中的方法或測定。該試劑盒中也可以包括進行測定操作的說明的說明書。在另一個具體實施方式
中，本發明提供包括編碼細菌視紫紅質蛋白的核酸的分離細胞。該細胞典型地工程化表達細菌視紫紅質蛋白。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，細菌視紫紅質蛋白是修飾細菌視紫紅質蛋白，與來自於天然的細菌視紫紅質蛋白相比，其離子泵活性下降。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，修飾細菌視紫紅質蛋白包括鄰近希夫鹼基的突變的質子受體。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，細菌視紫紅質是變形菌視紫紅質家族的成員。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，細菌視紫紅質是古細菌視紫紅質家族的成員。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，細胞是真核細胞。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，細胞是原核細胞。在一些具體實施方式
中，原核細胞是革蘭陽性細胞。在一些具體實施方式
中，原核細胞是病原性細胞。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，修飾的細菌視紫紅質基因可操作地連接於啟動子。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，啟動子是細胞型特異性啟動子。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，編碼修飾細菌視紫紅質蛋白的核酸可操作地連接於膜靶向核酸。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，編碼修飾細菌視紫紅質蛋白的核酸可操作地連接於編碼至少一個附加螢光蛋白或生色團的核酸。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，至少一個附加螢光蛋白是綠色螢光蛋白或其同系物。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，至少一個附加螢光蛋白是能夠進行螢光共振能量轉移，成為細菌視紫紅質的蛋白，其能量轉移速率取決於膜電位。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，至少一個附加螢光蛋白是亮度對膜電位和局部化學環境不敏感的螢光蛋白。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，細胞還包括編碼能夠指示細胞內離子濃度的螢光蛋白的核酸。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，細胞是幹細胞，多能細胞，或誘導多能細胞，或其分化的或其未分化的子代細胞。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，分化細胞是神經元。在發明的任一具體實施方式
或方面的一些方面中，分化細胞是心肌細胞。在一個具體實施方式
中，本發明提供試劑盒，其包括上述描述的在適宜培養基或容器中的一個或多個細胞。該試劑盒可包括在適宜培養基中的冷凍細胞。該試劑盒包括其他試劑，如一個或多個緩衝液，一個或多個細胞培養基，和一個或多個容器。該試劑盒還可包括在此描述的方法中使用細胞的方法說明書。在另一個具體實施方式
中，本發明提供用於膜電位光學測定的工程細胞的生產方法，包括用編碼細菌視紫紅質蛋白的核酸轉染細胞的步驟。轉染可以是瞬時或穩定轉染。在一些具體實施方式
中，細胞是原核細胞。該原核細胞是革蘭陽性或革蘭陰性。在一些方面中，原核細胞是致病菌。細胞還可以是幹細胞，多能細胞，分化細胞或無限增殖化細胞或細胞株。細胞可以是器官或組織的分離細胞或一部分，如斑馬魚或非人類胚胎或人類胚胎。在此具體實施方式
的一方面，和該具體實施方式
的任一方面中，細菌視紫紅質蛋白是修飾的細菌視紫紅質蛋白。在此具體實施方式
的一方面，和該具體實施方式
的任一方面中，編碼細菌視紫紅質蛋白的核酸可操作地連接於分化的細胞型特異性啟動子。在此具體實施方式
的一方面，和該具體實施方式
的任一方面中，編碼細菌視紫紅質蛋白的核酸可操作地連接於至少一個編碼螢光蛋白或生色團的附加基因。在此具體實施方式
的一方面中，至少一個編碼螢光蛋白的附加基因是綠色螢光蛋白或其同系物。在此具體實施方式
的一方面，和該具體實施方式
的任一方面中，編碼細菌視紫紅質蛋白的核酸可選擇地連接於能夠指示細胞內離子濃度的螢光蛋白。本說明書提供了示例性核酸和核酸構建體，它們的核酸序列在附帶的序列表中提供。具有代表性的是，通過突變該蛋白鄰近希夫鹼基的質子受體進行修飾，使修飾的視紫紅質至少離子泵活性下降。然而，本發明意欲不受這些實施例的限制，因為類似光學測定用於許多現存細菌視紫紅質蛋白是可能。任何該類蛋白可用於本發明的方法，且任何該類蛋白也可以修飾使其離子泵活性下降。
圖1顯示在綠色變形菌視紫紅質的D97N突變體中的電壓靈敏度機理。左側:綠色變形菌視紫紅質(a)跨越磷脂雙層膜(b)。右側:視黃醛(C)的生色團放大圖，其通過希夫鹼基(d)與蛋白骨架共價結合。在野生型結構中的門冬氨酸97被突變為天冬醯胺(e)，進而降低希夫鹼基的pKa，從野生型的>12降低為9.8值，以消除質子泵的光循環。跨膜電壓降的變化改變局部電化學電位從而使質子(f)位於希夫鹼基上，從而改變酸鹼平衡。視黃醛的吸收光譜和螢光取決於希夫鹼基的質子化狀態:質子化形式是有螢光，去質子化形式則沒有螢光的。通過測定螢光確定跨膜電壓。圖2A-2D顯示GPR D97N是跨膜蛋白，其顯示強耐光和環境靈敏的螢光。表達GPR D97N的大腸桿菌細胞在633nm波長下受激發且通過在660 - 760nm之間的GPR D97N發射的滅光成像。蛋白位於細胞外圍的蛋白可以作為跨 旲蛋白。圖2Α顯不ρΗ7和pHlI時GPR D97N在整個大腸桿菌的可見吸收光譜；圖2B顯示pH7和pHll時溶於辛基葡萄糖苷的純化GPR D97N蛋白的螢光發射光譜；圖2C顯示在相同光照條件下GPR D97N和有機染料Alexa647(分子探針)的光漂白作用曲線。圖2D顯示通過可見吸收監測的野生型和GPRD97N突變體中希夫鹼的pH滴定。D97N突變體的pKa是9.8，野生型蛋白的pKa是>12。圖3顯示GPR D97N發揮體內和體外pH功能的螢光強度。在兩種情況下，由於希夫鹼基的去質子化在高PH時螢光減弱。測定大腸桿菌細胞的PKa值，其通過附加羰基氰化物3-氯苯腙(CCCP)使質子可以滲透細胞膜。這樣的處理是有必要的，因為質子從細胞質一側連接於希夫鹼基，·在沒有CCCP時，細胞在細胞外pH浮動的情況下可維持穩定的細胞質pH。由於細胞內的局部環境影響，細胞內和純化蛋白內的pKa不同。圖4A和圖4B顯示在表達GPRD97N的大腸桿菌中的螢光閃爍。圖4A顯示ρΗ7.5時3個大腸桿菌的攝影軟片。每次暴露100ms。單個細胞的亮度隨時間變化。圖4B顯示PH7.5時單個細胞的閃爍圖像。每個痕跡是50秒(s)的記錄強度。實驗開始後的時間在右側顯示。在I小時的實驗中細胞持續閃爍。相同細胞顯示為快速閃爍(O和7分鐘)，緩慢閃爍(28分鐘)和『鈴聲』行為(18分鐘)。圖5顯示含有古細菌視紫紅質3 (Arch3，在一些情況下也稱Ar-3)的制粒的圖，如在合成生物學網站中所描述的(合成神經生物學的網址為org/protocol s/protocoldetail/36/10)(world wide web at synthetic neuro biology.0rg/protocols/protocoldetai1/36/10)。圖6A-6E顯不Arch是突光電壓指不器。圖6A顯不Arch作為電壓傳感器的模型。pH和膜電位均可改變希夫鹼基的質子化。所示晶體結構為細菌視紫質。Arch的結構尚不明確。圖6B顯示純化的Arch在中性的、高pH時的吸收光譜(實線)和螢光發射光譜(發射譜見虛線)。圖6C上圖顯示表達Arch的HEK細胞，通過Arch螢光是可見的。圖6C下圖顯示電壓依賴性螢光的像素權重矩陣區。標尺10 μ m。圖6D顯示Arch發揮膜電位功能的螢光。螢光值在_150mV時分開。圖6E顯示膜電位在_70mV和+30mV之間Arch的階梯狀動態響應。上升和下降邊緣的突增是電子補償電路的人為產物。數據是20個循環的平均。插入圖顯示在低於0.5ms解析度的顯像系統中的瞬態特性。圖7A-7D顯示Arch3WT動作電位的光學記錄。表達Arch-GFP的培養的大鼠海馬神經元通過GFP螢光成像。Arch螢光顯示為藍綠色，電壓依賴性螢光區顯示為紅色。圖7A顯示在一連串動作電位的單個實驗記錄中，通過直流電壓記錄(下圖，虛線)和加權Arch3突光(上圖，實線)測定的整個細胞膜電位。插入圖是在單個細胞中269個脈衝響應的平均峰值，用電壓(虛線)和螢光(實線)表示。圖7B顯示單個細胞的多個脈衝序列記錄。將注入電流200pA (黑色虛線表示)應用於表達Arch WT的神經元。通過多重電流注入的螢光容易地檢測動作電位(灰線表示)。圖7C顯示動作電位的亞細胞定位。我們以一個表達Arch的神經突起的影像並製作指示像素的權重矩陣，如圖中顯示的圖像，其螢光隨著紅色記錄電位共同變化，覆蓋在紫色的時間平均的Arch螢光。我們檢測電活性細胞中的亞細胞區。該圖頂部顯示由每個指示區域對應螢光(F)測定的動作電位時間過程(均值除以n=100脈衝)。圖中還顯示動作電位的電子記錄(V,圖底部)。圖7D顯示一個神經元中動作電位的異質動態學，通過n=33脈衝的均值計算得來。像素圖中的箭頭標註的區域(見圖片)滯後於其他細胞約 Ims (黑色箭頭)。標尺5μηι。圖8A-8D表明Arch D95N顯示具有電壓依賴性螢光而不是光電流。圖8Α顯示在Arch3WT和Arch3D95N突變體中的光電流，在固定為V=O的HEK細胞中表達。用波長λ =640nm，1800ff/cm2的光脈衝照射細胞。圖8B顯示Arch D95N螢光在_150mV和+150mV之間增加3倍，從-120mV到+120mV接近於線性靈敏度。插圖顯示電壓靈敏度圖片。標尺5 μ m。圖8C顯示瞬態特性，其包含快於500 μ s的組分(響應的20%)和恆定41ms的組分。圖8D顯示Arch D95N提供膜電位的準確估計，清楚的分辨電壓梯度為10mV，從帶有噪聲螢光對整個時間量程<12s準確度為260 μ V/(Hz)1/2進行電壓估計。圖9A-9C顯示用ArchD95N的動作電位的光學記錄。圖9A顯示電子記錄的表達Arch WT的神經元膜電位,其經過電流注入脈衝和雷射照射(I=1800W/cm2, λ =640nm)。當細胞接近閾值時，照明產生了足夠的光電流以抑制動作電位。灰色的條帶指雷射照射。在表達Arch D95N的神經元上圖9B與圖9A相同，顯示照明對脈衝或靜息電位無影響。我們提供了表達Arch D95N的神經元，顯示Arch D95N螢光(試驗中用藍綠色顯示)和電壓依賴螢光區域(實驗中用紅色顯示)。圖9C顯示一連串動作電位序列的單個實驗記錄中，通過電子記錄和權重的ArchD95N螢光(頂部，螢光線)確定整個細胞膜電位(底部，電壓線)。圖10顯示現有的基因編碼的螢光電壓指示器，根據其靈敏度和速度分類-兩個決定指示器性能的關鍵參數。VSFPs，FLARE和SPARC代表基於GFP同系物與膜蛋白的融合的指示器。我們已經開發的的示例性蛋白是變形菌視紫紅質光學質子傳感器(PROPS) ,Arch3WT,和Arch3D95N，在右上側顯示。PROPS在細菌中發揮作用，而Arch3WT和Arch3D95N在哺乳動物細胞中發揮作用。注意對數坐標軸。基於細菌視紫紅質的電壓指示器比其他指示器更靈敏，更迅速。圖11A-11D顯示在表達Arch3D95N - eGFP的單個HL-1小鼠心肌細胞中動作電位的光學記錄。記錄動作電位至多為1000s，不具有光毒性信號。這個實驗是採用基因編碼電壓指示器首次定量測定心臟動作電位。我們顯示了在D95N-GFP融合體中展示Arch D95N和GFP螢光的外罩。圖1lA顯示膜片箝記錄(虛線)和螢光(實線)測定的動作電位的比較。圖11B-11D顯示在不斷增加的長間隔中單個HL-1細胞中的動作電位的光學記錄。IlD中的數據已校正光漂白作用。圖12顯示表達Arch3D95N-eGFP的人類誘導多能幹細胞(iPS)衍生的心肌細胞中動作電位的光學記錄。人類誘導多能幹細胞(hiPSC)由細胞動力學有限公司(CellularDynamics Inc.)提供。細胞在MatTek皿中以每平方釐米上20000，50000或75000的細胞的密度進行培養，其中該培養皿塗有0.1%明膠。這些條件顯示細胞是稀疏且不自發搏動的(20K)，融合單分子層是自發搏動(50K)的，和密集的單分子層(75K)。iPS細胞在培養基中培養並保持48小時，且其後每48小時供給維持培養基(均來自細胞動力學公司)(Cellular Dynamics Inc.)。根據生產說明書使用Mirus LT-1轉染iPS細胞。在包括20uL OPT1-MEM 的試管中，加入200ng的DNA和1.2uL的LT-1轉染試劑。DNA混合物在室溫下孵化20分鐘。孵化過程中，將新鮮的維持培養基附加到iPS細胞中，DNA混合物滴加到平皿中。細胞在轉染後的48小時到96小時成像。我們觀察到毗鄰細胞的同步搏動，表明VIPs可探測細胞間的傳導。我們持續記錄10分鐘以上，幾乎沒有光毒性。如對該種群期望的，在細胞種群內，我們觀察到了與心室的，心房的，和節的細胞的動作電位相匹配的細胞。藥物的附加導致動作電位波形變化，該變化與常規膜片箝報告的記錄變化相匹配。在螢光對比時間的圖片中細胞I螢光信息為實線，細胞2螢光為虛線。圖13實驗證明了 VIPs與GFP同系物融合蛋白構建體的開發的一系列改進的電壓指示器。每個條狀的長度表明蛋白序列或接頭區域的長度。顏色表明相應蛋白螢光的顏色。所有的構建體用Arch WT和Arch D95N骨架進行構建。該構建體的序列在下面的序列表提供:
權利要求
1.一種在表達編碼細菌視紫紅質蛋白的核酸的細胞中測定膜電位的方法，該方法包括如下步驟: a)用至少一個波長的光體外激發至少一個包含編碼細菌視紫紅質蛋白的核酸的細胞；和 b)體外檢測來自至少一個細胞的至少一個光學信號，其中與參考相比，通過至少一個細胞的發射螢光強度水平指示細胞膜電位。
2.如權利要求1所述的方法，其中細菌視紫紅質蛋白是修飾的細菌視紫紅質蛋白，與源自於天然的細菌視紫紅質蛋白相比，其離子泵活性降低。
3.如權利要求2所述的方法，其中修飾的細菌視紫紅質包括鄰近希夫鹼基的突變質子受體。
4.如前述權利要求任一項所述的方法，其中細菌視紫紅質蛋白是變形菌視紫紅質蛋白家族的成員。
5.如權利要求1-3任一項所述的方法，其中細菌視紫紅質蛋白是古細菌視紫紅質蛋白家族的成員。
6.如前述 權利要求任一項所述的方法，其中至少一個波長是在λ=594-645ηπι之間的波長。
7.如前述任一項權利要求所述的方法，其中細胞是原核細胞。
8.如權利要求1-6任一項中的方法，其中細胞是真核細胞。.
9.如權利要求8中的方法，其中真核細胞是哺乳動物細胞。
10.如權利要求8中的方法，其中真核細胞是幹細胞或多能細胞或祖細胞。
11.如權利要求8中的方法，其中真核細胞是誘導多能細胞。
12.如權利要求8中的方法，其中真核細胞是神經元。
13.如權利要求8中的方法，其中真核細胞是心肌細胞。
14.如前述任一項權利要求所述的方法，還包括將載體體外轉染給至少一個細胞的步驟，所述載體包含編碼細菌視紫紅質蛋白的核酸。
15.如前述任一項權利要求所述的方法，其中編碼細菌視紫紅質蛋白的核酸與細胞型特異的啟動子可操作地連接啟動子。
16.如前述任一項權利要求所述的方法，其中編碼細菌視紫紅質蛋白的核酸可操作地連接於膜-靶向的核酸序列。
17.如權利要求16所述的方法，其中膜靶向核酸序列是質膜靶向核酸序列。
18.如權利要求16所述的方法，其中膜靶向核酸序列是亞細胞區室靶向核酸序列。
19.如權利要求18所述的方法，其中亞細胞區室是選自於線粒體膜，內質網，肌質網，突觸小泡，內涵體或吞噬小體。
20.如前述任一項權利要求所述的方法，其中編碼細菌視紫紅質蛋白的核酸可操作地連接於編碼至少一個附加額外的螢光蛋白或生色團的核酸。
21.如權利要求20所述的方法，其中至少一個附加額外的螢光蛋白是能夠指示細胞內離子濃度的螢光蛋白。
22.如權利要求21所述的方法，其中能夠指示離子濃度的螢光蛋白是鈣指示器。
23.如權利要求21所述的方法，其中能夠指示離子濃度的螢光蛋白是pH指示器。
24.如權利要求20所述的方法，其中至少一個附加螢光蛋白能夠進行非放射性螢光共振，使能量轉移到細菌視紫紅質，其能量轉移速率取決於膜電位。
25.如權利要求20所述的方法，其中至少一個附加螢光蛋白是綠色螢光蛋白或其同系物。
26.如權利要求20-25任一項所述的方法,其中突光蛋白的亮度對膜電位或局部化學環境不敏感。
27.如權利要求20-26任一項所述的方法還包括如下步驟:採用至少第一和第二波長的光體外激發至少一個細胞；和體外檢測至少第一和第二光學信號，該信號由來自至少一個細胞的至少的第一和第二波長的激發引起。
28.如權利要求27所述的方法，其中第二波長在λ=447-594nm之間。
29.如權利要求26-28任一項所述的方法，還包括如下步驟:計算細菌視紫紅質的螢光發射與至少一個附加螢光蛋白的螢光發射的比率，以獲取不依賴於表達水平差異的膜電位測定。
30.如如前述任一項權利要求所述的方法還包括將至少一個細胞在體外暴露於能夠或預期能夠改變膜電位的刺激的步驟。
31.如權利要求30所述的方法，其中刺激是候選試劑。
32.如權利要求30所述的方法，其中刺激是細胞培養基組分的變化。
33.如權利要求30所述的方法，其中刺激是電流。
34.如前述任一項權利要求所述的方法，進一步包括在第一和至少第二時間點體外測定至少一個光學信號的步驟。
35.如權利要求34所述的方法，其中第一時間點是在將至少一個細胞暴露於刺激之前，至少第二時間點是將至少一個細胞暴露於刺激之後。
36.如前述任一項權利要求所述的方法包括多個細胞。
37.一種分離和純化的核酸，其編碼古細菌視紫紅質蛋白家族的修飾成員，與來自於古細菌視紫紅質蛋白家族的天然成員相比，離子泵活性降低。
38.如權利要求37所述的分離和純化的核酸，古細菌視紫紅質蛋白家族的修飾成員包括鄰近希夫鹼基的突變質子受體。
39.如權利要求37-38任一項所述的分離和純化的核酸，其可操作地連接於編碼膜靶向核酸序列的核酸序列。
40.如權利要求39所述的分離和純化的核酸，其中膜靶向的核酸序列是質膜靶向的核酸序列。
41.如權利要求39所述的分離和純化的核酸，其中膜靶向的核酸序列是亞細胞膜靶向的核酸序列。
42.如權利要求41所述的分離和純化的核酸，其中亞細胞膜是線粒體膜，內質網，肌質網，突觸小泡，內涵體或吞噬小體。
43.如權利要求37-42任一項所述的分離和純化的核酸，其與細胞型特異的啟動子可操作地連接啟動子。
44.如權利要求37-43任一項所述的分離和純化的核酸，其可操作地連接於編碼至少一個附加螢光蛋白或生色團的核酸。
45.如權利要求44所述的分離和純化的核酸，其中至少一個附加螢光蛋白是綠色螢光蛋白或其同系物。
46.如權利要求45所述的分離和純化的核酸，其中至少一個附加螢光蛋白能夠指示細胞內離子濃度的螢光蛋白。
47.如權利要求46所述的分離和純化的核酸，能夠指示離子濃度的螢光蛋白是鈣指示器。
48.如權利要求46所述的分離和純化的核酸，能夠指示離子濃度的螢光蛋白是pH指示器。
49.如權利要求44-45所述的分離和純化的核酸，其中至少一個附加螢光蛋白是能夠進行非放射性螢光共振，使能量轉移到細菌視紫紅質，其能量轉移速率取決於膜電位。
50.如權利要求37-49任一項所述的分離和純化的核酸，其進一步包括載體。
51.如權利要求50所述的分離和純化的核酸，其中載體是病毒載體。
52.如權利要求51所述的分離和純化的核酸，其中病毒載體是慢病毒載體。
53.如權利要求51所述的分離和純化的核酸,其中病毒載體是腺相關病毒載體。
54.一種試劑盒，包括在容器中的權利要求37-53任一項所述的分離和純化的核酸。
55.一種分離細胞，其包括編碼細菌視紫紅質蛋白的核酸，其中細菌視紫紅質蛋白是修飾的細菌視紫紅質蛋白，與來自於天然的細菌視紫紅質蛋白相比，離子泵活性降低。
56.如權利要求55所述的分離細胞，其中修飾的細菌視紫紅質蛋白包括鄰近希夫鹼基的突變質子受體。
57.如權利要求55-56任一項所述的分離細胞，其中細菌視紫紅質是變形菌視紫紅質家族的成員。
58.如權利要求55-56任一項所述的分離細胞，其中細菌視紫紅質是古細菌視紫紅質家族的成員。
59.如權利要求55-58任一項所述的分離細胞，其中細胞是真核細胞。
60.如權利要求55-58任一項所述的分離細胞，其中細胞是原核細胞。
61.如權利要求55-60任一項所述的分離細胞，其中修飾的細菌視紫紅質基因可操作地連接於啟動子。
62.如權利要求61所述的分離細胞，其中啟動子是細胞型特異性的啟動子。
63.如權利要求55-62任一項所述的分離細胞，其中編碼細菌視紫紅質蛋白的核酸可操作地連接於膜靶向的核酸序列。
64.如權利要求63所述的分離細胞，其中膜靶向核酸是質膜靶向的核酸序列。
65.如權利要求63所述的分離細胞，其中膜靶向性核酸是亞細胞區室-靶向的核酸序列。
66.如權利要求65所述的分離細胞，其中亞細胞區室是選自於線粒體膜，內質網，肌質網，突觸小泡，內涵體或吞噬小體。
67.如權利要求55-66任一項所述的分離細胞，其中編碼修飾的細菌視紫紅質蛋白的核酸可操作地連接於編碼至少一個附加螢光蛋白或生色團的核酸。
68.如權利要求67所述的分離細胞，其中至少一個附加螢光蛋白是綠色螢光蛋白或其同系物。
69.如權利要求67-68任一項所述的分離細胞，其中至少一個附加螢光蛋白是能夠進行非放射性螢光共振，使能量轉移到細菌視紫紅質，其能量轉移速率取決於膜電位。
70.如權利要求67-68任一項所述的分離細胞，其中至少一個附加螢光蛋白的亮度是對膜電位或局部化學環境不敏感的螢光蛋白。
71.如權利要求67-68任一項所述的分離細胞，其中至少一個附加螢光蛋白能夠指示細胞內離子濃度的螢光蛋白。
72.如權利要求71所述的分離細胞，其中能夠指示離子濃度的螢光蛋白，是鈣指示器。
73.如權利要求71所述的分離細胞，其中能夠指示離子濃度的螢光蛋白是pH指示器。
74.如權利要求55-73任一項所述的分離細胞，其中細胞是幹細胞，多能細胞，或誘導多能細胞，或其分化或未分化的子代細胞。
75.如權利要求55-73任一項所述的分離細胞，其中細胞是分化細胞。
76.如權利要求75所述的分離細胞,其中分化細胞是神經元。
77.如權利要求75所述的分離細胞，其中分化細胞是心肌細胞。
78.一種分離細胞，其含有權利要求37-53任一項所述分離和純化的核酸。
79.—種試劑盒，含有權利要求55-78任一項所述的在合適的細胞培養基上的多個細胞和容器。
80.一種用於膜電位光學測定的工程細胞的生產方法，包含採用編碼細菌視紫紅質蛋白的核酸轉導細胞的步驟。
81.如權利要求80所述的方法，其中所述細菌視紫紅質蛋白是修飾的細菌視紫紅質蛋白，相比於天然細菌視紫紅質蛋白，其離子泵活性降低。
82.如權利要求80-81任一項所述的方法，其中修飾的細菌視紫紅質包括突變的鄰近希夫鹼基的質子受體。
83.如權利要求80-82任一項所述的方法，其中編碼細菌視紫紅質蛋白的核酸可操作地連接於膜靶向核酸序列。
84.如權利要求83所述的方法，其中膜靶向核酸序列是質膜靶向的核酸序列。
85.如權利要求83所述的方法，其中膜靶向性的核酸序列是亞細胞膜靶向的核酸序列。
86.如權利要求85所述的方法，其中亞細胞膜是線粒體膜，內質網，肌質網，突觸小泡，內涵體或吞噬小體。
87.如權利要求82-86任一項所述的方法，其中編碼細菌視紫紅質蛋白的核酸與細胞型特異的啟動子可操作地連接啟動子。
88.如權利要求80-87任一項所述的方法，其中編碼細菌視紫紅質蛋白的核酸可操作地連接於編碼至少一個附加螢光蛋白或生色團的附加核酸。
89.如權利要求88所述的方法，其中至少一個附加螢光蛋白是綠色螢光蛋白或其同系物。
90.如權利要求88-89任一項所述的方法，其中至少一個附加螢光蛋白能夠指示細胞內離子濃度。
91.如權利要求90所述的方法，其中能夠指示細胞內的離子濃度的至少一個附加螢光蛋白是鈣指示器。
92.如權利要求90所述的方法，其中能夠指示細胞內的離子濃度的至少一個附加螢光蛋白是PH指示器。
93.如權利要求80-92任一項所述的方法，其中細胞是分化細胞。
94.如權利要求93所述的方法，其中分化細胞是神經元。
95.如權利要求93所述的方法，其中分化細胞是心肌細胞。
96.如權利要求80-92任一項所述的方法，其中細胞是多能細胞，幹細胞或誘導多能幹細胞。
97.如權利要求96所述的方法，進一步包括多能細胞，幹細胞或誘導多能幹細胞分化為分化細胞的步驟。
98.如權利要求80-97任一項所述的方法，其中轉導採用瞬時轉染來實施。
99.如權利要求80-97任一項所述的方法，其中轉導是採用穩定轉染來實施。
100.如權利要求80-99任一項所述的方法，其中採用權利要求37-53任一項所述的分離和純化的核酸轉導細胞。
101.一種在表達編碼細菌視紫紅質蛋白的核酸的細胞中測定膜電位的方法，該方法包括步驟: a)用至少一個波長的光激發至少一個包含編碼細菌視紫紅質蛋白的核酸的細胞；和 b)檢測來自至少一個細胞 的至少一個光學信號，其中與參考相比，由至少一個細胞的發射螢光強度水平指示細胞膜電位。
102.如權利要求101所述的方法，其中細菌視紫紅質蛋白是修飾的細菌視紫紅質蛋白，或與來自於天然的細菌視紫紅質蛋白相比，該蛋白離子泵活性降低。
103.如權利要求102所述的方法，其中細菌視紫紅質包括鄰近希夫鹼基的突變的質子受體。
104.如權利要求101-103任一項所述的方法，其中細菌視紫紅質蛋白是變形菌視紫紅質蛋白家族的成員。
105.如權利要求101-103任一項所述的方法，其中細菌視紫紅質蛋白是古細菌視紫紅質蛋白家族的成員。
106.如權利要求101-105任一項所述的方法，其中至少一個波長是在λ=594-645ηπι之間的波長。
107.如權利要求101-106任一項所述的方法，其中細胞是原核細胞。
108.如權利要求101-106任一項所述的方法，其中細胞是真核細胞。
109.如權利要求108所述的方法，其中真核細胞是哺乳動物細胞。
110.如權利要求108所述的方法，其中真核細胞是幹細胞或多能細胞或祖細胞。
111.如權利要求108所述的方法，其中真核細胞是誘導多能細胞。
112.如權利要求108所述的方法，其中真核細胞是神經細胞。
113.如權利要求108所述的方法，其中真核細胞是心肌細胞。
114.如權利要求101-112任一項所述的方法，進一步包括採用載體轉染至少一個細胞的步驟，所述載體包括編碼細菌視紫紅質蛋白的核酸。
115.如權利要求101-114任一項所述的方法，其中編碼細菌視紫紅質蛋白的核酸與細胞型特異的啟動子可操作地連接。
116.如權利要求101-115任一項所述的方法，其中編碼細菌視紫紅質蛋白的核酸可操作地連接於膜靶向的核酸序列。
117.如權利要求116所述的方法，其中膜靶向核酸序列是質膜靶向核酸序列。
118.如權利要求116所述的方法，其中膜靶向核酸序列是亞細胞區室靶向核酸序列。
119.如權利要求118所述的方法，其中亞細胞區室是選自於線粒體膜，內質網，肌質網，突觸小泡，內涵體或吞噬小體。
120.如權利要求101-119任一項所述的方法，其中編碼細菌視紫紅質蛋白的核酸可操作地連接於編碼至少一個附加螢光蛋白或生色團的核酸。
121.如權利要求120所述的方法，其中至少一個附加螢光蛋白是能夠指示細胞內離子濃度的螢光蛋白。
122.如權利要求121所述的方法，其中能夠指示離子濃度的螢光蛋白是鈣指示器。
123.如權利要求121所述的方法，其中能夠指示離子濃度的螢光蛋白是pH指示器。
124.如權利要求120所述的方法，其中至少一個附加螢光蛋白能夠進行非放射性螢光共振，使能量轉移到細菌視紫紅質，其能量轉移速率取決於膜電位。
125.如權利要求120所述的方法，其中至少一個附加螢光蛋白是綠色螢光蛋白或其同系物。
126.如權利要求120-125任一項所述的方法，其中螢光蛋白的亮度對膜電位或局部化學環境不敏感。
127.如權利要求120-126任一項所述的方法，進一步包括如下步驟:採用至少第一和第二波長的光體外激發至少一個細胞；和體外檢測至少第一和第二光學信號，該信號由來自至少一個細胞的至少第一和第二波長的激發引起。
128.如權利要求127所述的方法，其中至少第二波長在λ=447-594ηπι之間。
129.如權利要求120-128任一項所述的方法，進一步包括如下步驟:計算細菌視紫紅質的螢光發射與至少一個附加螢光蛋白的螢光發射的比率，以獲取不依賴於表達水平差異的膜電位測定。
130.如權利要求101-129任一項所述的方法，進一步包括將體外至少一個細胞暴露於能夠或預期能夠改變膜電位的刺激的步驟。
131.如權利要求130所述的方法，其中刺激是候選試劑。
132.如權利要求130所述的方法，其中刺激是細胞培養基組分的變化。
133.如權利要求130所述的方法，其中刺激是電流。
134.如權利要求101-133任一項所述的方法，進一步包括在第一和至少第二時間點體外測定至少一個光學信號的步驟。
135.如權利要求134所述的方法，其中第一時間點是在將至少一個細胞暴露於刺激之前，以及至少第二時間點是將至少一個細胞暴露於刺激之後。
136.如權利要求101-135任一項所述的方法，包括多個細胞。
137.如權利要求101-136任一項所述的方法，其中細胞是非人類細胞。
全文摘要
本發明提供膜電位的光學測量方法，細胞和構建體。這些方法可用於採用現有電極方法不可接觸到的細胞。本方法可用於，例如，高通量藥物篩選試驗中測定能夠影響靶細胞膜電位的試劑。
文檔編號G01N33/50GK103168236SQ201180050734
公開日2013年6月19日 申請日期2011年8月23日 優先權日2010年8月23日
發明者亞當·E·科恩, 喬爾·M·克拉利, 亞當·D·道格拉斯 申請人:哈佛大學管理委員會