具有確定引入的標誌基團和半抗原的低聚載體分子的製作方法

2023-06-16 16:52:46

專利名稱：：具有確定引入的標誌基團和半抗原的低聚載體分子的製作方法
技術領域：
：本發明涉及新的結合物，它的製備方法以及這些結合物作為抗原在免疫學的檢證方法中或對於DNA-診斷的應用。在體液，特別是在人血清中免疫球旦白的檢證是應用於微生物，特別是病素，如HIV(Humanlmmunodeficiencyvirus，人類免疫缺陷病毒即愛滋病病素)，肝炎病毒等的感染的診斷。特異的免疫球旦白在被檢查樣品中的存在一般是通過一個或多個與這種特異免疫球旦白起反應的抗原來證實，在試樣液體中測定特異免疫球旦白的方法必須是敏感的、可靠的、簡單和迅速。另一個免疫學的方法是競爭免疫測定法，在這種方法中一個分析物的定性和定量的檢測可通過下述方法作到，即一個與這個分析物在免疫學上類似的半抗原和這個分析物來競爭在一個受體上的，例如在一個抗體上的結合部位，分析物類似物在此一般是以標誌的形式或者是以在一個固體相上結合的形式來使用。最近幾年日益增多地發展了以非放射性的標誌基團為基礎的檢證系統，在這些方法中分析物，例如一種特異抗體在被檢查試樣中的存在可以藉助光學的(例如發光或螢光)，核磁共振-活性的或金屬-沉澱的檢測系統來確定。EP-A-O307149公開了對於一個抗體的一個免疫試驗，在這個試驗中應用兩個重組的多肽作為抗原，其中的一個是固定在一個固體相上，和另外一個攜帶一個標誌基團，為了提高檢證的特異性兩個重組抗原是擠壓在不同的生物體上。EP-A-366673公開了在一個試樣中檢證抗體的一個方法，在此方法中一個抗體通過與一個提純的標誌抗原和與相同的提純抗原以一種固體相結合的形式反應來證實。並公開了例如以人的IgG作為抗原。EP-A-0386713說明了一個抗HIV抗體的一個檢證方法，是應用兩個固相載體，在兩個固相載體上固定了不同的HIV-抗原，分別與一個等分的試樣和一個標誌的HIV-抗原接觸，抗體的存在是通過在這些試驗中至少有一個是陽性反應來驗證的。並公開了以重組制出的多肽作為HIV-抗原。EP-A-0507586說明了一個特異免疫球旦白免疫學試驗的實施方法，即一個試樣與兩個能結合這個免疫球旦白的抗原接觸，其中一個抗原攜帶著一個能結合在一個固相載體上的基團，另一個抗原攜帶著一個標誌基團。標誌基團可以是一個直接的標誌基團，例如一個酶，一個色素原，一個金屬粒子，或者也可以是一個間接的標誌基團，亦即帶在抗原上的標誌基團可以與一個該標誌基團的受體起反應，這個受體又攜帶著一個產生信號的基團。例如螢光素衍生物便是這樣一個間接的標誌基團，它的受體是一個抗體，該抗體又與一個酶相結合。公開的抗原有多肽，例如肝炎B-表面抗原，向這種抗原通過衍生化導入SH-基，螢光素便是與這些基團相結合的。EP-A-0507587公開了一個專門用以檢證IgM抗體的方法，即將試樣與一個針對待檢抗體的標誌抗原和與另一個同樣針對待檢抗體並可結合在一個固相上的抗原一起孵育。EP-A-0199804和EP-A-0580979公開了一個免疫學檢證方法，是應用用發光的金屬螯合物基團，特別是用釕螯合物基團和鋨螯合物基團標誌的抗原。用免疫球旦白作為抗原，這些免疫球旦白是通過與活性金屬絡合物反應隨機標誌的。EP-A-0178450公開了金屬螯合物，特別是釕絡合物，在它上面可以結合上一個免疫活性物質，例如抗體，這個結合是通過免疫反應物質與金屬螯合物的統計反應來實現。EP-A-0255534公開了一個發光免疫測定法，是應用一個結合了金屬螯合物的抗原或抗體。這種結合是通過例如一個金屬螯合物-活性酯衍生物與一個抗體的隨機反應來進行的。WO90/05301公開了一個通過電化學發光的方法來檢證和定量測量分析物，是應用發光的金屬螯合物結合在(i)一個加入的分析物，(ii)分析物的一個結合夥伴或(iii)一個反應部分上，後者可以與(i)或(ii)結合。發光測量通過將金屬螯合物結合在激活的和必要時磁性的微粒上來完成的。根據現有技術水平已知的對於抗體的免疫學檢證方法通常是應用多肽-抗原，這種多肽-抗原大多數是通過重組的DNA-方法來製備。然而在使用這種多肽-抗原時會出現問題。常常有可能是重組多肽只產生一種融合多肽的形式，它的融合部分在試驗中可以導致錯誤的陽性結果。再者通過重組壓榨法產生的多肽的試樣液體中常常只有較小的穩定性並且傾向於聚集。另一個缺點是標誌的基團向這種多肽的導入常常是沒有選擇和再複製的可能。此外重組的多肽抗原的製備代價高，並且免疫學反應在不同價格的重組多肽中可以出現較大的偏差。當利用已知的抗原，應用對敏感性和精確性要求極高的競爭免疫測定法來檢證濃度極小的分析物如雌(甾)二醇或睪(甾)醇時，尤其是當應用以電化學發光為基礎的檢證系統時，很難以達到所要求的檢證下限值。因此本發明所要解決的問題是提供一個能夠用簡單的和高效率的方式製備用於免疫試驗的抗原的方法，使在現有技術狀況下所製備的已知抗原的缺點至少可以部分地排除。此外這種方法應該能夠使標誌基團選擇性地和可複製性地導入抗原中這個問題通過結合物得到解決，它包含一個具有最多100個單體單元的聚合物載體，這個載體含有結合在反應側基上的1-10個半抗原分子和1-10個標誌基團或固體相結合基團，其中單體單元是由胺基酸，核甙酸和肽的核酸選出。通過將本發明的結合物(含有1-10個半抗原分子和一定數目的標誌基團或固體相結合基團)作為抗原應用在一個免疫學檢證方法中，使人驚異的是在與已知的單體和多體的抗原相比較，檢證下限值降低的同時可以達到一個明顯提高的敏感性和精確性。除此之外本發明的結合物可以很簡單的方式通過固相合成。例如肽-固相合成而獲得。對此，單體單元，例如胺基酸衍生物，總是可以裝在預定的位置上，單體單元是與一個半抗原分子或與一個標誌基團或者與一個固體相結合基團衍化出來的。此外在固相合成結束後在存在有帶有自由官能團的單體的載體鏈部位可以附加選擇性的引入半抗原或標誌基團或者是固體相結合基團。因此將半抗原分子和標誌基團或者是固體相結合基團準確而又可複製地引入結合物已成為可能。在結合物上的單個基團之間的距離可以準確的確定和必需時也可以變化。通過對結合物上標誌基團的距離的選擇可以使信號熄滅保持在極小。從而使信號的強度與標誌基團的數目成正比增加。並且標誌基團的一個確定的空間方向，例如在螺旋形的載體，有助於改善信號的強度。尤其是在螺旋載體，例如單股的或特別是雙股的核酸中，標誌基團之間的距離則總計為3-6或/和13-16個單體單元。構成結合物主鏈的聚合載體分子其長度最大為100個單體單元優選3-80個單體單元，特別優選是5-60個單體單元。單體單元是由胺基酸，核甙酸和肽的核酸選出。優選的是聚合載體包含一個由胺基酸構成的肽鏈，優選是一個直線的肽鏈。載體也可以包含一個由核甙酸或核甙酸類似物構成的核酸鏈，在其反應的側基上結合有半抗原分子和標誌基團或者固體相結合基團。這種核酸鏈可以是單股的或者是雙股的。在雙股的核酸載體常常發現標誌基團的信號強度提高，例如在螢光標誌基團中量子收率改善。此外聚合載體可以由肽核酸(PNA)構成。肽核酸包含一個聚醯胺主鏈，它由相同或不相同的下式單體單元構成。(CH2)k-CHR-N[CO-(CH2)i-L]CH2-(CH2)m-NH-CO-，其中L是由氫，苯基，自然存在的核礆和非自然存在的核礆構成的組中選出，R』是由氫和自然和非自然存在的胺基酸、優選是α-胺基酸側鏈組中選出，k和m分別為0或1，i是獨立的0至5。半抗原分子和標誌基團或固體相結合基團可以結合在肽核酸的核鹼-或/和胺基酸側鏈上。肽核酸和它的製備在WO92/20703有說明。在這裡將其公開內容併入。在肽核酸情況下載體可以是單股或是雙股的。特別優選的是帶有至少一個PNA-股，例如一個PNA-股和一個核酸股，例如一個DNA-股的雙股的載體。結合物含有1-10個半抗原分子，優選1-6個半抗原分子和特別優選的是1或2個半抗原分子。而半抗原優選是具有100-2000Da分子量的免疫學反應分子。這種半抗原分子以例如由藥理學活性物質選出，例如抗生素，鴉片製劑，安非他明，巴比妥類，細胞抑制藥(例如慶大黴素，妥布黴素，萬古黴素等)，撲熱息痛，水楊酸鹽，苯妥因，奎寧和奎寧衍生物，茶礆等，激素和代謝產物如甾醇，膽酸，性激素(例如雌(甾)二醇，雌(甾)三醇，睪(甾)酮，黃體酮，孕烯醇酮和它們的衍生物)，腎上腺皮質激素類(例如皮質(甾)醇，皮質(甾)酮，可的松和它們的衍生物)，卡烯內酯和卡烯內酯-甙(例如地高辛，地高辛配基，毒毛旋花子甙，蟾二烯羥酸內酯等)，類甾醇皂甙配基，甾類生物鹼，肽激素，股酐酸，甲狀腺激素(例如T3，T4)，神經遞質(例如5-羥色胺，膽礆，γ一氨基丁酸)，維他命和介質如前列腺素，白三烯(Lenkotrienen)，白內二炔(Leuko-En-diinen)和凝血噁烷類。另一方面半抗原可以由免疫學反應的肽抗原決定簇選出，它優選有直至30個胺基酸的長度。這種肽抗原決定簇可以來自例如致病的生物，如細菌，病毒和原蟲或者自體免疫抗原。例如這種免疫學反應肽抗原決定簇可以來自病毒的抗原，如HIVI，HIVII或肝炎C-病毒(HCV)的胺基酸序列。除此之外半抗原也可以由具有一個長度優選至50個核甙酸的核酸中選出，這些核甙酸補充到核酸序列，這個核酸序列在試樣中應該被檢證。半抗原也可以由具有一個長度直至50個單體單元的肽核酸選出。此外本發明的結合物含有1-10個，優選2-8個標誌基團或固體相結合基團。對於標誌基團優選的例子是發光的金屬螯合物和螢光標誌。對於固體相結合基團優選的例子是生物素和生物素類似物，如脫硫生物素和非米諾(Immino)生物素，它們可以與抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白完成一個特異反應。半抗原分子和標誌基團或固體相結合基團優選通過反應的氨側基或/和硫羥側基，特別優選的是通過反應的伯氨基側基結合在載體側鏈上。這種側基可以通過向載體鏈導入相應的單體，例如胺基酸如細胞溶素，烏氨酸，羥(基)賴氨酸或半胱胺酸來製造。在本發明確定的實施形式中優選的可以是，將一個間隔基導入到半抗原或標誌基團或固體相結合基團和載體鏈之間。間隔基優選是易彎曲的和最好是有一個3-30個原子的鏈長度，特別優選的是間隔基含有親水的基團，例如氧化烯-或/和羥基-側基。優選的標誌基團是發光的金屬螯合物，亦即能夠產生一個可以檢證的發光反應的金屬螯合物。這個發光反應的檢證可以通過例如螢光-或通過電化學發光測量來完成。這種金屬螯合物的金屬是例如一個過渡金屬或者是一個稀土金屬。這種金屬優選的是釕，鋨，錸，銥，銠，鉑，銦，鈀，鉬，鎝，銅，鉻或鎢。特別優選的是釕，銥，錸，鉻和鋨。最優選的是釕。與金屬一起構成金屬螯合物的配位體通常是多配位基-配位體。亦即配位體具有多個配合位。多配位基配位體包括例如芳香族的和脂肪族的配位體。適合的芳香族的多配位基-配位體包含有芳香族雜環的配位體。優選的芳香族雜環配位體是含N的多雜環例如聯吡啶，聯吡唑(Bipyrazy)，三聯吡啶和菲酚基。這種配位體可以包括例如取代基如烷基，取代的烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，羧酸根，羧基醛，羧醯胺，氰基，氨基，羥基，亞氨基，羥基羰基，氨基羰基，脒，胍鹽，醯脲，含硫的基，含磷的基和N-羥基琥珀醯亞胺的羧酸酯。優選的配位體含有C2-C3-亞烷基氧基，C2-C3-亞烷基硫基和C2-C3-亞烷基氨基，特別是亞乙基氧基。螯合物也可以含有一個或多個單配位基-配位體。單配位基配位體的例子包括一氧化碳，氰化物，異氰化物，滷化物，和脂肪族的，芳香族的和雜環的膦，胺，芪和胂。特別優選的發光金屬螯合物是由具有聯吡啶或菲酚基的配位體的金屬螯合物選出。適合的金屬螯合物的例子和它的製備是在EP-A-017450，EP-A-0255534，EP-A-0580979和WO90/05301有所說明。在此引入這些公開。最優選的金屬螯合物是釕-(聯吡啶)3-螯合物。這種螯合物可以活性酯衍生物的形式在商業市場上得到，例如從IgenInc.(Rockville，MD，USA)。在應用一個可通過電化學發光反應檢證的發光的金屬配合體作為標誌基團時，至少將一個陽性或/和陰性電荷載體，例如氨基或羧酸根基團，引入到載體鏈或/和引入到金屬配合體和載體鏈之間的間隔基表明是合適的。特別優選的是載體鏈含有一個或多個陰性電荷，它可能是例如通過在合成過程中引入穀氨酸或天冬氨酸產生的。並且在其它的標誌基團或固體相結合基團，例如螢光基團或生物素中，向載體鏈或/和向間隔基引入電荷載體是優選的。對於優選的標誌基團的另一個例子是螢光標誌，如螢光素，香豆素，若丹明，試滷靈，花香和它們的衍生物。在應用發螢光的標誌基團時載體主鏈為一個螺旋結構證明是有利的，它固定螢光標誌基團有關空間定位和距離以防止通過能量傳遞所致的螢光熄滅。對於產生一個適合的螺旋結構的單體的例子是脯氨酸或者是帶有一個脯氨酸側基的肽核酸衍生物。本發明的結合物的製備是通過以下方法，即由單體單元在固相合成一個聚合載體，優選肽載體，其中(a)在合成過程中將單體衍生物引入到載體的預定部位，單體衍生物與半抗原分子或/和標誌基團或固體相結合基團共價結合；或/和(b)在合成後將活性的半抗原分子或/和標誌基團或固體相結合基團結合在載體的反應側基上。由本發明方法演變的改進方法(a)是在固相合成時引入單體衍生物，它最好是通過鹼性胺基酸如細胞溶素或烏氨酸的伯氨基側基或者是通過胺基酸如半胱氨酸的硫羥側基與半抗原分子或/和標誌基團或固體相結合基團共價結合。相應的單體衍生物的製備例如可以通過將一個活性的半抗原分子或者一個活性的標誌基團或者是固體相結合基團，例如一個活性酯衍生物結合在一個自由的伯氨基上或者是將一個馬來醯亞胺衍生物結合在一個必要時是部分被保護的單體衍生物，例如胺基酸衍生物的一個自由硫羥基上來完成。在圖1中所示是一個優選的結合了金屬螯合物的細胞溶素衍生物。在圖2所示是一個生物素化的細胞溶素衍生物。「活性酯」的概念按本發明的意思包括活性酯基團，它能與肽的自由氨基在這樣的條件下反應，即沒有可能與肽的其它反應基團出現幹擾的副反應。優選的是應用N-羥基琥珀醯亞胺作為活性酯衍生物。除了N-羥基琥珀醯亞胺也可以應用類似的p-硝基苯基-，五氟苯基-，咪唑基-或N-羥基苯並三唑基酯。適合引入低(聚)核苷酸載體中的半抗原-，標誌基團-和固體相結合基團衍生物的製備，在Theisen等發表的文章(TetrahedronLetter33(1992)，5033-5036)中舉例螢光染料5-羧基螢光素時有所說明，該螢光染料被轉化成磷醯胺衍生物。這個磷醯胺衍生物可以引入到低(聚)核苷酸衍生物的5』-尾端或/和3』-尾端或者是引入到低(聚)核苷酸序列之內。由本發明方法演變的改進方法(b)是在用於固相合成的單體衍生物的保護基離解之後，最好是將引入基團結合在載體的氨基-或/和硫羥-側基上，特別優選的是結合在伯氨基側基上。優選的是按改進方法(a)引入半抗原和標誌基團或固體相結合基團，亦即在固體相合成時應用結合了待引入基團的單體衍生物。例如發光的金屬螯合物，生物素或肽半抗原可以按照這種改進方法順利地導入。然而在敏感的螢光染料或-標誌基團或其它半抗原，如類固酮中，前面的方法有較小的優越性，因為這些物質通過在固相合成時控制的條件可以遭到破壞。在這種情況結合物的製備優選是按照改進方法(b)，即通過在完成了的載體分子上的補充結合來實現。自然改進方法(a)和(b)相結合是可能的。也可以按照改進方法(b)即合成結束之後將兩個不同的基團引入，例如一個半抗原和一個標誌基團或一個半抗原和一個固體相結合基團。對此可以按改進方法(b)例如這樣進行，即第一個待引入的基團結合在載體分子的氨基側基和第二個待引入的基團結合在載體分子的硫羥側基。另一方面也可以將這二個待引入基團分別選擇性地結合在載體的預定的伯氨基側基上，在此在載體的應該與半抗原發生結合的部位，應用一個帶有用於氨基側基的第一個保護基的單體衍生物，而在載體的應該與標誌-或固體相結合基團發生結合的部位，應用一個帶有用於氫基側基的第二個保護基的單體衍生物，並且第一個和第二個保護基是這樣選擇的，即一個選擇性保護基的解離及其之後一個選擇性的結合能夠分在兩個反應步驟完成。對此第一個和第二個保護基可以由酸不穩定的氨基保護基，如BOC或酸穩定的保護基，如苯乙醯基選出。在按本發明的方法中具有所希望的單體序列的載體分子是在一個固體相製備。肽載體的製備優選是用商業上的肽-合成設備(例如Applied生物系統設備A431或A433)。合成根據已知方法來實現，優選是在應用胺基酸衍生物的條件下由肽的羧基末端開始。優選使用胺基酸衍生物，它們用於結合所需要的氨基-端基是與芴基甲基羥基羰基(Fmoc)-殘基衍化了的。加入的胺基酸的反應側基含有保護基，它們在肽合成結束後可以順利的解離。對此優選的例子是保護基，如三苯甲基(Trt.)，叔丁醚(TBu)，叔丁酯(OtBu)，叔丁氧基(BOC)，2，2，5，7，8-五甲基苯並二氫吡喃-6-磺酸基(Pmc)或苯乙醯基。賴氨酸的殘基的或其它具有伯氨基側基的胺基酸衍生物的氨基側鏈，按改進方法(a)與待引入的基團共價結合。所提及的伯氨基側基位於肽的部位，在這個部位應該引入一個半抗原或一個標誌基團。除了20種天然的胺基酸之外肽還可以包含人工的胺基酸，如β-丙氨酸，γ-氨基丁酸，ε-氨基己酸，正亮氨酸或烏氨酸。這些人工的胺基酸是與天然胺基酸類似以被保護的形式用於合成。按本發明方法的改進方法(b)在合成結束後半抗原或標誌的引入是通過肽的保護基解離之後與所期望的活性基團轉化實現，這個活性基團與肽的自由的伯氨基反應。每一個自由伯氨基優選是加入1.5至4當量的活性酯。然後將反應產物提純，優選是通過高壓液體色譜法(HPLC)。兩個不同活性基團的引入是按照改進方法(b)通過應用兩個如上述的選擇性解離的保護基完成的。結合物的肽主鏈上佔有一個非免疫反應的胺基酸序列，亦即一個胺基酸序列，在結合物作為抗原用於預定的免疫學檢證方法時不影響試驗的進行。另一方面載體分子的主鏈也可以由核苷酸或肽的核酸組成。一個低(聚)核苷酸載體分子的合成可以在一個商業的DNA-合成設備內完成。半抗原分子和標誌基團或固體相結合基團優選是作為磷醯胺衍生物導入(Theisen等，Supra；應用生物系統(AppliedBiosystem)，應用者公報(UserBulletin)67，FAMAmidite，1992年5月)或/和追加地結合在自由反應的側基上。肽核酸基礎上的載體分子的合成是類似於固相肽合成，例如按照在WO92/20703中所說明的方法。半抗原分子或標誌基團或固體相結合基團的導入可以用有關的對於肽-和低(聚)核苷酸載體所說明的方法進行。本發明的目的並且也是應用結合物作為在免疫學方法中的抗原(當半抗原分子是一個免疫反應分子時)或者用於DNA-診斷(當半抗原是一個核酸時)。含有多於1個半抗原分子的結合物可以在免疫學檢證方法中作為多半抗原來使用。本發明的一個優選的實施形式是結合物在免疫學方法的應用，此方法是用於確定在一個試液中的抗體。優選是確定這些抗體，它們可以指明由微生物，如細菌，病毒或原蟲，所致的感染。特別優選的是確定針對病毒的抗體，例如針對愛滋病病毒(HIV)或肝炎病毒的抗體。試液最好是血清，特別優選的是人血清。此外優選的是本發明的結合物在免疫學方法中以橋試驗形式使用。因此本發明的目的是一個免疫確定試液中特異抗體的方法，其特徵在於，(a)試液與至少一個本發明的結合物一起孵育，該結合物是針對欲確定抗體的，(b)此抗體通過與肽結合可以證實。本發明的免疫學測定方法實質上可以根據任何已知的試驗方式進行，例如在一個均勻的有一個單一反應相的免疫測定法或在一個不均勻的有多於一個反應相的免疫測定法。優選應用一個不均勻的試驗形式，在這種方法中固體相的出現可以證實抗體的存在。這種試驗形式的一個實施形式是所謂的雙抗原-橋-試驗方案。在這裡試樣液與兩個針對欲檢測的抗體的抗原在反應固相存在的情況下孵育，其中第一個抗原攜帶一個標誌基團和第二個抗原結合在固體相上或者以一個可以結合在固體相的形式存在。第一個或/和第二個抗原是一個本發明的結合物。在試液中欲檢測的抗體必要時在固相由孵育液分出後通過測定在固相中或/和在液相中的標誌來證實。優選第一個抗原是一個用一種發光的金屬螯合物或一個螢光基團標誌的結合物。第二個抗原最好是用生物素標誌的並且是可以結合在固體相上的，這個固體相是用抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白塗層的。試驗的進行優選是包括試液與第一個標誌的抗原和固相側的第二個抗原混合，以得到一個由第一個抗原，抗體和固相結合的第二個抗原構成的標誌的、固定的配合體。橋試驗形式與其它抗體檢證試驗形式相比較不僅提高了敏感性，即它可以辨認所有免疫球蛋白的類別，如IgG，IgM，IgA和IgE，而且也提高了特異性，即它減少了非特異性反應。本發明的第二個優選的實施形式涉及將結合物應用在一個競爭免疫測定法。競爭免疫測定一般是用於檢證低分子量的分析物，並且原則上可以以兩個試驗形式進行，即「標記抗體」形式和「標記類似物」形式。在「標誌抗體」形式中含有欲檢測的分析物的試液是試液用一個可以結合在固體相上的半抗原(它與分析物免疫學競爭)和一個標誌的、針對半抗原和分析物的受體(例如抗體)進行標誌。在這種試驗形式結合在固體相的標誌與分析物濃度成反比。在「標誌類似物」的形式中是將含有欲檢測分析物的試液用一個標誌的、與分析物免疫競爭的半抗原和一個針對分析物和半抗原的受體(此受體可以結合在一個固體相上)一起孵育。結合在固體相上的標誌的半抗原的量是與自由的、待檢分析物的濃度成反比。因此本發明的目的是根據競爭免疫測定法的原則以「標誌類似物」的形式檢證在一個試液中分析物的方法，其特徵在於，(a)試液在反應固體相存在下與一個本發明的結合物(它含有一個標誌基團)和一個受體(它是結合在固體相上或者是可以結合在固體相上的並且它可以與分析物和結合物的半抗原成分發生一個特異的免疫學反應)一起孵育，(b)必要時固體相從孵育液分開和(c)在試液中分析物的存在或/和它的量通過測量在固體相或/和在孵育液中結合物的標誌部分來確定。優選應用一個含生物素的抗體或一個含生物素的抗體片段作為可以固定的受體和應用一個用抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白塗層的固體相作為反應固體相。本發明另外一個目的是根據競爭免疫測定法的原則以「標記抗體」的形式檢證試液中分析物的方法，其特徵在於，(a)試液在反應固體相存在下與一個本發明的結合物(它含有一個固體相結合基團)和一個受體(它攜帶一個標誌基團並且可以與分析物和結合物的半抗原部分發生一個特異的免疫學反應)一起孵育，(b)必要時固體相從孵育液分開和(c)在試液中分析物的存在或/和它的量是通過測量在固體相或/和在孵育液中受體的標誌部分來確定。優選地是應用一個含生物素的結合物和一個用抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白塗層的固體相，優選是應用一個抗體或一個抗體片段作為標誌受體。發光的金屬螯合物基團的檢證優選是通過電化學發光來實現，在此發光的物體在一個電極表面以電化學方式產生。螢光的檢證可以定性或/和定量進行。關於發光分析法進行的實例在EP-A-0580979，WO90/05301，WO90/11511中和在WO92/14138中可以找到。在那裡面公開的用於發光分析法的方法和設備在此引入。在電化學發光分析法中的固體相優選是由微粒組成，特別優選的是磁性的微粒，它具有一個復蓋層，它與固體相側的第二個抗原相互作用。微粒優選用抗生蛋白鏈菌素塗層。電化學發光-測量優選是在有金屬配合體的還原劑存在的情況下進行，例如胺。優選的是脂肪族胺，特別是伯，仲，叔的烷基胺，它們的烷基分別具有一至三個碳原子。特別優選的是三丙胺。然而胺也可以是一個芳香胺，如苯胺或雜環胺。另外必要時可以存在一個非離子的表面活性劑作為活化劑，例如乙氧基化的酚。這種物質例如在商業上以標誌為Triton×100或TritonN-401可以買到。另外發光的金屬螯合物的檢證也可以通過螢光實現，在此金屬螯合物通過合適的波長的光的照射來激發並測量由此產生的螢光射線。有關螢光-分析法實施的例子在EP-A-0178450和EP-A-0255534中可以找到。這些公開文章在此引入供參考。螢光基團也如發光金屬螯合物一樣屬於本發明結合物的優選的標誌基團，其檢證可以如前所述用己知的方法通過激發和測量螢光來實現。本發明的另一個目的是一種免疫學試劑，它至少含有一個本發明的標誌的或可以結合固體相的結合物。用於按照雙抗原-橋試驗原則進行免疫學測定特異抗體的試劑含有(a)一個標誌的按本發明的結合物或/和(b)另外一個本發明的結合物，後者結合在固體相或者是以一個可以結合在固體相的形式存在。根據競爭免疫測定法的原則用於確定一個分析物，更可取的是測定一個低分子量的分析物的試劑含有一個標誌的結合物(「標記類似物」形式)或含有一個可以結合固體相的結合物(「標記抗體」形式)，這個結合物與欲確定的分析物免疫學地競爭結合一個受體。優選地，用於競爭免疫測定法的試劑空間上從本發明的結合物分開，它含有或者一個標誌受體(「標記抗體」形式)或者一個可以結合固體相的受體(「標記類似物」形式)，該受體可以與欲確定的分析物和與本發明的結合物發生免疫學反應。通過以下實施例和附圖對本發明作了進一步說明，圖1表示一種金屬螯合物-賴氨酸-衍生物，圖2表示一種生物素-賴氨酸衍生物，圖3表示按本發明的結合物，圖4表示對比結合物。實施例1金屬螯合物-賴氨酸-衍生物的製備6mmol按照EP-A-0580979的釕配合物釕(二吡啶)2(二吡啶-CO-N-羥基琥珀醯亞胺酯)加在50ml二甲基甲醯胺中使之溶解並且向其中滴加α-Fmoc-賴氨酸溶液。蒸去溶劑後將殘留物溶於少量丙酮中，與300ml氯仿混合和加熱至煮沸短時間。將溶劑分開後得到如圖1所示的作為固體的化合物。實施例2金屬螯合物-標誌的和含生物素的肽的製備金屬螯合物-標誌肽或含生物類的肽是藉助於芴基甲基氧基碳基-(Fmoc)-固相肽合成在一個批料肽合成器中製備的，例如應用生物系統(AppliedBiosystems)A431或A433中所敘。對此應用表1中所示的胺基酸衍生物時每一種分別取4.0當量。金屬螯合物基團和生物素基團向肽序列的導入是通過金屬螯合物基團或生物素結合的胺基酸衍生物的直接引入來完成，例如在序列內通過用金屬螯合物-活性酯ε-衍生物的賴氨酸殘基(圖1)或通過用生物素衍生的賴氨酸殘基(圖2)或N-末端通過應用相應的α-衍生的胺基酸殘基。胺基酸或胺基酸衍生物溶解在N-甲基-吡咯烷酮中。肽是在400-500mg4-(2』，4』-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧基-樹脂(四面體簡訊(TetrahedronLetters)28(1987)，2107)用0.4-0.7mmol/g的負荷合成的(JACS95(1937)，1328)。結合反應是涉及Fmoc-胺基酸衍生物與4當量二環己基碳二亞胺和4當量N-羥基苯並三唑在二甲基甲醯胺反應介質中在20分鐘時間進行。在每一個合成步驟之後Fmoc-基團用20％的哌啶在二甲基甲醯胺中在20分鐘被解離。肽由載體的釋放和酸不穩定的保護基的解離是用20ml三氟醋酸，0.5ml乙二硫醇，1ml硫苯胺，1.5g酚和1ml水在室溫下40分鐘發生。反應溶液隨即與300ml冷卻的二異丙醚混合和在0℃保持40分鐘以使肽完全沉澱、將沉澱物過濾，用二異丙醚再洗滌，用少量50％的醋酸溶解和冰凍乾燥。得到的粗產物藉助於製劑高壓液體色譜法(HPLC)在Delta-PAKRPC18-材料上(柱50×300mm，100，15μ)通過一個相應的梯度(洗脫液A水，0.1％三氟醋酸，洗脫液B乙腈，0.1％三氟醋酸)在約120分鐘的時間內提純，洗提物的同一性用離子流-質譜分析測試。酸穩定的苯乙醯保護基的移去是用固定的或可溶的青黴素G-醯胺酶在具有有機溶劑成分的水溶液中在室溫下酶促發生的。實施例3與半抗原結合金屬螯合物標誌的或含生物素的肽在二甲基甲醯胺中溶解和對於肽的能夠結合的部位(例如賴氨酸的氨側基)總是稍稍過量(約30％)地加入激活了的半抗原(例如N-羥基琥珀醯亞胺酯)。在室溫下攪拌1小時，在高度真空中將溶劑除去並將肽通過製劑高壓液體色譜法提純。在應用圖I所示的金屬螯合物-賴氨酸-衍生物作為標誌基團和雌(甾)二醇作為半抗原時結合物是以下面的結構製備的IAcK(BPRu)UEUEUK(E2)UEUEUK(BPRu)UEUK(E2)-NH2IIAcK(BPRu)UEUEUK(E2)UEUEUK(BPRu)U-NH2結合物1在圖3示出，肽鏈的氨基末端是被乙醯基(AC)保護。羧基末端是作為醯胺基存在。金屬螯合物-和半抗原分子分別通過賴氨酸的ε-氨基側基結合在肽鏈。以類似的方法應用睪(甾)酮作為半抗原分子合成了具有結合物I的序列的結合物。制出的結合物的結構通過1H-NMR(500MHz)檢查和證實。實施例4血清中雌(甾)二醇的測定為了檢測人血清中雌(甾)二醇根據「標記類似物」形式進行了競爭的二步-測定法。為此90μl溶液1(0.69nmol/l本發明的結合物I(圖3)或1.68nmol/l對比結合物(圖4)，分別在50nmol/l4-嗎啉乙磺酸(MES)，pH6.8，0.1％牛血清白蛋白，0.1％Thesit，0.01甲基異噻唑，0.1％Oxypyrion，30ng/ml分離試劑二氫睪酮中)與50μl試樣(血清試樣或雌(甾)二醇標準)在一個聚苯乙烯容器中在37℃孵育10分鐘。隨後陸續加入90μl溶液2(0.7μg/ml或1.4μg生物素和多克隆的抗-雌(甾)二醇-免-抗原結合分段(Fab』)的結合物在50mmol/lMES-緩衝液pH6.0中)和50μl顆粒懸浮液(720μg/ml抗生蛋白鏈菌素塗層的磁性激粒，Fa.Dynal)。在37℃繼續孵育10分鐘後將150μl的混合物移到一個測量小室中。在那裡在電極表面發生顆粒微粒和在它上面附著的釕標誌物的磁性濃縮和在28℃檢查到一個電化學產生的化學發光信號。在表2顯示的試驗結果表明，本發明的結合物與對比結合物相比較在敏感性和檢證下限方面明顯改善了試驗效果。權利要求1.結合物，含有一個具有最多至100個單體單元的聚合載體，此載體含有結合在反應側基上的1-10個半抗原分子和1-10個標誌基團或固體相結合基團，其中單體單元是由胺基酸，核苷酸，核苷酸類似物和肽的核酸選出。2.按權利要求1的結合物，其特徵在於，聚合載體具有3-80個單體單元的長度。3.按權利要求1或2的結合物，其特徵在於，聚合載體具有5-60個單體單元的長度。4.按前述權利要求中之一的結合物，其特徵在於，它含有1-6個半抗原分子。5.按前述權利要求中之一的結合物，其特徵在於，它含有2-8個標誌基團或固體相結合基團。6.按前述權利要求中之一的結合物，其特徵在於，聚合載體含有一個由胺基酸構成的肽鏈。7.按權利要求1-5中之一的結合物，其特徵在於，聚合載體含有一個由核苷酸或/和核苷酸類似物構成的鏈。8.按權利要求1-5中之一的結合物，其特徵在於，聚合載體含有一個由肽核酸構成的鏈。9.按權利要求7或8的結合物，其特徵在於，聚合載體是作為雙股存在。10.按權利要求9的結合物，其特徵在於，雙股至少有一個鏈含有肽核酸。11.按前述權利要求中之一的結合物，其特徵在於，半抗原分子和標誌基團或固體相結合基團是通過反應的氨基側基或/和硫羥側基結合在聚合載體上。12.按前述權利要求中之一的結合物，其特徵在於，它含有的標誌基團是由發光的金屬螯合物或螢光基團選出的。13.按權利要求1至11中之一的結合物，其特徵在於，它含有的固體相結合基團是由生物素和生物素類似物選出的。14.按權利要求12的結合物，其特徵在於，標誌基團是發光的金屬螯合物並且聚合載體至少含有一個陽性的或/和陰性的電荷載體。15.按權利要求12的結合物，其特徵在於，標誌基團是螢光基團，聚合載體顯示一個基本上螺旋形的結構。16.按前述權利要求中之一的結合物，其特徵在於，半抗原是一個免疫學反應分子，其分子量≤2000Da。17.按權利要求16的結合物，其特徵在於，半抗原是由藥理學生物活性物質，激素，代謝產物，維他命，介質和神經遞質選出。18.按權利要求1至15中之一的結合物，其特徵在於，半抗原是由免疫學反應的肽抗原決定簇選出，它具有直至30個胺基酸的長度。19.按權利要求1至15中之一的結合物，其特徵在於，半抗原是由具有長度直至50個核苷酸的核酸選出。20.按權利要求1至15中之一的結合物，其特徵在於，半抗原是由具有長度至50個單體單元的肽核酸選出。21.按權利要求1至20中之一的結合物的製備方法，其特徵在於，聚合載體是由單體單元在固體相上合成，其中(a)當合成時單體衍生物引入載體的預定的部位，單體衍生物是與半抗原分子或/和標誌基團或固體相結合基團共價結合，或/和(b)合成後激活了的半抗原分子或/和標誌基團或固體相結合基團結合在載體的反應側基上。22.按權利要求21的方法，其特徵在於，肽載體是由胺基酸衍生物合成。23.按權利要求21或22的方法，其特徵在於，在其改進方法(a)中半抗原分子或/和標誌基團或固體相結合基團總是結合在單體衍生物的伯氨基或硫羥基上。24.按權利要求21或22的方法，其特徵在於，在其改進方法(b)中在載體的氨基側基或/和硫羥側基的結合是在用於固體相合成的單體衍生物的保護基解離之後發生。25.按權利要求21，22或24的方法，其特徵在於，在改進方法(b)中的合成之後半抗原分子和標誌基團或固體相結合基團結合在載體的伯氨基側基上，其中在載體的應該與半抗原分子發生結合的部位，是應用了一個具有用於氨基側基的第一個保護基的單體衍生物，和在載體的應該與標誌基團或固體相結合基團發生結合的部位是應用了一個具有用於氨基側基的第二個保護基的單體衍生物並且第一個和第二個保護基是這樣選出的，即選擇性的保護基解離是可能的。26.按權利要求25的方法，其特徵在於，第一個和第二個保護基是由酸不穩定的或酸穩定的保護基選出。27.按權利要求1至20中之一的結合物用於在免疫學方法中作為抗原或用於核酸診斷。28.按權利要求27的應用，其特徵在於，將含有多於1個半抗原分子的結合物作為多半抗原用於免疫檢證方法。29.在競爭免疫測定法中按權利要求27或28的應用。30.在檢證特異抗體的免疫測定法中按權利要求27或28的應用。31.根據競爭免疫測定法原則以「標記類似物」形式檢證試液中分析物的方法，其特徵在於，(a)試液在反應固體相存在下與一個按權利要求1至20中一項的結合物(它含有一個標誌基團)和一個受體(它是結合在固體相上或者是可以結合在固體相上並且它可以與分析物或者是結合物的半抗原成分發生免疫學反應)一起孵育。(b)必要時固體相從孵育液分開和(c)在試液中分析物的存在或/和它的量通過測量在固體相或/和在孵育液中結合物的標誌部分來確定。32.按權利要求31的方法，其特徵在於，是利用一個含生物素的抗體或一個含生物素的抗體片段作為受體，並且利用以抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白塗層的固體相。33.根據競爭免疫測定法原則以「標記抗體」的形式檢證試液中分析物的方法，其特徵在於，(a)試液在反應固體相存在下與一個按權利要求1至20中的一項的結合物(它含有一個固體相結合基團)和一個受體(它攜帶一個標誌基團並且可以與分析物和結合物的半抗原成分發生一個特異的免疫學反應)一起孵育。(b)必要時固體相從孵育液分開和(c)在試液中分析物的存在或/和它的量通過測量在固體相或/和在孵育液中受體的標誌部分來確定。34.按權利要求33的方法，其特徵在於，應用一個含生物素的結合物和一個用抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白塗層的固體相。35.檢證試液中特異抗體的方法，其特徵在於，(a)試液至少與一個按權利要求1至20中之一的結合物(這個結合物是針對欲確定的抗體的)一起孵育和(b)抗體通過與結合物結合而被證實。36.按權利要求35的方法，其特徵在於，(a)試液在反應固體相存在下和兩個針對欲確定的抗體的抗原一起孵育，其中第一個抗原攜帶一個標誌基團和第二個抗原結合在固體相上或者以可以結合在固體相上的形式存在，(b)必要時固體相從孵育液分開和(c)抗體的存在或/和它的量通過測定在固體相或/和在液體相中的標誌來證實，其中是用權利要求1至20中一項的結合物作為第一或/和第二個抗原。37.按權利要求36的方法，其特徵在於，應用一個用發光的金屬螯合物或者螢光基團標誌的結合物作為第一種抗原。38.按權利要求36或37的方法，其特徵在於，應用一個含生物素的結合物和一個用抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白塗層的固體相作為第二個抗原。全文摘要本發明涉及新的結合物，其製備方法以及該結合物作為抗原在免疫學的檢證法中或DNA-診斷中的應用。文檔編號G01N33/92GK1153555SQ95194279公開日1997年7月2日申請日期1995年7月24日優先權日1994年7月25日發明者H·P·約瑟爾,A·芬克,R·赫爾曼,E·霍斯,A·馬莎爾,C·塞德爾申請人:伯倫格·曼海姆有限公司