一種蝦致敏蛋白pena1提取純化方法
2023-06-16 16:46:46
一種蝦致敏蛋白pena1提取純化方法
【專利摘要】一種蝦致敏蛋白pena1提取純化方法，屬於蛋白分離純化方法的【技術領域】。其包括以下工藝步驟：1）製備蝦肉丙酮粉；2）抽提蝦過敏蛋白；3）硫酸銨分級沉澱；4）等電點沉澱；5）DEAE52陰離子交換層析；6）SephadexG-100凝膠層析；7）免疫親和層析。本發明首次採用致敏蛋白的表位抗體製備免疫親和柱來純化致敏蛋白，該方法對於表位序列已知的致敏蛋白的純化快速簡便，且可很好的保持致敏蛋白的免疫活性，對於致敏蛋白的純化具有重要的借鑑意義。
【專利說明】一種蝦致敏蛋白penal提取純化方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於蛋白分離純化方法的【技術領域】，具體涉及一種蝦致敏蛋白penal提取純化方法。
【背景技術】
[0002]根據蛋白質本身的物理化學特性的基礎上發展起來的蛋白分離純化方法主要有以下幾種:一是基於蛋白質分子大小的透析、超濾、分析篩層析、變性聚丙烯醯胺凝膠電泳等；二是根據蛋白質的帶點特性分離的等電點沉澱、離子交換層析、等點聚焦電泳等；三是根據蛋白質的溶解性分離的硫酸銨分級沉澱、有機溶劑分級等；四是根據蛋白質的變性與復性分離的，如採用尿素變性與復性方法從包涵體中純化原核表達蛋白；五是根據蛋白質的結晶特性分離，如從雞蛋中純化溶菌酶等；六是根據蛋白質表面的表面特性分離，蛋白質的吸附層析；七是根據蛋白質的分子形狀分離，如酶與底物、酶與抑制劑或激活劑、抗原與抗體、凝集素與葡萄糖等的分離常採用的親和層析，等等(汪世華，2008)。
[0003]近年具有高選擇性、高解析度及高容量的親和層析技術越來越受到人們的關注。親和層析具有純化過程簡單、快速且分離效率高等特點，尤其對於含量極少、穩定性較差的生物活性物質尤為有效。同時，免疫親和色譜因能將結構十分相近的目標物得以分離，也受到人們的親睞。免疫親和色譜利用抗原與抗體間高度的特異性及較高的親和力可將非常相近的目標物得以區分，並且具有從大量複雜蛋白基質中一步分離出極少量目標物的優點，是目前最具選擇性和最有效的純化方法之一(黃昕等，1999)。通常認為在進行免疫純化時需使用單克隆抗或多克隆抗體，最好是使用單抗，單抗特異性強，分離的目標抗原純度更高。但是由於單抗製備技術難，成本高，常規實驗室難以實現，這也限制了免疫親和色譜的應用。
[0004]目前，雖然免疫親和色`譜也已經在一些領域開始使用，但是用於致敏蛋白的純化方面卻報導極少，但是基於較成熟的色譜製備技術，開展免疫親和純化致敏蛋白也具有樂觀的前景。
【發明內容】
[0005]針對現有技術存在的問題，本發明的目的在於設計提供一種蝦致敏蛋白penal提取純化方法的技術方案。
[0006]所述的一種蝦致敏蛋白penal提取純化方法，其特徵在於包括以下工藝步驟:
1)製備蝦肉丙酮粉
2)抽提蝦過敏蛋白
3)硫酸銨分級沉澱
將步驟2)抽提得到的蝦蛋白粗提液調pH至7.4，緩慢加入硫酸銨至飽和度30%，低溫下緩慢攪拌，靜置，充分沉澱後離心，收集沉澱，得到蝦蛋白；
4)等電點沉澱將硫酸銨分級沉澱得到的蝦蛋白用IXPBS充分溶解，逐滴加入50%(v/v)硫酸溶液，直到PH至4.6，低溫下緩慢攪拌，靜置，充分沉澱後離心，收集沉澱，得到等電點沉澱後的蝦蛋白，將等電點沉澱後的蝦蛋白再用IX PBS充分溶解後，透析，冷凍乾燥後得蛋白凍乾粉；
5)DEAE52陰離子交換層析
用20 mmol/L pH 8.0的Tris-HCl充分平衡柱子，將步驟4)得到的蛋白凍乾粉用20mmol/L pH 8.0的Tris-HCl配製成5mg/ mL溶液,充分溶解後於離心,取上清上樣,上樣後換用 NaCl 濃度分別為 0,0.05,0.1,0.2,0.3,0.35,0.4,0.5,0.6,0.7,0.9 mol/L 梯度洗脫，洗脫流速設為I mL/min，自動收集器收集洗脫液，監測A280值，收集洗脫峰做SDS-PAGE，鑑定分離純化效果；
6)Sephadex G-100 凝膠層析
先後用IXPBS及含有0.5 mol/L NaCl的I XPBS平衡柱子，平橫流速設為I mL/min，將經步驟5)純化獲得的含目標蛋白的峰濃縮後，上樣，用含有0.5 mol/L NaCl的IXPBS的緩衝液洗脫，洗脫流速設為0.9 mL/min,自動收集器收集洗脫液，2 min/管，監測A280值，直到A280值接近O時，停止收集，收集洗脫峰做SDS-PAGE，得到目的蛋白的洗脫管；
7)免疫親和層析
penal多克隆抗體裝柱製作免疫親和柱層析柱,將目的蛋白用0.1 mol/L Tris緩衝液稀釋，過0.45m微孔濾膜後上樣，常溫孵育30 min後，用足量的0.1 mol/L Tris緩衝液做衝洗柱子，直到收集液中A280接近O時，換用pH 2.4,0.1 mol/L glycine鹽溶液做洗脫液洗柱，待檢測洗脫液A280接近O時停止洗脫，收集洗脫液得到蝦致敏蛋白penal。
[0007]所述的一種蝦致敏蛋白penal提取純化方法，其特徵在於所述的步驟I)中製備蝦肉丙酮粉具體包括:將去頭去殼去腸線的蝦肉於勻漿機中勻漿，加生理鹽水懸浮，再向懸浮液中加入4倍體積的冷丙酮,充分混勻,(TC不斷攪拌30 min後8000 r/min離心15 min,回收沉澱物，重新用冷丙酮懸浮並混勻，重複上述過程，將沉澱物轉移至乾淨濾紙上，於通風櫥中分散，乾燥後得蝦肉丙酮粉。
[0008]所述的一種蝦致敏蛋白penal提取純化方法，其特徵在於所述的步驟2)中抽提蝦過敏蛋白具體包括:取步驟I)得到的蝦肉丙酮粉按1:10比例加入抽提液，所述的抽提液為pH 7.4、含5 mmol/L 二硫蘇糖醇的I mol/L，4°C低溫攪拌過夜，4°C，8000 r/min離心15min後，收集上清液，得到蝦蛋白粗提液。
[0009]所述的一種蝦致敏蛋白penal提取純化方法，其特徵在於所述的步驟3)中4°C低溫下緩慢攪拌1.5 h，靜置4 h，充分沉澱後於4°C，9000 r/min離心30 min後，收集沉澱。
[0010]所述的一種蝦致敏蛋白penal提取純化方法，其特徵在於所述的步驟4)中4°C低溫下緩慢攪拌I h，靜置4 h，充分沉澱後於4°C，9000 r/min離心30 min後，收集沉澱。
[0011]本發明在充分總結前人研究的基礎上，以現代生物技術的發展為輔助，探索一種利用致敏蛋白表位抗體親和純化相應的致敏蛋白，一方面可以免去純化目的蛋白所需的繁瑣的操作，另一方面也是對新方法、新技術的探索。
[0012]本發明首次採用致敏蛋白的表位抗體製備免疫親和柱來純化致敏蛋白，該方法對於表位序列已知的致敏蛋白的純化快速簡便，且可很好的保持致敏蛋白的免疫活性，對於致敏蛋白的純化具有重要的借鑑意義。【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1為蛋白(NH4)2SO4結合pi沉澱的SDS-PAGE分析圖，圖中:M蛋白Marker，1-蛋白抽提液，2、4、6、8分別是飽和度為30%、40%、50%、60%的(NH4)2SO4溶液沉澱後的蛋白溶液，
3、5、7、9分別經30%、40%、50%、60%的(NH4)2SO4沉澱後又經pi沉澱後的蛋白溶液，IOUl分別是經30%、40%(NH4)2SO4及pi沉澱後的上清液；
圖2為蝦致敏蛋白等電點沉澱後的陰離子交換層析圖；
圖3為SDS-PAGE分析蝦致敏蛋白經陰離子交換層析得到的蛋白峰圖；
圖4為蝦致敏蛋白陰離子交換P3峰的凝膠層析圖；
圖5為SDS-PAGE分析蝦致敏蛋白經凝膠層析得到的蛋白Pl峰圖；
圖6為Western Blot分析蟲下致敏蛋白經凝膠層析得到的蛋白Pl峰圖；
圖7為間接競爭標準曲線圖；
圖8為洗脫液洗脫效果圖；
圖9為洗脫峰的電泳圖，圖中M:蛋白分子量marker，1:上樣液，2、3洗脫峰；
圖10為洗脫峰的免疫印記圖，圖中Μ:蛋白分子量marker，1:陰性對照，2洗脫峰； 圖11為免疫親和柱的柱容量。
【具體實施方式】
[0014]以下結合實施例來進一步說明`本發明。
[0015]實施例1:
一、試劑的配置
1、十二烷基硫酸鈉(10% SDS，W/V):將10 g SDS加入80 mL蒸餾水中，充分溶解後，定容至100 mL，常溫下貯存。
[0016]2、過硫酸銨(10% AP，W/V):將I g AP用蒸餾水定容至10 mL，4°C儲存，或分裝後-20°C冷凍保存。
[0017]3、Tris-HCl 緩衝液(I mol/L, pH 6.8):將 12.1 g Tris 加入 60 mL 蒸餾水中，充分溶解後，緩慢加濃鹽酸調PH至6.8，待溶液冷卻至室溫後，蒸餾水定容至100 mL，4°C儲存。
[0018]4、Tris-HCl 緩衝液(1.5 mol/L,pH 8.8):將 18.15 g Tris 加入 60 mL 蒸餾水中，充分溶解後，緩慢加濃鹽酸調PH至8.8，待溶液冷卻至室溫後，蒸餾水定容至100 mL,4°C儲存。
[0019]5、凝膠貯液(30% Acr-0.8% Bis):將29.2 g丙烯醯胺(Acr)、0.8 g甲叉雙丙烯醯胺(Bis)用80 mL蒸餾水充分溶解後，定容至100 mL, 0.45 Mm微孔濾膜過濾，濾液儲存於棕色瓶中，4°C存放。
[0020]6> 10X 電極緩衝液(Tris-Glycine, pH 8.3):將 188 g Glycine、30.2 g Tris、10.0 g SDS，加入800 mL蒸餾水中，充分溶解後，定容至1000 mL，常溫保存，使用時配置成為IX電極緩衝液，調PH至8.3。
[0021]7、2X 蛋白質樣品緩衝液(Loading Buffer):取0.24 mL Tris-HCl 緩衝液(I mol/L，pH 6.8),1 mL 50%甘油、0.8 mL 10% SDS,40 mg 溴酚藍，7.76 mL 蒸餾水，0.2 mL β-疏
基乙醇，充分混合後，4 V存放。[0022]8、蛋白凝膠染色液(R-250考馬斯亮藍):將I g考馬斯亮藍R-250，置於I L燒杯中，向燒杯中加入250 mL的異丙醇,攪拌使溶解,再加入100 mL冰乙酸,650 mL蒸懼水,充分攪拌，用濾紙除去不溶性顆粒後，常溫保存。
[0023]9、凝膠脫色液:將50 mL乙醇、100 mL冰乙酸、850 mL蒸餾水，混勻後備用。
[0024]免疫印跡試劑的配製
1、10X 轉膜緩衝液(pH 7.6):將 29 g Tris-Base、144 g Glycine，加入 800 mL 蒸餾水中，充分溶解後4°C保存。使用時取上述溶液100 mL，再加入500 mL蒸餾水，200 mL甲醇，混勻後，逐滴加入濃鹽酸調pH至7.6，後定容到1000 mL備用。
[0025]2、10 X TBS:將 24.2 g Tris-Base, 85 g NaCl，加入800 mL蒸餾水中，充分溶解後，用適量蒸餾水溶解，用濃鹽酸調節pH至7.6，定容至1000 mL。
[0026]3、洗膜緩衝液(TBS/T):量取100 mLlOXTBS加入I mL吐溫-20，定容至1000 mL。
[0027]4、封閉緩衝液:將15 mL 10XTBS.5 g脫脂奶粉、50 μ L吐溫-20，加入80 mL蒸餾水充分混勻，定容至100 mL，4°C保存。
[0028]5、10X麗春紅儲液:將2 g麗春紅、30 g三氯乙酸,30 g磺基水楊酸,溶於蒸懼水解並定容至100 mL。使用時蒸餾水稀釋成IX使用液。
[0029]6、Tris_HCl (0.1 mol/L, pH 7.5):將 21 g Tris-Base，溶於 80 mL 蒸懼水中，用濃鹽酸調PH至7.5，後定容至100 mL。
[0030]7、DAB 母液:將` 0.1 g DAB 溶於 20 mL Tris-HCl (0.1 mol/L, pH 7.5)中，充分
混勻，4 °C保存。
[0031]8、DAB 顯色液:取 I mL DAB 母液，5 mL Tris-HCK0.1 mol/L, pH 7.5),5 μ L30%的H202，加4 mL蒸餾水混合均勻，現配現用。
[0032]CNBr-Activated Sepharose 4B偶聯抗體所需試劑的配製
1、偶聯緩衝液(0.2 mol/L NaHC03+0.5 mol/L NaCl，pH 8.3):稱取 16.8 g NaHC03,29.22 g NaCl加800 mL蒸餾水充分溶解後，I mol/LHCl調pH至8.3，後定容至1000 mL。
[0033]2、封閉緩衝液(0.2 mol/L甘氨酸):稱取15.014 g Glycine，加800 mL蒸餾水充分溶解後，6 mol/L NaOH調pH至8.0,後定容至1000 mL。
[0034]3、衝洗緩衝液(0.1 mol/L NaAC+0.5 mol/L NaCl, pH 4.0):稱取 13.61 gNaAC 3H20，29.22 g NaCl，加800 mL蒸餾水充分溶解後，濃鹽酸調pH 4.0，後定容至1000mL。
[0035]4、Tris-HCl (0.1 mol/L, pH 8.0):稱取 12.11 g Tris-Base,29.22 g NaCl，加800 mL蒸懼水充分溶解後,6 mol/L NaOH調pH至8.0,後定容至1000 mL。
[0036]二、實驗方法:蝦致敏蛋白Pena I提取、純化及鑑定
1、製備蝦肉丙酮粉
將去頭去殼去腸線的蝦肉於勻漿機中勻漿，I g組織加1.5 mL生理鹽水懸浮。然後向懸浮液中加入4倍體積的冷丙酮,充分混勻,(TC不斷攪拌30 min後8000 r/min離心15 min,回收沉澱物，重新用冷丙酮懸浮並混勻，重複上述過程。將沉澱物轉移至乾淨濾紙上，於通風櫥中分散，乾燥後得丙酮粉。若遇較大塊狀物，低溫下研磨成粉。
[0037]2、抽提蝦過敏蛋白
取蝦丙酮粉按1:10比例加入抽提液(I mol/L KC1，其中含5 mmol/L 二硫蘇糖醇，pH7.4),低溫攪拌過夜。4°C,8000 r/min離心15 min後,收集上清液,得到奸蛋白粗提液。
[0038]3、硫酸銨((NH4) 2S04)分級沉澱
將蝦蛋白粗提液調PH至7.4，緩慢加入(NH4)2SO4至以下飽和度:30%、40%、50%、60%。4°C低溫下緩慢攪拌1.5 h，後靜置4 h，充分沉澱後於4 °C，9000 r/min離心30 min後，收集沉澱，得到對應飽和度下的蝦蛋白，SDS-PAGE鑑定分離純化效果。
[0039]SDS-PAGE 分析
(1)凝膠的配製
凝膠的配置見表1，分離膠首先抽氣30min，抽氣完畢，加入10% AP和TEMED，配好後迅速混勻，灌膠。加入少量蒸餾水，待出現明顯界面時傾去蒸餾水，加入濃縮膠，並插入梳子。
[0040]表1 SDS-PAGE電泳凝膠的配方
【權利要求】
1.一種蝦致敏蛋白penal提取純化方法，其特徵在於包括以下工藝步驟: 1)製備蝦肉丙酮粉； 2)抽提蝦過敏蛋白； 3)硫酸銨分級沉澱 將步驟2)抽提得到的蝦蛋白粗提液調pH至7.4，緩慢加入硫酸銨至飽和度30%，低溫下緩慢攪拌，靜置，充分沉澱後離心，收集沉澱，得到蝦蛋白； 4)等電點沉澱 將硫酸銨分級沉澱得到的蝦蛋白用IXPBS充分溶解，逐滴加入50%(v/v)硫酸溶液，直到PH至4.6，低溫下緩慢攪拌，靜置，充分沉澱後離心，收集沉澱，得到等電點沉澱後的蝦蛋白，將等電點沉澱後的蝦蛋白再用IX PBS充分溶解後，透析，冷凍乾燥後得蛋白凍乾粉； 5)DEAE52陰離子交換層析 用20 mmol/L pH 8.0的Tris-HCl充分平衡柱子，將步驟4)得到的蛋白凍乾粉用20mmol/L pH 8.0的Tris-HCl配製成5mg/ mL溶液，充分溶解後離心，取上清上樣，上樣後換用 NaCl 濃度分別為 0,0.05,0.1,0.2,0.3,0.35,0.4,0.5,0.6,0.7,0.9 mol/L梯度洗脫，洗脫流速設為I mL/min，自動收集器收集洗脫液，監測A280值，收集洗脫峰做SDS-PAGE，鑑定分離純化效果； 6)Sephadex G-100 凝膠層析 先後用IXPBS及含有0.5 mol/L NaCl的I XPBS平衡柱子，平橫流速設為I mL/min，將經步驟5)純化獲得的含目標蛋白的峰濃縮後，上樣，用含有0.5 mol/L NaCl的IXPBS的緩衝液洗脫，洗脫流速設為0.9 mL/min,自動收集器收集洗脫液，2 min/管，監測A280值，直到A280值接近O時，停止收集，收集洗脫峰做SDS-PAGE，得到目的蛋白的洗脫管； 7)免疫親和層析 penal多克隆抗體裝柱製作免疫親和柱層析柱,將目的蛋白用0.1 mol/L Tris緩衝液稀釋，過0.45m微孔濾膜後上樣，常溫孵育30 min後，用足量的0.1 mol/L Tris緩衝液做衝洗柱子，直到收集液中A280接近O時，換用pH 2.4,0.1 mol/L glycine鹽溶液做洗脫液洗柱，待檢測洗脫液A280接近O時停止洗脫，收集洗脫液得到蝦致敏蛋白penal。
2.如權利要求1所述的一種蝦致敏蛋白penal提取純化方法，其特徵在於所述的步驟O中製備蝦肉丙酮粉具體包括:將去頭去殼去腸線的蝦肉於勻漿機中勻漿，加生理鹽水懸浮，再向懸浮液中加入4倍體積的冷丙酮,充分混勻,(TC不斷攪拌30 min後8000 r/min離心15 min，回收沉澱物，重新用冷丙酮懸浮並混勻，重複上述過程，將沉澱物轉移至乾淨濾紙上，於通風櫥中分散，乾燥後得蝦肉丙酮粉。
3.如權利要求1所述的一種蝦致敏蛋白penal提取純化方法，其特徵在於所述的步驟2)中抽提蝦過敏蛋白具體包括:取步驟I)得到的蝦肉丙酮粉按1:10比例加入抽提液，所述的抽提液為pH 7.4、含5 mmol/L 二硫蘇糖醇的I mol/L，4°C低溫攪拌過夜，4°C，8000 r/min離心15 min後,收集上清液,得到奸蛋白粗提液。
4.如權利要求1所述的一種蝦致敏蛋白penal提取純化方法，其特徵在於所述的步驟3)中4°C低溫下緩慢攪拌1.5h，靜置4 h，充分沉澱後於4°C，9000 r/min離心30 min後，收集沉澱。
5.如權利要求1所述的一種蝦致敏蛋白penal提取純化方法，其特徵在於所述的步驟4)中4°C低溫下緩慢攪拌I h，靜置4 h，充分沉澱後於4 °C，9000 r/min離心30 min後，收集沉 澱。
【文檔編號】C07K14/435GK103755794SQ201410004632
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月6日 優先權日:2014年1月6日
【發明者】張弛, 潘家榮, 趙潔, 張勇勇, 陸高翔 申請人:中國計量學院