一種間充質幹細胞細胞因子的製備方法和應用與流程
2023-06-17 01:40:56 2
本發明屬於間充質幹細胞細胞因子技術領域，具體涉及一種間充質幹細胞細胞因子的製備方法和應用。
背景技術：
間充質幹細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有自我更新能力的多潛能幹細胞，廣泛存在於多種成體組織或圍產期組織中，如骨髓、脂肪、牙髓、胎盤、臍帶等。間充質幹細胞作為藥物製劑應用於臨床治療，主要依賴其免疫調節能力和組織再生能力，但這兩種能力主要歸功於間充質幹細胞中強大的細胞因子的分泌能力。雖然間充質幹細胞具有較好的多向分化潛能，能夠在特定誘導條件下分化形成脂肪、軟骨、骨、神經等多種組織來源的細胞，但是，研究表明細胞因子等的分泌優勢是間充質幹細胞進行組織再生、修復以及疤痕修復的主要生物學機制。這些因子通過自分泌機制以調控自身的增殖、分化，通過旁分泌機制以調節鄰近細胞的增殖、分化，通過內分泌機制以實現有機體整體水平的調控。
間充質幹細胞能夠合成並分泌多種細胞因子，如表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)、鹼性成纖維細胞生長因子(Basic fibroblast growth factor，FGF)、血小板生長因子(Platelet growth factor，PDGF)、血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、轉化生長因子(Transforming growth factor beta，TGF-β)、肝細胞生長因子(Hepatocyte growth factor，HGF)、白介素6(Interleukin 6，IL-6)等。這些因子具有免疫調節、抗凋亡、促進血管生產、細胞遷移、細胞增殖等作用，是實現組織修復、組織再生必不可少的關鍵組成部分。
然而，普遍的觀點認為組織再生、疤痕修復是由多種細胞因子協同調控實現的，並且多種細胞因子的作用效果要優於單一細胞因子的作用效果。但細胞內以及細胞所處的微環境是由多種細胞因子按照不同比例組成的，而人工方法配製而成的細胞因子組合物難以真正模擬細胞微環境所含的細胞因子種類及配比，在使用過程中會出現不良反應。
技術實現要素：
針對現有技術中存在的上述不足，本發明提供一種間充質幹細胞細胞因子的製備方法和應用，可有效解決現有技術中人工方法配製的細胞因子組合物無法模擬細胞微環境所含的細胞因子種類及配比，使用時出現不良反應的問題。
為實現上述目的，本發明解決其技術問題所採用的技術方案是：
一種間充質幹細胞細胞因子的製備方法，包括以下步驟：
(1)通過組織貼壁或酶消化法提取間充質幹細胞，然後對提取的間充質幹細胞進行無菌檢測、支原體檢測、流式檢測和核型等指標檢測；
(2)將檢測合格的間充質幹細胞接種於培養容器中，加入培養基，然後置於37℃、5％CO2條件下進行培養；其中培養基成分：體積濃度為2％的GlutaMAXTM-I和體積濃度為10-20％的FBS，其餘為DMEM；
(3)待細胞融合度達到80-90％時，將培養容器中的氧濃度調整至0.5-2％(v/v)，然後繼續培養細胞過夜；
(4)將步驟(3)中培養好的細胞用0.25％胰酶-EDTA溶液消化2-3min；
(5)消化完畢後，將其置於20℃，1000-2000r/min條件下離心2-3min，然後去掉上清液，用0.9％生理鹽水清洗沉澱2-3次；
(6)用0.9％生理鹽水調整步驟(5)中細胞濃度至1-10×107個細胞/mL，然後再加入1-3mg/mL的EDTA和5-10mg/mL的Vc，混勻；
(7)將步驟(6)所得細胞分裝入凍存管中，置於氣相液氮中凍存10-30min，然後放置於37℃水浴鍋中復甦5-10min，再置於氣相液氮中凍存10-30min，放置於37℃水浴鍋中復甦5-10min，此操作反覆進行3-5次；
(8)將步驟(7)所得細胞置於20℃，4000-10000r/min條件下離心5-10min，然後用0.22μm過濾器過濾，得間充質幹細胞細胞因子。
進一步地，步驟(2)中所接種的間充質幹細胞濃度為1-2×106個細胞/cm2。
進一步地，步驟(3)培養容器中氧濃度為1％。
進一步地，步驟(6)中所添加的EDTA濃度為3mg/mL。
進一步地，步驟(6)中所添加的Vc濃度為10mg/mL。
上述製備的間充質幹細胞細胞因子在製備細胞因子製劑和化妝品中的應用。
本發明提供的一種間充質幹細胞細胞因子的製備方法和應用，具有以下有益效果：
(1)本發明通過簡單的低氧環境誘導培養即可提高間充質幹細胞因子含量，同時加入EDTA能夠很好的抑制金屬蛋白酶對細胞因子的降解作用，加入Vc能夠很好的起到抗氧化作用，0.9％生理鹽水能夠有效去除細胞破碎後的核酸溶出物，因此可以大大降低細胞因子的排異反應。
(2)該製備方法簡單，製備得到的間充質幹細胞細胞因子製劑能夠很好的模擬幹細胞微環境所需的細胞因子種類和比例，在使用過程中不會出現不良反應。
附圖說明
圖1為間充質幹細胞表面標誌物檢測結果圖。
圖2為不同凍融次數的細胞因子含量結果圖。
圖3為間充質幹細胞細胞因子保存有效期實驗結果圖。
具體實施方式
實施例1間充質幹細胞體外擴增及鑑定
將融合度為90％的P5代胎盤間充質幹細胞消化(組織貼壁法或酶消化法)後，計數，並配製成密度為1×106個細胞/mL的細胞懸液，接著用100μm細胞篩網過濾，然後分別取1mL濾液，向濾液中分別加入10μL含螢光標記的細胞表面標誌物抗體，置於4℃，避光條件下孵育20min。
孵育完成後，用0.9％生理鹽水(4℃)清洗一次，於1200r/min離心5min，棄上清，向沉澱中加入250μL 0.9％的生理鹽水混勻，然後再加入250μL 1％的多聚甲醛固定，然後採用Beckman公司的流式細胞分析儀進行檢測分析，檢測結果見圖1。
所使用的抗體有CD11b-FITC、CD19-ECD、CD29-FITC、CD34-PE、CD44-FITC、CD45-PC7、CD73-PE、CD90-FITC、CD105-PE、HLA-DR-PC7，這些抗體均購自Beckman公司。
如圖1所示，經流式檢測分析發現胎盤間充質幹細胞幾乎不表達造血細胞表面標誌如CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR；表達間充質幹細胞陽性標誌物如CD29、CD44、CD73、CD90、CD105。
實施例2臨床級間充質幹細胞細胞因子的製備
將間充質幹細胞接種於培養容器中，加入培養基，然後置於37℃、5％CO2條件下進行傳代培養；其中培養基成分：體積濃度為20％的FBS和體積濃度為2％的GlutaMAXTM-I，其餘為DMEM；待P5代間充質幹細胞融合度達到80-90％後，將培養容器中的氧濃度調整至1％(v/v)，然後繼續培養細胞過夜；
將過夜後的細胞用0.25％胰酶-EDTA溶液消化2-3min，然後置於20℃，2000r/min條件下離心3min，去掉上清液，用0.9％生理鹽水清洗沉澱2-3次後收集細胞，並檢測細胞活率，對其進行細胞計數。
用0.9％生理鹽水調整細胞濃度至1×108個細胞/mL，然後再加入3mg/mL的EDTA和10mg/mL的Vc，混勻，接著將其轉移至5mL凍存管中，放置於氣相液氮中凍存10min，再置於37℃恆溫水浴鍋中復甦5min，最後再凍存、復甦，此操作分別反覆3次、5次和10次。
將凍存、復甦後的細胞裂解液轉移至50mL離心管中，於20℃，5000r/min條件下離心10min，然後用0.22μm過濾器過濾裂解液上清，最後加入0.9％生理鹽水、3mg/mL的EDTA和10mg/mL的Vc，調整上清至30mL，製得間充質幹細胞細胞因子。
取樣抽檢，檢測不同凍融次數的細胞因子含量，採用ELISA方法，按照說明書對各類細胞因子(EGF、FGF、IGF-1、HGF、PDGF-AA、VEGF)進行檢測，試劑盒均購自R&D公司，檢測結果見圖2。
由圖2可知，胎盤間充質幹細胞分泌較多的HGF(肝細胞因子)，分泌少量PDGF-AA(血小板生長因子AA)、bFGF(鹼性成纖維細胞生長因子)、VEGF(血管內皮生長因子)，分泌較少IGF-1(胰島素樣生長因子)和EGF(表皮生長因子)。以3次凍融復甦為對照，P﹥0.05，說明多次反覆凍融對細胞因子的提取量沒有影響。
實施例3間充質幹細胞細胞因子的保存有效期實驗
將製備的間充質幹細胞細胞因子放置於-80℃保存1個月、3個月、6個月、12個月後，以新鮮製備的間充質幹細胞細胞因子為對照組，採用ELISA試劑盒，按照說明書對各類細胞因子(EGF、FGF、IGF-1、HGF、PDGF-AA、VEGF)進行檢測，試劑盒均購自R&D公司，實驗結果見圖3。
由圖3可知，以凍存3個月的細胞因子含量為參照，在凍存6個月以內細胞因子的減少量不明顯(P﹥0.05)，當凍存時間增加到12個月後，細胞因子的含量有少量損失(P＜0.01)，因此幹細胞因子製劑的有效期建議為12個月。
本發明製備的間充質幹細胞細胞因子可用於製備間充質幹細胞細胞因子製劑、化妝品等。
一種間充質幹細胞因子細胞因子製劑每30mL含有如下組分：細胞因子半成品(本發明製備的間充質幹細胞細胞因子)10mL、維生素C 0.1-0.2g、維生素E0.1-0.2g、生理鹽水20mL，並轉移至50mL細胞凍存袋中。將成品進行無菌檢測、支原體檢測，合格後放置於氣相液氮罐(平均溫度為-180℃)中保存，有效期為1年。
一種間充質幹細胞因子化妝品每100mL含有如下組分：細胞因子半成品20-40mL、維生素B1 0.3-0.6g、維生素B2 0.1-0.3g、維生素C 0.3-0.6g、維生素E 0.3-0.6g、膠原蛋白5-10ml、透明質酸(相對分子量為1000000～2200000)0.1-0.5g、白蜂蠟5-10g、鯨蠟15-20g、去離子水60-80ml。