能抑制口蹄疫病毒的shRNA轉基因重組質粒及其應用的製作方法

2023-06-16 21:23:46

專利名稱：能抑制口蹄疫病毒的shRNA轉基因重組質粒及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於遺傳工程技術領域，具體涉及一種應用RNAi技術設計的抗口蹄疫病毒質粒載體，並用於哺乳動物轉基因抗病育種。
背景技術：
家畜口蹄疫(Foot and mouth disease, FMD)是當今世界上最為嚴重的家畜傳染病，主要危害豬、牛、羊等偶蹄類動物。世界動物衛生組織(OIE)將口蹄疫列為A類傳染病之首。多年來，口蹄疫在世界範圍內大規模爆發和流行，給畜牧業造成巨大經濟損失。根據免疫原性，口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus, FMDV)有 A、0、C、SAT I、SAT II、 SAT III及Asia I等共7個血清型。口蹄疫病毒各型之間無交叉免疫反應，一種類型的疫苗不能保護家畜免受另一種類型病毒的感染，已經發現在許多地區會有一個以上病毒流行。如果用一個型的疫苗免疫家畜，有很大的盲目性。為了克服這種免疫的局限性，研究具有廣譜抗口蹄疫病毒作用的製劑有重要的實踐意義。另外，由於FMDV的具有快速傳染性和強致病性的特點，給使用傳統的疫苗快速控制口蹄疫的流行帶來了障礙。RNAi技術是科學研究領域近年來取得的重大成就之一，它最大的優點在於具有高度的有效性和特異性並且具有快速的防禦與治療效果。它的作用在基因功能研究領域和各種疾病的治療領域尤其是病毒性疾病的治療領域已顯現出不可估量的價值，例如在抗愛滋病毒(HIV)，C型肝炎病毒(HCV)，B型肝炎病毒(HBV)和脊髓灰白質炎病毒(Poliovirus)等病毒病的研究中都發現，RNA幹擾對於抑制這些病毒的複製具有較好的效果，可能為這類病毒病的治療創立新的、更有效的途徑。但是在自然界中，各種病毒都會存在不同突變株，口蹄疫病毒就有七種血清型和很多的變異株，這給口蹄疫病毒病的防治工作帶來了巨大的困難。另一方面，RNAi有效作用時間較短的特點也給其使用帶來一定的問題。在目前已有的科研報導中，RNAi必須在實際病毒感染前1-2天內接種動物才能獲得較為理想的抗病毒效果。此外，siRNA/shRNA能否到達口蹄疫病毒在動物體內感染與複製的部位就成為RNAi是否能夠高效的幹擾靶基因進而抑制病毒的重要問題。所以本發明選取了 FMDV基因組中高度保守的區段作為靶序列，構建能同時表達兩種shRNA的轉基因質粒載體。再用轉基因技術將上述質粒轉入細胞或小鼠，使可傳代細胞和轉基因傳代動物產生抗FMDV感染能力。本發明為RNAi技術用於豬、牛、羊等家畜的抗病育種，培養轉基因的抗口蹄疫病毒感染的家畜提供新的技術路線。

發明內容
本發明目的是提供一種能高效的抗口蹄疫病毒重組質粒，該重組質粒能通過不同的方法抑制同一型中不同毒株或者不同型的口蹄疫病毒在動物細胞和個體中的複製與感染。本發明的另一目的是提供該抗口蹄疫病毒重組質粒在轉基因育種中的應用。本發明提出的抗口蹄疫病毒重組質粒，記為PB-EN3D2B，該質粒含有兩個shRNA表達基因，能同時編碼兩種分別靶向口蹄疫病毒基因組3D RNA聚合酶和2B非結構蛋白保守區域的特異shRNA ;其中，所述兩個shRNA表達基因中一個能表達抗口蹄疫病毒的shRNA，該shRNA靶向口蹄疫病毒基因組中3D基因；所述兩個shRNA表達基因中一個能表達抗口蹄疫病毒的shRNA，該shRNA靶向口蹄疫病毒基因組中2B基因；兩個shRNA表達基因呈串聯狀態。本發明提供的的抗口蹄疫病毒重組質粒，其中，在兩個shRNA表達基因之間還可插入如報告基因之類的其他基因，得到具有同樣抗口蹄疫病毒功能的衍生重組質粒。本發明中，所選擇的保守區基因3D和2B來自任何一型的口蹄疫病毒，如0型、A型、亞洲I型等。本發明提供的PB-EN3D2B，其表達的shRNA序列是以各個血清型、各個亞型、不同毒株的基因組序列為基準，選取FMDV中特異的3D和2B基因為幹擾靶點設計得到的。將該重組質粒通過PB轉座子或者直接轉染的辦法整合入組織培養細胞或動物的基因組，獲得單克隆轉基因細胞系或者轉基因動物家系。特定的轉基因細胞系或轉基因動物家系可以有 效地抵抗不同型FMDV的複製與感染，如抵抗0型、A型、亞洲I型等複製與感染。本發明提出的重組質粒中，其表達的ShRNA幹擾靶點分別為FMDV的3D和2B基因的保守區域(如圖1)，設計時的參考序列是口蹄疫病毒0型HNK/2002毒株(GenBank登錄號 AY317098)，口蹄疫病毒 Asia I 型 Jiangsu 毒株(GenBank 登錄號 EF149009)。靶向 3D的shRNA長56 nt，對應口蹄疫病毒0型HNK/2002毒株3D基因的1225-1280位鹼基，其正義鏈序列為SEQ. ID. NOl。靶向2B的shRNA長25 nt，對應口蹄疫病毒0型HNK/2002毒株2AB基因的57-81位鹼基，其正義鏈序列為SEQ. ID. N02。3D基因編碼FMDV的RNA依賴性RNA聚合酶POL，FMDV基因組本身的複製必須由該聚合酶啟動。2B基因其生物學功能尚未被完全闡明，但有證據證明，該蛋白與FMDV轉錄產生的大融合蛋白的剪切，以及病毒粒子的裝配密切相關。選用3D和2B基因作為shRNA幹擾靶點的另一出發點是，根據基因資料庫分析和實際測試毒株序列發現，FMDV的3D和2B基因在不同型和不同毒株中具有很高的序列保守性，而RNAi的幹擾效應主要取決於其與靶基因序列上的匹配程度。因此，以這兩個基因為依據設計的shRNA具有對不同毒株交叉抑制的潛力。本發明中，靶向3D和2B基因的shRNA序列因不同型口蹄疫病毒或同型中不同毒株的結構特徵，可以根據病毒基因中靶點序列，前後浮動適當個數(一般為6個以內)的核苷酸殘基，而不影響shRNA對病毒的抑制效應。同時,設計shRNA的序列也可根據不同型口蹄疫病毒或某型中不同毒株的基因變異做相應的改變，這樣可以保證shRNA對病毒株有最高效的抑制效果。上述所選定的靶序列中任何連續的19 - 2Ibp長度的RNA序列都可製備為siRNA或shRNA，均有幹擾FMDV複製和感染的效果。本發明採取了把兩個幹擾shRNA基因串聯構建到一個質粒載體上的策略(如圖2)，當一個shRNA失效時，另一個shRNA可以起到補償作用。從理論上說，靶向3D和2B這兩個在FMDV複製周期中起重要作用的雙shRNA將誘導產生更強、更廣譜的抑制FMDV複製的作用。本發明提出的兩種shRNA分別由RNA聚合酶III類啟動子(pol III)小鼠U6啟動子和人類Hl啟動子在真核細胞中穩定持續表達。前者為核糖體RNA啟動子，後者為組蛋白RNA啟動子，兩者均具有精確的鹼基啟動位點和終止信號，可以保證shRNA最高效地被啟動轉錄。同時，在真核細胞中調控這兩類啟動子的DNA依賴性RNA聚合酶含量巨大，可以保證shRNA最大量地被轉錄。這兩種啟動子也可以根據需要更換為其他高效的啟動子，如7SK和CMV等,而不影響其表達。本發明提出的重組質粒中PB-EN3D2B中，還可含有EGFP與新黴素抗性(Neo-R)兩個報告基因，這兩個報告基因外端還分別克隆了一個IoxP位點(如圖2)。該質粒既可以直接轉染細胞使其獲得抑制口蹄疫病毒感染的能力，也可以藉助PB轉座子導入細胞基因組構建抗口蹄疫轉基因細胞系和動物。通過對報告基因的組合進行調整，可衍生出類似的抗口蹄疫重組質粒，記為PB-N3D2B，(如圖3)。通過Ascl/Hindlll酶切還可以將含有兩種shRNA表達元件和報告基因的片段整個切離，方便地裝載入其他載體，以適應不同的短效(如腺病毒載體)和長效(如轉基因)的傳遞方式。本發明選取了 FMDV基因組中高度保守的區段作為靶序列，構建能同時表達兩種shRNA的轉基因質粒載體。再用轉基因技術將上述質粒轉入細胞，或小鼠或豬、牛、羊偶蹄類 哺乳動物，使可傳代細胞和轉基因傳代動物產生抗FMDV感染能力。具體說來，
本發明的重組質粒可轉入哺乳動物細胞系，使該轉基因細胞系抵抗FMDV感染。本發明的重組質粒可轉入小鼠或豬、牛、羊偶蹄類哺乳動物，使轉基因動物後代抵抗FMDV感染，提高抗病能力。本發明為RNAi技術用於豬、牛、羊等家畜的抗病育種，培養轉基因的抗口蹄疫病毒感染的家畜提供新的技術路線。具體實驗表明，本發明的重組質粒適用於多種轉基因技術。當使用PB轉座子系統將該質粒轉入體外培養的豬細胞IBRS-2後，經攻毒實驗證明，篩選得到的轉基因細胞系具有抵抗20-50 TCID50劑量0型或亞洲I型FMDV毒株感染的能力。當將該質粒通過顯微注射導入小鼠受精卵後，篩選得到的轉基因小鼠家系使用3-6 LD50 0型FMDV毒株感染時，相對同窩小鼠對照明顯提高了存活率。


圖I為口蹄疫病毒基因組結構。箭頭所指為2B與3D基因shRNA靶點。圖2為PB-EN3D2B質粒雙串聯shRNA基因和報告基因排列圖示。3D shRNA基因和2B shRNA基因在質粒上呈串聯排列，兩個shRNA基因中間是兩個報告基因EGFP和Neo_R。圖3 為 PB-EN3D2B (A)與其衍生質粒 PB-N3D2B (B)。圖4為轉基因細胞系20 TCID50 0型口蹄疫病毒攻毒上清病毒滴度檢測。圖5為轉基因細胞系50 TCID50 0型口蹄疫病毒攻毒上清病毒滴度檢測。圖6為轉基因細胞系20 TCID50 Asia I型口蹄疫病毒攻毒上清病毒滴度檢測。
具體實施例方式實施例I 將質粒PB-EN3D2B與表達PB轉座酶的輔助質粒CMV-PBase按I: I的質量比共同轉染豬細胞IBRS-2，篩選單克隆轉基因細胞系，命名為IB32。篩選得到的細胞系進行攻毒實驗，攻毒劑量分別為20 TCID50 0型口蹄疫病毒，50 TCID50 0型口蹄疫病毒和20 TCID50 Asia I型口蹄疫病毒。攻毒結果表明，IB32-6細胞系在三次攻毒實驗中均未發生任何病變，細胞上清液中也檢測不到任何病毒滴度。IB32-2和IB32-3兩株轉基因細胞系也體現了顯著的抗病毒效果，24小時幾乎檢測不到病變，48小時的病變狀況也比同時期的對照細胞要輕微。這證明由TO-EN3D2B得到的轉基因細胞系具有抵抗20-50 TCID5tl、兩型口蹄疫病毒的能力。攻毒實驗上清病毒滴度檢測見圖4、5、6。實施例2 PB-EN3D2B的衍生質粒，PB-N3D2B，其Ascl/Hindlll酶切片段回收後通過顯微注射的方式導入小鼠基因組，培育轉基因小鼠家系。單倍體轉基因雄鼠與普通母鼠交配，所生具有約50%轉基因比例的後代用於攻毒實驗。分別統計轉基因乳鼠與非轉基因同窩對照的存活率。見表I :
權利要求
1.一種能抑制口蹄疫病毒的轉基因重組質粒，其特徵在於，該質粒含有兩個shRNA表達基因，能同時編碼兩種分別靶向口蹄疫病毒基因組3D RNA聚合酶和2B非結構蛋白保守區域的特異shRNA ;其中，所述兩個shRNA表達基因中一個能表達抗口蹄疫病毒的shRNA，該shRNA靶向口蹄疫病毒基因組中3D基因；所述兩個shRNA表達基因中一個能表達抗口蹄疫病毒的shRNA，該shRNA靶向口蹄疫病毒基因組中2B基因；兩個shRNA表達基因呈串聯狀態。
2.根據權利要求I所述的能抑制口蹄疫病毒的轉基因重組質粒，其特徵在於，在所述兩個shRNA表達基因之間插入有報告基因。
3.根據權利要求2所述的能抑制口蹄疫病毒的轉基因重組質粒，其特徵在於，所述報告基因為EGFP與新黴素抗性(Neo-R)，這兩個報告基因外端分別克隆了一個IoxP位點。
4.根據權利要求I所述的能抑制口蹄疫病毒的轉基因重組質粒，其特徵在於，所選擇的保守區基因3D和2B來自任何一型的口蹄疫病毒，包括0型、A型、亞洲I型。
5.如權利要求I或2所述的重組質粒在轉基因育種中的應用。
6.如權利要求5所述的應用，其特徵在於將權利要求I或2所述的重組質粒轉入哺乳動物細胞系，使該轉基因細胞系抵抗FMDV感染。
7.如權利要求5所述的應用，其特徵在於將如權利要求I或2所述的重組質粒轉入小鼠或豬、牛、羊偶蹄類哺乳動物，使轉基因動物後代抵抗FMDV感染，提高抗病能力。
全文摘要
本發明屬於遺傳工程技術領域，具體為一種能抑制口蹄疫病毒的轉基因重組質粒及其應用。該質粒含有兩個shRNA表達基因，能同時編碼兩種分別靶向口蹄疫病毒基因組3DRNA聚合酶和2B非結構蛋白保守區域的特異shRNA；兩個shRNA表達基因呈串聯狀態。該質粒適用於多種轉基因技術。當使用PB轉座子系統將該質粒轉入體外培養的豬細胞IBRS-2後，經攻毒實驗證明，篩選得到的轉基因細胞系具有抵抗20-50TCID50劑量O型或亞洲Ⅰ型FMDV毒株感染的能力。當將該質粒通過顯微注射導入小鼠受精卵後，篩選得到的轉基因小鼠家系使用3-6LD50O型FMDV毒株感染時，相對同窩小鼠對照明顯提高了存活率。
文檔編號C12N15/85GK102703504SQ20121022335
公開日2012年10月3日 申請日期2012年7月2日 優先權日2012年7月2日
發明者嚴維耀, 劉明秋, 曾溢滔, 焦曄, 鄭兆鑫 申請人:復旦大學